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    重金屬銅脅迫蘋果砧木根系的顯微拉曼光譜診斷研究

    2022-09-05 03:27:00李俊猛翟雪東楊子涵趙艷茹余克強
    光譜學與光譜分析 2022年9期
    關鍵詞:曼光譜拉曼砧木

    李俊猛, 翟雪東, 楊子涵, 趙艷茹, 2, 3, 余克強, 2, 3*

    1. 西北農林科技大學機械與電子工程學院, 陜西 楊凌 712100 2. 農業(yè)農村部農業(yè)物聯網重點實驗室, 陜西 楊凌 712100 3. 陜西省農業(yè)信息感知與智能服務重點實驗室, 陜西 楊凌 712100

    引 言

    重金屬污染對生態(tài)環(huán)境危害已引起廣泛關注[1]。 其中, 銅是最常見的重金屬污染元素, 也是最容易積累且不易降解的污染元素。 重金屬銅元素會破壞農作物的組織結構, 然而其內部結構人眼無法看見, 并且根系是重金屬脅迫農作物的直接對象, 易被植物根部吸收。 過量的銅離子一旦進入根細胞, 會改變代謝物水平, 進而影響農作物產量[2]。 因此亟須尋找一種對農作物體內重金屬快速、 準確的檢測方法, 有利于探明農作物的重金屬逆境脅迫響應機制。

    重金屬物質的傳統檢測方法主要是借助化學分析法來完成的, 如電化學方法和原子光譜法等[3], 這些方法雖然檢測靈敏度高, 但也存在所用化學試劑易形成二次污染, 難以大批量快速檢測等缺點。 拉曼光譜技術通常具有更高的選擇性, 提供了更窄的光譜帶, 能夠提供豐富和高分辨率的化學信息[4]。 目前, 一些學者采用拉曼光譜技術進行農作物中重金屬含量的檢測。 王海陽等[5]基于拉曼光譜技術評估香根草根內部鉛離子的含量, 其檢測模型的預測相關系數高于0.85, 其誤差小于5.7%, 結果表明拉曼光譜技術可用于測定植物根部重金屬的含量。 Tomas等[6]利用拉曼光譜技術比較了四種植物金屬硫蛋白亞型, 表達其鋅團簇和蛋白質構象的見解, 并做進一步分析得出, 拉曼光譜技術可以分析植物體內的金屬鹽和絡合物。 Barimah等[7]提出一種無標記的氧化亞銅/銀(Cu2O/Ag)表面增強拉曼散射(SERS)納米探針來檢測茶中的總砷含量, 開發(fā)的Cu2O/Ag耦合化學計量學SERS方法可用于有效地確定、 量化和預測茶葉中的砷含量。 雖然運用拉曼光譜技術監(jiān)測重金屬脅迫下農作物的響應已有一定成果, 但對于重金屬脅迫下蘋果砧木根系微觀診斷尚需要深入研究。

    蘋果砧木是蘋果樹生長(或改良)的基礎, 對控制樹體生長勢、 增強蘋果樹抗逆性及抗病能力、 擴大果樹品種適應范圍都具有重要意義。 本研究利用拉曼光譜技術進行蘋果砧木根系Cu2+的脅迫檢測, 可對蘋果砧木根系進行精準有效的治理提供方法依據, 進而提高蘋果樹幼苗的抗逆性以及幼苗存活率, 而且對農作物在重金屬污染評價和作物對重金屬脅迫的應答機制方面研究有重要指導意義。

    1 實驗部分

    1.1 樣本

    實驗所采用的蘋果砧木為“八棱海棠”(Malus×robusta(Carrire) Rehder)。 其具有與果樹嫁接親和力強, 對低平原、 濱海和內陸鹽堿地區(qū)有較強的適應能力等特性, 是一種優(yōu)良的蘋果砧木, 廣泛用于蘋果樹的嫁接。 八棱海棠播種于2020年11月底, 為防止重金屬的污染, 均在不含重金屬的有機質土壤中進行育苗。 在土壤中加入重金屬難免會由于攪拌不均等因素造成實驗誤差, 然而水培方法具有濃度均勻, 植物吸收快速, 條件單一等優(yōu)勢。 因此本實驗采用水培方法進行試驗。 2021年4月30日, 將蘋果砧木幼苗在清水里培育2周后進行重金屬銅的脅迫實驗, 在營養(yǎng)液中分別添加銅離子(Cu2+)含量為0, 6, 12, 18和24 mg·L-1的CuSO4·5H2O溶液, 每個梯度有6株幼苗, 共30株蘋果砧木進行本次實驗。 2021年5月13日將處理過的蘋果砧木置于晝夜溫度均為23 ℃、 相對濕度85%的植物培養(yǎng)箱中進行培育7 d, 7 d之后觀察各個濃度脅迫下的蘋果砧木并無明顯差異。

    1.2 拉曼光譜數據采集

    將不同銅離子濃度脅迫的蘋果砧木根系用振動切片機(ZQP-86, 上海之信儀器有限公司, 中國)沿橫截面進行切片, 將切好的樣本組織置于載玻片上以備拉曼光譜的采集。 拉曼光譜儀使用Thermo ScientificTMDXRTM3xi顯微拉曼光譜儀(DXR 3xi, 賽默飛世爾科技, 美國), 激光器選用波長為532 nm的固體激光器、 顯微鏡放大倍率10倍, 光譜儀具體參數和拉曼數據采集相關參數如表1所示。 將攜有樣本的載玻片置于載物臺, 聚焦并找到中心位置, 然后完成蘋果砧木根系的拉曼光譜數據采集。 對每個樣品分別進行光譜測試, 每類樣本蘋果砧木植株共6株, 每個橫截面積采集5條拉曼光譜, 共采集30組拉曼光譜, 5類樣本共獲得150條拉曼光譜曲線。

    表1 蘋果砧木根系采集拉曼光譜儀主要參數

    1.3 蘋果砧木根系拉曼光譜圖像采集

    通過對蘋果砧木根系橫截面區(qū)域掃描, 進行重金屬脅迫后根系橫截面組織組成和結構的變化研究。 圖1是蘋果砧木根系橫截面在放大倍率10倍下的白光圖, 共掃描1 015個點。 本實驗根據特征指紋峰進行蘋果砧木根系組織處單波段處的偽彩圖成像, 進而研究重金屬銅對蘋果砧木根系的影響。

    圖1 蘋果砧木根系顯微截面圖

    1.4 蘋果砧木根系拉曼光譜數據處理方法

    采集蘋果砧木根系拉曼光譜數據時會受到外界噪聲, 光線以及熒光背景信息的干擾, 影響拉曼光譜質量, 因此在進行拉曼光譜分析時需要對獲得的原始拉曼光譜數據進行預處理。 S-G平滑是一種較為簡單的數據處理方法, 通過平滑處理能夠有效地處理白噪聲, 處理在光譜測量中的一些由光學因素產生的影響[8]。 自適應迭代重加權懲罰最小二乘法(adaptive iterative reweighting partial least squares, Air-PLS)是基于PLS方法不斷優(yōu)化的一種數據處理的方法, 自動消除部分無用拉曼光譜峰并保留基線部分, 同時完成基線校正[9], 用此方法來扣除光譜的熒光等背景信號。

    偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)是一種被廣泛運用的多元數據判別方法[10], 可以應用于光譜化學分析中的類型判別和模式識別等方面。 PLS-DA計算過程是先對訓練集進行建模, 之后對預測數據進行預測, 通過對比實際值與預測值可以得到模型的準確率并能夠有效地解決多變量之間相關性的復雜問題[11]。 支持向量機(support vector machine, SVM)是被人們廣泛應用的并且具有神經網絡所不具有的易收斂、 穩(wěn)定性較好等優(yōu)點的一種建模方法。

    2 結果與討論

    2.1 蘋果砧木根系樣本拉曼光譜特征分析

    圖2 拉曼光譜平均曲線圖

    圖3(a)是濃度為0, 6, 12, 18和24 mg·L-1的CuSO4·5H2O脅迫蘋果砧木樣品所獲取的各個濃度下30組拉曼光譜的平均光譜圖。 圖3(b)是經過先Air-PLS基線校正處理, 再經過S-G平滑處理后的五種濃度脅迫下樣本的平均拉曼光譜圖。 圖3(b)相較于圖3(a)消除光譜的熒光等背景信號, 同時完成基線校正。 從圖3中可以看出隨著重金屬脅迫濃度的升高, 部分拉曼信號強度增加, 但是也有些隨脅迫濃度的增加而降低, 這可能是由于植物體內物質受脅迫的特性的關系。

    圖3 (a)平均拉曼光譜圖; (b)預處理后的平均拉曼光譜圖

    圖4表示五種濃度下1 096, 1 329, 1 605和2 937 cm-1波段的拉曼信號強度值。 植物體內重金屬亞細胞的分布對重金屬的積累, 遷移和解毒至關重要[15-16]。 細胞壁作為阻止重金屬Cu進入細胞的第一道屏障, 由纖維素, 半纖維素, 果膠和蛋白質組成, 能夠絡合重金屬, 減少重金屬向細胞運輸[17]。 其中在重金屬銅少量時, 對蘋果砧木生長具有促進作用, 過量時對植物產生毒害。 從圖4中得出四種波段下隨著重金屬脅迫濃度的增加拉曼光譜峰強度呈現先增強后減弱的趨勢, 結合拉曼指紋峰特性可以得出隨著濃度的增加植物體內纖維素、 木質素的含量也隨之增加但是當濃度超過18 mg·L-1, 可能此時銅脅迫會對蘋果砧木產生毒害作用, 此時纖維素、 木質素的含量也隨著降低。 通過掃描重金屬脅迫下蘋果砧木根系以單波段1 096, 1 329, 1 605和2 937 cm-1拉曼峰成像所得到的偽彩色圖像如圖5所示, 圖中不同的顏色表示拉曼光譜信號的強度。

    圖4 四種波段下拉曼信號強度圖

    圖5 蘋果砧木根系組織處的單波段拉曼峰成像

    圖5在相同測量條件下, 不同濃度脅迫和不同波段下的拉曼光譜成像可視化圖。 對比可以發(fā)現相同濃度脅迫不同波數的偽彩圖差異不大, 但是不同濃度脅迫下相同波數的偽彩圖差異較大。 濃度為0, 6, 12和18 mg·L-1的拉曼光譜成像可視化圖基本符合圖4中的結果。 然而在24 mg·L-1脅迫濃度下出現異常, 影響拉曼光譜成像的因素有很多, 造成結果可能與在做切片時其根系的粗細不同且我們切片時的橫截面厚度較厚和不統一有關, 也可能受到光照的因素影響拉曼光譜技術的成像功能。 可見, 化學成像的可視化表達為拉曼光譜在重金屬脅迫檢測中提供了新的研究方向。

    2.2 蘋果砧木根系中Cu2+含量判別模型的建立和對比分析

    2.2.1 PLS-DA模型結果與分析

    在進行光譜預處理后, 用全部光譜進行建模, 相比與拉曼光譜成像可視化表達, 建立數學模型可將實際問題簡單化, 節(jié)省判別時間。 對快速檢測蘋果砧木根系是否受到重金屬銅脅迫具有重要意義。 運用樣本分類kennard-stone(K-S)算法對150組樣本數據挑選進入訓練集, 從訓練集中挑選100組數據進行PLS-DA建模, 再挑選50組進行預測處理。 運用Matlab R2018b(The Math Works, Natick, MA, USA)平臺進行建模分析, PLS-DA模型判別結果如表2所示。 從表2中可以看出, PLS-DA模型準確率為96%(48/50), 能夠較好的判別出蘋果砧木是否受到脅迫。

    表2 PLS-DA判別結果混淆矩陣

    圖6 (a)SVM尋優(yōu)參數; (b)SVM模型

    2.2.2 SVM模型結果與分析

    使用SVM方法對全部光譜進行建模, 可以得到SVM最佳懲罰系數c=5.278,g=0.003 906 3如圖6(a)所示。 首先運用K-means算法對每類樣本的30組數據依次進行訓練, 隨機選取20組進行建模, 剩余的10組進行預測。 建立的SVM模型圖如圖6(b)所示, 從實際和預測結果來看模型的準確率為100%, 模型效果較好。 這一結果也驗證了使用顯微拉曼光譜技術檢測蘋果砧木是否受到重金屬脅迫具有可行性。

    3 結 論

    利用拉曼光譜技術結合化學計量學方法, 對不同濃度重金屬銅離子脅迫下蘋果砧木根系進行了判別分析研究。 主要有以下結論: (1)通過四個特征峰1 096, 1 329, 1 605和2 937 cm-1進行單波段的拉曼光譜成像, 可得出在同一濃度下拉曼波數與拉曼信號強度成正相關, 而且同一波段下隨著脅迫濃度的增加拉曼信號呈先增后減的趨勢。 另外, 對圖像進行可視化表達之后, 可以清晰地看出不同濃度脅迫拉曼成像有著一定的差距; (2)建立的PLS-DA模型預測準確率為96%, SVM模型預測的準確率達到100%, 因此, 兩類模型都具有優(yōu)越性, 能夠較好的預測出蘋果砧木根系是否受到脅迫, 為研究重金屬脅迫農作物及其產品提供了新的技術思路。 在今后的研究中, 需要進行根系中重金屬銅含量的定量檢測, 進一步擴大樣本范圍和重金屬濃度梯度以確定該模型的穩(wěn)定性和適用性。

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