葛根提取物薄層鑒別與含量測定

陳炎歡，馮華業(yè)，黃照榮，江志鵬，黃綺敏

（無限極（中國）有限公司，廣東江門 529100）

葛根提取物是由豆科植物野葛[Pueraria lobata（Willd.）Ohwi]的干燥根提取制得，具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽止瀉、通經(jīng)活絡(luò)及解酒毒等作用，是藥食兩用的天然植物資源。葛根提取物作為市場暢銷的中藥提取物之一，制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其在中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有非常重要的意義[1-5]。本文主要對(duì)葛根提取物中的葛根素進(jìn)行薄層色譜法（Thin Layer Chromatography，TLC）和高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）鑒別和含量測定，為制定葛根提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

葛根提取物，由無限極（中國）有限公司提供；葛根素對(duì)照品，批號(hào)：201816，購自中國食品藥品檢定研究院；高效硅膠G薄層板，分別購自德國Merck和青島海洋化工有限公司；甲醇、三氯甲烷，分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器

ThermoFisher UltiMate 3000高效液相色譜儀，帶二極管陣列檢測器（Diode Array Detector，DAD）；瑞士Mettler XPR2型百萬分之一電子天平；Fisherbrand FB11209型超聲波清洗儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 薄層色譜鑒別

（1）對(duì)照品溶液配制。取葛根對(duì)照藥材0.8 g，置于錐形瓶中，加入甲醇6 mL，超聲（250 W，40 Hz）處理30 min，濾過，取續(xù)濾液，即得對(duì)照藥材溶液。

（2）供試品溶液配制。取本品粉末約0.1 g，置于錐形瓶中，加入甲醇10 mL，超聲（250 W，40 Hz）處理30 min，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取葛根素對(duì)照品適量，加甲醇制成1 mL含1 mg的溶液，作為供試品溶液。

（3）薄層色譜測定。按照薄層色譜法（中國藥典2020年版通則0502）試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各 5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠板上，以三氯甲烷-甲醇-水（7.00∶2.50∶0.25）為展開劑，取出晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

1.3.2 含量測定

（1）色譜條件。色譜柱：C18色譜柱（150 mm或250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（25∶75，體積比）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；波長：250 nm；進(jìn)樣量：10 μL；理論塔板數(shù)按葛根素計(jì)不低于4000。葛根素與其他組分能得到很好的分離，且出峰時(shí)間適宜，峰形良好。

（2）對(duì)照品溶液制備。精密稱取葛根素對(duì)照品12.5 mg于100 mL容量瓶，加入30%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，得到125 μg/mL葛根素對(duì)照品儲(chǔ)備液。

（3）供試品溶液制備。精確稱取粉碎均勻的葛根提取物樣品約0.1 g，置100 mL容量瓶中，加入30%乙醇約80 mL，超聲（250 W，40 Hz）處理30 min，取出，冷卻后定容至刻度，搖勻。取上清液1 mL至5 mL容量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，即為稀釋5倍的測試液。取適量樣液過0.45 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液后供液相色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層色譜鑒別

取葛根對(duì)照藥材、葛根素、葛根提取物進(jìn)行測試。由圖1可知，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，Rf值在0.3～0.7，符合薄層鑒別要求。

圖1 對(duì)照品及葛根提取物薄層圖

2.2 線性關(guān)系考察

精密稱取葛根素對(duì)照品13.10 mg于100 mL容量瓶，加入30%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，得到124.97 μg/mL葛根素對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取葛根素對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、 4.0 mL及5.0 mL分別置10 mL容量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，在規(guī)定色譜條件下進(jìn)行色譜分析，測定峰面積。以葛根素對(duì)照品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，平均峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），求出線性回歸程為Y=0.7675X+0.0498，R2=0.9996。結(jié)果表明葛根素在6.25～62.49 μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖2 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取葛根素對(duì)照品溶液（濃度37.49 μg/mL）10 μL進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣6次，分別計(jì)算峰面積及保留時(shí)間的RSD值，保留時(shí)間和峰面積的RSD值分別為0.57%和0.28%。理論塔板數(shù)以葛根素計(jì)約6000，表明儀器精密度良好，結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取葛根提取物按上述色譜條件分別于0 h、2 h、4 h、6 h、12 h及24 h測定，結(jié)果見表2，供試品中葛根素峰面積的RSD為0.22%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取葛根提取物同一天內(nèi)按上述色譜條件測定，結(jié)果見表3。葛根素平均含量為15.67%，RSD為0.56%，分離度大于1.5。表明該方法重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 回收率試驗(yàn)

取葛根提取物（葛根素含量為15.67%）精密稱定約0.05 g于9個(gè)100 mL小燒杯中。另取葛根素對(duì)照 品（純 度95.4%）165.493 mg置100 mL容 量 瓶中，加30%乙醇溶解并定容（此對(duì)照品溶液含葛根素 1.5788 g/mL），分別吸取該對(duì)照品溶液2.5 mL（以葛根素計(jì)3.9470 mg）、5.0 mL（以葛根素計(jì)7.8940 mg）、 7.5 mL（以葛根素計(jì)11.8410 mg），分3組加入含樣品的9個(gè)100 mL容量瓶中，按色譜條件測定，計(jì)算葛根素的回收率，回收率數(shù)據(jù)分別為99.39%、103.90%、101.79%、102.56%、103.99%、103.83%、102.12%、104.63%及102.84%，平 均 回 收 率 為102.78%（95%～105%），RSD值為1.55%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.7 樣品含量測定

分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶各10 μL，注入液相色譜儀，測定。根據(jù)所得對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖中葛根素峰面積計(jì)算供試品中待測組分葛根素含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品的含量測定結(jié)果（n=3）

3 結(jié)論與討論

葛根提取物經(jīng)過提取后，與葛根藥材在基質(zhì)上存在差別，本研究中的鑒別方法，與中國藥典中葛根藥材的供試品溶液制備方法略有不同，試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究方法滿足薄層鑒別的要求，可用于葛根提取物的鑒別。本研究方法穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性以及準(zhǔn)確度均符合方法學(xué)的要求，可用于葛根提取物葛根素含量的檢測