三維熒光結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)用于白術(shù)的產(chǎn)地溯源

陳 偉， 吳海龍*， 王 童*， 常月月， 陳 瑤， 楊 健，海燕， 楊小龍， 李旭富， 俞汝勤

1. 湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院， 化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖南 長沙 410082 2. 湖南工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院， 湖南省生物醫(yī)用納米材料與器件重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖南 株洲 412008 3. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心， 道地藥材國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地， 北京 100700 4. 中南民族大學(xué)藥學(xué)院， 湖北省民族藥物現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心， 湖北 武漢 430074 5. 北京同仁堂平江白術(shù)有限公司， 湖南 平江 414500

引 言

近些年來， 中醫(yī)藥憑借其毒副作用小， 對某些疾病有著極佳的療效以及環(huán)境友好等特點(diǎn)， 受到了越來越多國家的關(guān)注。 目前， 已有多個國家創(chuàng)辦了中醫(yī)藥研究機(jī)構(gòu)和中醫(yī)診所。 世界衛(wèi)生組織在《迎接21世紀(jì)的挑戰(zhàn)》報(bào)告中指出： “21世紀(jì)的醫(yī)學(xué)不應(yīng)該繼續(xù)以疾病為主要研究領(lǐng)域， 而應(yīng)當(dāng)以人類的健康作為醫(yī)學(xué)的主要研究方向[1]”。 更讓中醫(yī)藥變成了熱門話題， 也為中醫(yī)藥的發(fā)展提供了千載難逢的機(jī)遇。 然而目前中醫(yī)藥還存在許多問題。 道地藥材作為中藥材品質(zhì)的標(biāo)桿， 憑借其優(yōu)良的品質(zhì)和顯著的療效被廣泛應(yīng)用。 《神農(nóng)本草經(jīng)》記載“土地所出， 真?zhèn)涡玛悾?并各有法”， 闡述了道地藥材品質(zhì)與地理?xiàng)l件的差異[2]。 由于目前中藥材產(chǎn)地的多元化， 不同產(chǎn)地有著不同的栽培條件和不同的加工工藝， 直接導(dǎo)致了中藥材產(chǎn)品中有效成分含量的差異， 導(dǎo)致市場上中藥材產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。 更為棘手的是， 不同產(chǎn)地的藥材在加工成成品后， 其外觀較為相似， 很難通過外觀分辨其品質(zhì)的優(yōu)劣， 更無法準(zhǔn)確分辨其產(chǎn)地。 為了更好地推動中醫(yī)藥的發(fā)展， 對道地藥材進(jìn)行地理溯源非常重要。

白術(shù)(學(xué)名：AtractylodesmacrocephalaKoidz. 縮寫AM)， 著名中藥材， 素有“北參南術(shù)”的美譽(yù)。 本品來源為菊科蒼術(shù)屬植物白術(shù)的干燥根莖。 白術(shù)的化學(xué)成分主要為揮發(fā)油、 苷、 糖、 黃酮、 聚乙炔及甾醇等物質(zhì)。 目前白術(shù)已被證明具有多種藥理活性， 其中包括： 改善胃腸道功能[3]、 抗腫瘤[4]、 性腺激素調(diào)節(jié)[5]、 免疫調(diào)節(jié)[6]等。 白術(shù)產(chǎn)地主要分布在中國的浙江、 湖南、 安徽及河北等地， 自古以浙江為道地產(chǎn)區(qū)， 目前以安徽、 浙江和湖南等產(chǎn)地為主[7]。 白術(shù)質(zhì)量有明顯的地域性差異， 生長環(huán)境， 土質(zhì)以及氣候?qū)ζ淦焚|(zhì)、 性狀和藥效影響非常大， 張龍開等在對白術(shù)的研究中已證實(shí)不同地區(qū)白術(shù)的化學(xué)組分及含量有著非常顯著的差異[8]。

目前， 已報(bào)道的白術(shù)產(chǎn)地溯源方法有Hu等利用穩(wěn)定同位素比值法和多元素分析法， 通過測定分析不同地區(qū)白術(shù)所含元素含量的差異進(jìn)行地理溯源[9]。 上述方法在樣本預(yù)處理時(shí)需要消耗大量時(shí)間進(jìn)行消解， 且儀器操作流程繁瑣。 因此， 亟需發(fā)展一種快速精準(zhǔn)的白術(shù)產(chǎn)地溯源方法。 與上述方法相比， 熒光法具有檢測速度快、 靈敏度高、 儀器設(shè)備易操作、 能用于在線監(jiān)測、 樣本預(yù)處理簡單和成本較低等優(yōu)點(diǎn)。 特別是三維熒光(EEM)技術(shù)能夠快速提供復(fù)雜體系詳細(xì)的光譜信息， 大大提高了熒光技術(shù)的分析潛力。 EEM與化學(xué)計(jì)量學(xué)方法相結(jié)合， 作為一種強(qiáng)有力的分析策略， 已成功運(yùn)用于食用油[10]和茶葉[11]等食品的品質(zhì)分類和真?zhèn)舞b別。 本工作采用EEM結(jié)合偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和k最鄰近法(kNN)兩種模式識別方法對白術(shù)樣品進(jìn)行產(chǎn)地溯源。 首先使用交替三線性分解算法(ATLD)對白術(shù)的三維熒光譜圖進(jìn)行解析， 對不同產(chǎn)地白術(shù)的內(nèi)源熒光成分進(jìn)行初步分析； 之后使用PLS-DA和kNN對白術(shù)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分類， 通過交叉驗(yàn)證優(yōu)化分類模型的復(fù)雜度參數(shù)； 最后使用該模型對測試集和預(yù)測集樣本進(jìn)行預(yù)測， 以此驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 白術(shù)樣品采集

使用的白術(shù)樣品均為2020年11月實(shí)地采集， 前后時(shí)間不超過5 d， 以嚴(yán)格控制采摘時(shí)間的一致性， 消除白術(shù)樣品因采摘季節(jié)年份不同而引起的差異。 實(shí)地采集樣品共125份，其中產(chǎn)自安徽省45份、 湖南省45份， 浙江省35份， 采樣地點(diǎn)和采樣條件見圖1和表1。 使用隨機(jī)采樣算法， 將不同產(chǎn)地白術(shù)樣本分成訓(xùn)練集(總樣本的四分之三， 95個)和測試集(剩余的四分之一樣本， 30個)。 另采集10個浙江白術(shù)樣本作為預(yù)測集。

圖1 本工作中的白術(shù)采樣點(diǎn)

表1 白術(shù)采樣時(shí)的地理和天氣條件以及樣本數(shù)(不包括預(yù)測集樣本)

鮮白術(shù)的處理步驟： 將白術(shù)從土壤挖出后， 除去地上莖葉， 保留地下根莖并去除表面的泥土， 放入烘箱內(nèi)， 每次放同一產(chǎn)地的白術(shù)。 第一次烘炕時(shí)， 溫度為60～70 ℃， 烘炕2～3 h后上下翻動一遍， 使須根干透脫落。 將除去須根的白術(shù)取出放到晾曬架上， 使其內(nèi)部水分外溢， 外皮軟化。 24 h后， 進(jìn)行復(fù)炕， 在60 ℃下烘炕24 h， 然后再次放到晾曬架上晾1 d， 使其內(nèi)部水分充分向外滲出， 再將返潤的白術(shù)烘烤24 h。 重復(fù)烘烤晾曬， 直到白術(shù)表面不再有水分滲出， 通常一般需要反復(fù)烘炕三次。 將烘干后的白術(shù)樣品放入中藥超細(xì)研磨機(jī)研成粉末， 再用80目的分樣篩進(jìn)行篩分， 將篩分后的粉末和殘?jiān)謩e用塑封袋裝好并標(biāo)記相應(yīng)名稱備用。

1.2 萃取條件的優(yōu)化和萃取步驟

選用有機(jī)試劑作為萃取劑萃取白術(shù)所含的有效成分。 以《中國藥典》中白術(shù)樣品提取液的制備方法為基礎(chǔ)， 對萃取溶劑、 溶劑的配比和超聲時(shí)間三個萃取條件進(jìn)行了優(yōu)化。

優(yōu)化步驟： 首先， 選用甲醇和乙醇兩種試劑作為萃取劑， 并用超純水稀釋， 分別配制體積分?jǐn)?shù)為100%， 80%， 60%， 40%， 20%和0%的甲醇/乙醇水溶液進(jìn)行萃取， 離心、 過濾后取上清液進(jìn)行熒光掃描得到EEM譜圖。 為了直觀地比較萃取條件的優(yōu)劣， 從白術(shù)的熒光譜圖中選取了兩個熒光信號峰(激發(fā)/發(fā)射波長為280/355 nm和激發(fā)/發(fā)射波長為355/430 nm)進(jìn)行跟蹤分析。 結(jié)果如圖2所示， 由圖2(a)和(b)可以看出， 甲醇和乙醇萃取白術(shù)樣品的熒光強(qiáng)度非常接近， 無明顯差異。 由于甲醇對人體的神經(jīng)系統(tǒng)和血液系統(tǒng)有一定的毒害作用且甲醇價(jià)格比乙醇貴。 綜合考慮， 選擇乙醇(綠色溶劑)作為萃取劑。 然后對不同體積比的萃取劑進(jìn)行分析， 其中280/355 nm熒光峰在20%的乙醇水溶液中熒光最強(qiáng)， 355/430 nm熒光峰在40%乙醇水溶液中熒光最強(qiáng)， 考慮到不同產(chǎn)地白術(shù)的280/355 nm熒光峰信號值可能存在的差異， 若信號值高于10000儀器將無法檢測， 選擇體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇水溶液作為萃取劑。 最后， 對超聲萃取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。 從圖2(c)可以看出， 兩個熒光峰的強(qiáng)度均不隨萃取時(shí)間的延長而發(fā)生明顯變化。 在不影響萃取結(jié)果的情況下， 為了縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間， 最終選擇萃取時(shí)間為5 min。

圖2 (a)激發(fā)/發(fā)射波長為280/355 nm的熒光強(qiáng)度與萃取劑種類和萃取劑比例的關(guān)系； (b)激發(fā)/發(fā)射波長為355/430 nm的熒光強(qiáng)度與萃取劑種類和萃取劑比例的關(guān)系； (c)熒光強(qiáng)度隨超聲時(shí)間的變化

白術(shù)最終的萃取步驟如下： 準(zhǔn)確稱取400 mg的白術(shù)粉末樣品于10 mL離心管中， 加入8 mL體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇水溶液， 放入超聲機(jī)中超聲5 min后， 在4 000 r·min-1、 4 ℃的條件下離心10 min， 將上層清液用0.45 μm微孔濾膜過濾待用。 在EEM測量前， 將已過濾好的上清液用40%的乙醇水溶液稀釋10倍再進(jìn)行熒光掃描。

1.3 藥品與試劑

本工作所使用的藥品與試劑如下。 藥品列表及詳細(xì)信息見表2。

續(xù)表2

續(xù)表2

試劑： 甲醇和乙醇(均為色譜純)購買自Sigma-Aldrich(圣路易斯， 美國)； 超純水(18.20 MΩ·cm)由Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore， 美國)生產(chǎn)。

1.4 偏最小二乘判別分析(PLS-DA)

偏最小二乘判別分析(PLS-DA)是一種線性分類方法， 將偏最小二乘回歸算法用于分類判別， 詳見文獻(xiàn)[12]。

1.5 k最鄰近法(kNN)

k最鄰近法(kNN)是一種經(jīng)典的有監(jiān)督非線性分類算法， 根據(jù)樣本周圍最近k個樣本的最大類別概率來判斷樣本的歸屬類型， 具體實(shí)現(xiàn)步驟如下： (1)計(jì)算測試樣本數(shù)據(jù)與各訓(xùn)練樣本數(shù)據(jù)之間的歐氏距離； (2)將獲得的距離值從大到小進(jìn)行排序； (3)選擇距離值最接近的k個訓(xùn)練樣本并記錄其分類， 通過留一交叉驗(yàn)證法選擇最優(yōu)的k值； (4)統(tǒng)計(jì)前k個點(diǎn)所在類別出現(xiàn)的頻率； (5)返回前k個點(diǎn)出現(xiàn)頻率最高的類別作為當(dāng)前點(diǎn)的預(yù)測分類。

1.6 交替三線性分解算法(ATLD)

交替三線性算法(ATLD)于1996年由吳海龍等提出， 是一種高效的“數(shù)學(xué)分離”算法， 可對三線性數(shù)陣進(jìn)行解析， 并提供有明確物理化學(xué)意義的解析結(jié)果， 基于所獲得的各組分輪廓矩陣可進(jìn)行更深入的定性和定量分析[13]。 ATLD與傳統(tǒng)平行因子分析(PARAFAC)相比， 所需內(nèi)存大大減少， 運(yùn)算的效率極大提高， 是現(xiàn)存迭代三維校正算法中收斂速度最快的一種算法。 詳情見文獻(xiàn)[14]。

1.7 儀器條件和軟件

實(shí)驗(yàn)所有白術(shù)樣品的EEM測量均在一臺裝配了150 W氙燈的F-7000熒光光譜儀(日立， 日本)上進(jìn)行， 并連接一臺電腦用于讀取數(shù)據(jù)， 測量時(shí)配合使用10 mm的石英比色皿。 儀器相關(guān)參數(shù)： 激發(fā)波長范圍為200～600 nm(步長5 nm)； 發(fā)射波長范圍為200～650 nm(步長5nm)； 掃描速度為30 000 nm·min-1； 檢測電壓為650 V； 狹縫寬度為5.0 nm。 數(shù)據(jù)均保存為.txt格式。 本工作所有的數(shù)據(jù)處理均在MATLAB環(huán)境下進(jìn)行， 使用classification-toolbox 5.1中的PLS-DA和kNN對樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 可從網(wǎng)址http://www.michem.unimib.it/download/matlab-toolboxes免費(fèi)獲取[12]。 PLS-DA方法的LVs(最佳潛變量數(shù))和kNN方法的k(鄰近樣本數(shù))均通過留一交叉驗(yàn)證所獲得的最佳分類準(zhǔn)確率(CCR)來確定。 在CCR相同的情況下， 優(yōu)先選擇最小的LVs和k值。 CCR可被視為總體精準(zhǔn)度， 通過式(1)計(jì)算

(1)

式(1)中，ngg為原本屬于第g類的樣本被正確分到第g類的樣本數(shù)量；N為總樣本數(shù)；G為總類別數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 白術(shù)樣本的熒光光譜

各樣本原始的EEM數(shù)據(jù)是在激發(fā)波長范圍為200～600 nm， 發(fā)射波長范圍為200～650 nm下采集的。 為了簡化運(yùn)算并消除無用信息， 選擇一個包含白術(shù)樣本主要熒光特征的較小熒光區(qū)域用于后續(xù)分析。 該區(qū)域的激發(fā)波長范圍為200～560 nm， 發(fā)射波長范圍為200～620 nm， 每一個矩陣數(shù)據(jù)的大小為73×85(激發(fā)波長數(shù)×發(fā)射波長數(shù))。 由于EEM光譜中存在嚴(yán)重影響數(shù)據(jù)三線性結(jié)構(gòu)的瑞利散射和拉曼散射， 因此必須對其進(jìn)行預(yù)處理。 每個樣本矩陣都減去三個空白樣本(體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇水溶液)矩陣數(shù)據(jù)的平均值， 以此來消除輕微的拉曼散射， 瑞利散射通過Bro等提出的插值法[15]來消除。 該算法首先直接把散射區(qū)域扣除， 然后再通過插值法擬合缺失數(shù)據(jù)， 如圖3(a,b,c)所示。

圖3 插值法消除EEM數(shù)據(jù)中瑞利散射

圖4(a,b,c)分別為預(yù)處理過后不同地區(qū)白術(shù)的典型EEM譜圖， 從圖4中可以看出不同地區(qū)的白術(shù)EEM譜圖存在一定的相似性和差異性。 例如在激發(fā)/發(fā)射波長355/450 nm處都存在一個強(qiáng)熒光峰。 安徽白術(shù)樣本在激發(fā)/發(fā)射波長275/370 nm附近有一個信號比較強(qiáng)的熒光峰， 而浙江白術(shù)樣本該處信號較弱， 湖南白術(shù)樣本在該處幾乎沒產(chǎn)生熒光信號， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映出不同地區(qū)白術(shù)的內(nèi)源熒光成分和微環(huán)境有所差異。 不同產(chǎn)地白術(shù)EEM譜圖的強(qiáng)度、 形狀和位置的差異性和相似性為隨后采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法分類提供一定的可能和挑戰(zhàn)。

圖4 扣除散射后不同地區(qū)白術(shù)樣品典型EEM等高線圖

2.2 基于ATLD算法對白術(shù)熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行表征

首先， 將135個白術(shù)樣本熒光數(shù)陣沿著樣本維方向進(jìn)行堆疊， 得到一個大小為73×85×135(激發(fā)波長數(shù)×發(fā)射波長數(shù)×樣本數(shù))的三維數(shù)陣， 再采用ATLD算法對三維數(shù)陣進(jìn)行分解。 在ATLD分解之前， 通過核一致性診斷算法(CORCONDIA)[16]對其組分?jǐn)?shù)(N)進(jìn)行估計(jì)， 當(dāng)CORCONDIA結(jié)果大于60%時(shí)， 可認(rèn)為模型符合三線性。 最終確定組分?jǐn)?shù)N=3， 此時(shí)ATLD解析三維數(shù)陣得到的結(jié)果如圖5所示。 圖5(a, b, c)分別為歸一化激發(fā)光譜圖， 歸一化發(fā)射光譜圖和相對濃度圖。 從圖5(a,b)分別可以看出： 組分1(藍(lán)色)的激發(fā)/發(fā)射波長為365/440 nm； 組分2(綠色)的激發(fā)/發(fā)射波長為405/470 nm； 組分3(紅色)的激發(fā)/發(fā)射波長為280/360 nm， 其在激發(fā)波長225 nm和發(fā)射波長450 nm處各存在一個明顯的肩峰。 值得注意的是， 這里所指的“組分”可能并不代表具體某一種物質(zhì)， 而通常是某一類熒光信號接近的物質(zhì)(共因子)。 為了更加準(zhǔn)確直觀地分析三組分各代表的物質(zhì)， 對白術(shù)中可能含有的17種物質(zhì)進(jìn)行了三維熒光掃描， 隨后對有明顯熒光信號的七種內(nèi)源熒光物質(zhì)進(jìn)行分析， 得到的歸一化激發(fā)光譜圖6(a)和歸一化發(fā)射光譜圖6(b)， 如圖6所示。 通過比較分析圖5和圖6各組分的激發(fā)/發(fā)射波長， 考慮白術(shù)復(fù)雜的內(nèi)源環(huán)境， 做出以下推測： 組分1所代表的物質(zhì)可能為7-羥基香豆素和東莨菪內(nèi)酯； 組分3所代表的物質(zhì)可能為紫丁香苷、 原兒茶酸和蒼術(shù)酮； 組分2無對應(yīng)物質(zhì)， 暫定為未知物質(zhì)。 由圖5(c)可看出不同產(chǎn)地白術(shù)所含三組分濃度的差異， 其中組分1在安徽、 湖南和浙江白術(shù)中含量無明顯差異， 組分2含量在安徽、 湖南和浙江白術(shù)中呈上升趨勢， 組分3在安徽白術(shù)中含量最高， 在湖南和浙江白術(shù)中含量較低。 通過分析各組分所可能代表的物質(zhì)以及各組分在不同產(chǎn)地白術(shù)的含量差異， 可以看出不同產(chǎn)地白術(shù)的熒光數(shù)據(jù)存在一定的差異， 為其產(chǎn)地溯源提供了依據(jù)。

圖5 N=3時(shí)ATLD解析三維矩陣獲得的歸一化激發(fā)光譜圖(a)、 歸一化發(fā)射光譜圖(b)和相對濃度圖(c)

圖6 白術(shù)中可能含有的7種具有熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的歸一化激發(fā)光譜圖(a)和歸一化發(fā)射光譜圖(b)

2.3 白術(shù)產(chǎn)地分類

使用PLS-DA和kNN兩種模式識別方法對不同產(chǎn)地的白術(shù)進(jìn)行分類。 首先通過交叉驗(yàn)證來優(yōu)化PLS-DA的LVs以及kNN的k值。 根據(jù)交叉驗(yàn)證的結(jié)果， 最終確定PLS-DA的LVs為10，kNN的k值為2(見表3)。 表3列出交叉驗(yàn)證模型中兩種方法獲得的分類準(zhǔn)確率(CCR%)， 其中PLS-DA的CCR為91%，kNN的CCR為88%。 為了更好地評估分類性能， 表3給出了特異性和靈敏度兩種品質(zhì)因子參數(shù)， 特異性表示模型拒絕所有其他類別樣本的能力， 靈敏度表示模型正確識別該類樣本的能力。 PLS-DA在交叉驗(yàn)證中對于各類別獲得的特異性、 靈敏度分別在92%～98%和81%～97%范圍內(nèi)， 而kNN分別為93%～95%和85%～91%， 這意味著兩個分類模型均能比較有效地識別該類樣本并拒絕他類樣本。 同時(shí)， 使用以上兩種方法驗(yàn)證了訓(xùn)練集樣本的類別， 所得分類結(jié)果如表3所示。 其中PLS-DA方法的CCR為100%， 且其特異性、 靈敏度都為100%， 能完全準(zhǔn)確地對訓(xùn)練集的樣本歸類。 而kNN方法的CCR為88%， 稍遜于PLS-DA的結(jié)果。 可以明顯看出， 無論是特異性還是靈敏度， 安徽白術(shù)的檢測結(jié)果都略大于湖南白術(shù)和浙江白術(shù)。 另外， 可以通過PLS-DA解析訓(xùn)練集時(shí)前3個潛變量的得分值所作出的三維散點(diǎn)圖可更直觀地比較分類結(jié)果， 如圖7所示。 從圖7可以看出， 安徽、 湖南和浙江白術(shù)在三維空間中被大致的區(qū)分開來， 其中安徽白術(shù)明顯與湖南和浙江白術(shù)區(qū)分開， 而湖南白術(shù)和浙江白術(shù)有少量重疊， 很好地解釋了安徽白術(shù)的分類結(jié)果略大于湖南和浙江白術(shù)的原因， 也說明了為什么在表4(支持信息)混淆矩陣中， 湖南白術(shù)和浙江白術(shù)都有少量被相互誤分。 用上述已驗(yàn)證的白術(shù)分類模型來對測試集樣本進(jìn)行預(yù)測， 結(jié)果如表3所示。 其中對于測試集， PLS-DA的CCR為87%， 而kNN的CCR僅為73%。 從整體來看， 兩種分類方法均獲得較高的分類準(zhǔn)確率， 其中PLS-DA最令人滿意， 交叉驗(yàn)證、 訓(xùn)練集和測試集獲得CCR都比kNN高， 且結(jié)果比較穩(wěn)定。

表3 PLS-DA和kNN兩種分類模型的復(fù)雜度參數(shù)(LVs/k)， 交叉驗(yàn)證、 訓(xùn)練集、 測試集和預(yù)測集獲得的分類準(zhǔn)確率、 特異性和靈敏度

表4列出了訓(xùn)練集和測試集中兩種分類方法所獲得的混淆矩陣， 從表4可以非常直觀地看出兩種模型對樣本的分類結(jié)果。 其中， PLS-DA分類方法在訓(xùn)練集和測試集都能100%正確地對安徽白術(shù)進(jìn)行分類， 而對湖南和浙江白術(shù)， 無論是PLS-DA還是kNN， 都不能對其進(jìn)行100%正確的歸類， 而絕大多數(shù)樣本都被正確地歸類。 總之由于白術(shù)內(nèi)源熒光物質(zhì)的多樣性和體系的復(fù)雜性， 再加之熒光光譜有著較大的重疊部分， 因此獲得以上分類結(jié)果還是非常理想的。

圖7 根據(jù)PLS-DA前3個潛變量的得分值所作的訓(xùn)練樣本三維散點(diǎn)圖

表4 白術(shù)分類模型中PLS-DA和kNN分類方法獲得的訓(xùn)練集、 測試集和預(yù)測集的混淆矩陣

2.4 新樣本測試

為了更好地檢驗(yàn)兩種模型對白術(shù)樣本的正確分類能力， 證明本模型能對白術(shù)道地藥材進(jìn)行產(chǎn)地溯源， 從浙江省金華市磐安縣和臺州市天臺縣共采集10個新的浙白術(shù)藥材樣本， 并使用所建立的兩個模型對其進(jìn)行預(yù)測， 預(yù)測結(jié)果如表3和表4所示。 其中PLS-DA的CCR為80%， 只有兩個樣本被錯誤分類，kNN的CCR為90%， 只有一個樣本被錯誤分類到湖南。 結(jié)果表明， 兩種模型即使在面對未知的白術(shù)樣本時(shí)， 仍能有效地識別該樣本并正確對其產(chǎn)地進(jìn)行預(yù)測。 進(jìn)一步驗(yàn)證了本工作所提方法的可行性與可靠性， 證明本方法能有效地對白術(shù)進(jìn)行產(chǎn)地溯源。

3 結(jié) 論

采用三維熒光與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合對不同產(chǎn)地白術(shù)樣本進(jìn)行熒光光譜表征和產(chǎn)地溯源。 首先優(yōu)化并選擇40%(v/v)的乙醇水溶液為萃取劑， 獲得白術(shù)樣本的EEM譜圖， 并使用交替三線性分解(ATLD)對白術(shù)三維熒光光譜進(jìn)行表征， 再結(jié)合兩種化學(xué)模式識別方法(PLS-DA和kNN)對獲得的熒光譜圖建立分類模型， 最后用已建立的分類模型對測試集和預(yù)測集進(jìn)行預(yù)測分類。 結(jié)果顯示， PLS-DA在交叉驗(yàn)證和預(yù)測集獲得的CCR分別為91%和80%，kNN在交叉驗(yàn)證和預(yù)測集獲得的CCR分別為88%和90%， 兩種分類方法均得到了滿意的結(jié)果。 上述結(jié)果表明， 采用EEM熒光光譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)策略相結(jié)合對不同產(chǎn)地白術(shù)進(jìn)行分類， 與傳統(tǒng)的產(chǎn)地溯源方法相比， 具有靈敏度高、 試劑消耗量小、 檢測速度快和儀器便攜等優(yōu)點(diǎn)。 本工作為白術(shù)的產(chǎn)地溯源提供了一個新穎有效的思路， 可快速判斷白術(shù)樣本是否屬于道地產(chǎn)區(qū)， 能有效地杜絕以次充優(yōu)現(xiàn)象， 有利于維護(hù)白術(shù)市場秩序和消費(fèi)者權(quán)益， 在藥材市場品質(zhì)檢測方面有著廣闊的應(yīng)用前景。