表面增強(qiáng)拉曼法快速檢測(cè)豬肉中齊帕特羅殘留

董祥輝， 楊方威， 于 航， 姚衛(wèi)蓉， 謝云飛

江南大學(xué)食品學(xué)院， 江蘇 無(wú)錫 214000

引 言

齊帕特羅(Zilpaterol)是一種β2-受體激動(dòng)劑， 也就是俗稱的“瘦肉精”， 結(jié)構(gòu)式如圖1所示。 該藥食品動(dòng)物應(yīng)用起源于墨西哥， 后傳至中國(guó)， 被廣泛用于養(yǎng)殖業(yè)[1]。 飼料中添加此類藥物可使動(dòng)物體內(nèi)蛋白合成增加， 促進(jìn)脂類轉(zhuǎn)化， 從而顯著提高動(dòng)物瘦肉比例。 齊帕特羅被機(jī)體攝入后主要通過(guò)腎臟和肝臟將其代謝排出體外， 殘留在體內(nèi)的齊帕特羅要8天以上才能被清除[2]。 含有此類藥物殘留的食品會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生極大危害， 可能出現(xiàn)急性中毒、 心悸、 頭暈等癥狀。 鑒于其危害性， 我國(guó)禁止在畜禽養(yǎng)殖中使用β2-受體激動(dòng)劑類藥物, 但至今這類藥物違法添加事件屢禁不止, 今年的3.15晚會(huì)再次曝光河北養(yǎng)殖場(chǎng)違法使用瘦肉精類藥物， 因此需要建立相關(guān)快速檢測(cè)方法對(duì)瘦肉精類藥物殘留進(jìn)行檢測(cè)。

圖1 齊帕特羅化學(xué)結(jié)構(gòu)式

目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道對(duì)齊帕特羅進(jìn)行檢測(cè)的方法多為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[3]和酶聯(lián)免疫檢測(cè)法[4]。 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高、 準(zhǔn)確性好且適用范圍廣， 但是相關(guān)設(shè)備昂貴、 前處理復(fù)雜、 步驟繁瑣且花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)， 在現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模篩選中受限嚴(yán)重； 酶聯(lián)免疫檢測(cè)法可以進(jìn)行特異性檢測(cè)， 操作簡(jiǎn)便， 但是制備困難且成本高昂， 很難大規(guī)模應(yīng)用。

表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy， SERS)具有檢測(cè)靈敏度高、 分析速度快、 成本低廉等優(yōu)點(diǎn)， 在大規(guī)模篩選檢測(cè)方面具有極大的潛力， 因此該技術(shù)被廣泛用于食品中有毒有害物的快速檢測(cè)。 趙進(jìn)輝等[5]基于檸檬酸鈉還原制成的金膠對(duì)鴨肉中四環(huán)素的殘留進(jìn)行檢測(cè)， 預(yù)處理方法簡(jiǎn)單快速， 鴨肉提取物中四環(huán)素的檢出限可達(dá)1.120 mg·L-1， 是一種快速檢測(cè)鴨肉中四環(huán)素類藥物殘留的良好檢測(cè)方案； Cheng等[6]利用再氧化氧化石墨烯/金納米粒子對(duì)尿液中的克侖特羅進(jìn)行檢測(cè)， 檢測(cè)時(shí)間短、 準(zhǔn)確率高， 且該SERS方法僅需要便攜式拉曼儀器作為配套設(shè)備， 可用于現(xiàn)場(chǎng)快速篩查尿液， 加強(qiáng)市場(chǎng)監(jiān)測(cè)； Peng等[7]比較不同溶劑、 不同金納米粒子的濃度和積分時(shí)間對(duì)SERS檢測(cè)氯霉素的影響， 建立了可適用于多種食品中氯霉素檢測(cè)的SERS檢測(cè)方法。

目前尚未有SERS方法檢測(cè)豬肉中齊帕特羅殘留的報(bào)道。 本研究基于經(jīng)典的檸檬酸鈉還原法制成了增強(qiáng)效果較好的金溶膠， 然后對(duì)齊帕特羅的拉曼檢測(cè)條件與實(shí)際樣品提取方法進(jìn)行摸索探究， 最終建立了一種對(duì)豬肉中殘留的齊帕特羅進(jìn)行SERS檢測(cè)的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

齊帕特羅標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98.6%)， 檸檬酸三鈉鹽二水合物(純度99.0%)， 均購(gòu)于阿拉丁試劑公司； 氯金酸鉀(純度97.0%)購(gòu)于南京森貝伽生物科技有限公司； 碳酸鈉(分析純)， 乙酸乙酯(分析純)， 鹽酸(分析純)， 硝酸(分析純)， 均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； 超純水。 豬肉， 購(gòu)于京東。

王水： 取500 mL濃硝酸緩慢倒入至1 500 mL濃鹽酸中， 在這個(gè)過(guò)程中不斷攪拌使其混勻， 用于清洗制備金膠的圓底燒瓶。

齊帕特羅工作液： 精確稱取0.10 g的齊帕特羅固體溶于100 mL的超純水中， 制得濃度為1 000 mg·L-1的齊帕特羅儲(chǔ)備液。 用超純水稀釋齊帕特羅儲(chǔ)備液制得各一種低濃度的齊帕特羅工作液。

10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Na2CO3溶液： 稱取10.0 gNa2CO3固體， 溶于100 mL水， 混勻。

1.2 設(shè)備

ME204E電子天平， 梅特勒-托利多儀器有限公司； ZNCL-GS磁力加熱油浴鍋， 上海越眾儀器設(shè)備有限公司； 可調(diào)試移液器， 美國(guó)Thermo Labsystems公司； Milli-Q超純水系統(tǒng)， 美國(guó)Millipore公司； DHG-9053A電熱鼓風(fēng)干燥箱， 無(wú)錫瑪瑞特有限公司醫(yī)療設(shè)備廠； BCD-602W冰箱， 青島海爾股份有限公司； PS-10超聲波清洗器， 東莞市潔康超聲波設(shè)備有限公司； RamTracer-200-HS便攜式拉曼光譜儀， 美國(guó)歐普?qǐng)D斯； ZGDCY-24干式氮吹儀， 上海梓桂儀器有限公司； TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)， 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司； WH-2微型漩渦混合儀， 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 金溶膠制備

本研究使用金溶膠作為SERS增強(qiáng)基底， 通過(guò)經(jīng)典檸檬酸三鈉還原氯金酸鉀法制得。 具體操作為： 在事先用王水清洗過(guò)并烘干的圓底燒瓶中加入23 mL超純水與1.5 mL 10 mg·mL-1氯金酸鉀， 攪拌混勻， 放入預(yù)熱好的120 ℃油浴鍋內(nèi)， 同時(shí)以500 r·min-1攪拌并保持溫度恒定至溶液沸騰； 保持沸騰5 min后加入1 mL 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))檸檬酸三鈉水溶液， 繼續(xù)在120 ℃下恒溫?cái)嚢?5 min， 得到紫紅色的金納米溶膠， 冷卻至室溫， 4 ℃冰箱中冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品處理

稱取2.5 g經(jīng)絞肉機(jī)粉碎的豬肉放入50 mL離心管中， 依次加入2 g無(wú)水硫酸鈉、 4 mL 10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Na2CO3溶液、 10 mL乙酸乙酯， 渦旋混勻15 min。 4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min， 取上層有機(jī)層留用。 乙酸乙酯重復(fù)萃取兩次并合并萃取液， 50 ℃下氮吹至干， 用超純水復(fù)溶， 待測(cè)。

1.5 儀器參數(shù)

儀器參數(shù)為： 激光光源波長(zhǎng)785 nm， 激光功率250 mW， 掃描時(shí)間10 s， 掃描次數(shù)3 次。 在包有錫紙的載玻片上依次滴加一定體積的金膠和待測(cè)液， 混合均勻3 min后進(jìn)行掃描。 每個(gè)樣品掃描15次取平均值。

1.6 理論光譜計(jì)算

先使用Gaussview 5.0軟件畫(huà)出齊帕特羅分子結(jié)構(gòu)式， 得到Gaussian Input Files， 然后進(jìn)行理論光譜計(jì)算， 首先通過(guò)Optimation功能對(duì)齊帕特羅分子結(jié)構(gòu)式進(jìn)行優(yōu)化， 以優(yōu)化后分子結(jié)構(gòu)式作為Gaussian Input Files， 通過(guò)Frequency功能B3LYP/6-311+G(d)基組水平對(duì)齊帕特羅進(jìn)行光譜計(jì)算， 該計(jì)算基組的校正因子為0.938 0。 計(jì)算結(jié)束后得到Gaussian Output Files， 獲得理論計(jì)算拉曼光譜數(shù)據(jù)。 通過(guò)理論計(jì)算光譜與固體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)拉曼光譜、 標(biāo)準(zhǔn)溶液SERS光譜比較， 對(duì)分子特征峰進(jìn)行指認(rèn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 理論光譜

齊帕特羅優(yōu)化后結(jié)構(gòu)式如圖2所示。 由圖可以看到， 經(jīng)過(guò)校正因子校正后的理論光譜與固體光譜基本一致， 其中苯環(huán)的面內(nèi)變形振動(dòng)在理論光譜計(jì)算進(jìn)行校正后位于1 115 cm-1處， 固體光譜位于1 116 cm-1處， C—H面外搖擺在理論光譜計(jì)算進(jìn)行校正后位于1 498 cm-1處， 固體光譜位于1 447 cm-1處， 可以看出兩者的誤差較小， 在可接受范圍之內(nèi)。

圖2 齊帕特羅理論計(jì)算結(jié)果

由于理論光譜的計(jì)算默認(rèn)物質(zhì)處于真空環(huán)境， 實(shí)際固體光譜是存在分子間作用力的， 所以理論計(jì)算與固體光譜還是有一定的差距， 例如在500～700 cm-1處理論計(jì)算中的較多峰均未在固體光譜中找到。

2.2 檢測(cè)條件優(yōu)化

在檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)， 金膠與待測(cè)樣品的體積比、 混勻時(shí)間都會(huì)對(duì)SERS強(qiáng)度有較大的影響， 因此對(duì)這兩個(gè)條件進(jìn)行了優(yōu)化， 結(jié)果如圖3所示。 由圖3可以發(fā)現(xiàn)， 隨著金膠體積的增加， 拉曼強(qiáng)度先增強(qiáng)后減弱， 當(dāng)待測(cè)樣品與金膠的體積比為1∶2時(shí)， SERS增強(qiáng)因子最大， 增強(qiáng)效果最好。 這是因?yàn)楫?dāng)金納米顆粒占比較低時(shí)， 沒(méi)有足夠多的目標(biāo)物分子被吸附到金納米顆粒表面， 導(dǎo)致目標(biāo)物產(chǎn)生的表面增強(qiáng)信號(hào)不足。 當(dāng)金納米顆粒占比過(guò)高時(shí)， 多余的金納米反而會(huì)阻礙激光對(duì)吸附在金納米表面的目標(biāo)分子的拉曼散射信號(hào)表達(dá)， 使得增強(qiáng)效果變差[8]。 在待測(cè)樣品與金膠的體積比1∶2時(shí)最有利于金納米粒子吸附齊帕特羅分子形成單分子吸附層狀態(tài)， 增強(qiáng)效果較好。 同時(shí)發(fā)現(xiàn)， 在金膠剛與齊帕特羅分子混合后， 其拉曼強(qiáng)度并不是一成不變， 而是先增強(qiáng)再趨于穩(wěn)定， 這是因?yàn)辇R帕特羅與金納米粒子結(jié)合生成“熱點(diǎn)”需要一定時(shí)間， 而“熱點(diǎn)”對(duì)信號(hào)影響極大， 實(shí)驗(yàn)表明3 min后， 齊帕特羅的信號(hào)強(qiáng)度基本保持不變， 因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中取最優(yōu)測(cè)量時(shí)間為3 min。

圖3 不同檢測(cè)條件下特征峰1 116 cm-1 處SERS峰強(qiáng)情況

2.3 齊帕特羅的檢測(cè)

將固體光譜、 高斯計(jì)算光譜、 超純水光譜與齊帕特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液中的光譜進(jìn)行比較， 發(fā)現(xiàn)1 116， 1 447和1 573 cm-1這3個(gè)位置的峰在固體、 標(biāo)液與計(jì)算光譜中均有出峰且拉曼信號(hào)較強(qiáng)， 因此將這3個(gè)峰作為齊帕特羅SERS檢測(cè)中用于定性和定量檢測(cè)的特征峰。 根據(jù)拉曼位移與分子的振動(dòng)模式以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)這3個(gè)特征峰進(jìn)行歸屬， 1 116 cm-1為苯環(huán)面內(nèi)變形振動(dòng)[9]， 1 447 cm-1為C—H面外搖擺振動(dòng)， 1 573 cm-1為苯環(huán)C—H伸縮振動(dòng)。

圖4 齊帕特羅不同濃度水溶液SERS光譜

在確定好的最優(yōu)條件下對(duì)1～100 mg·L-1的齊帕特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行拉曼檢測(cè)。 我們發(fā)現(xiàn)在1 mg·L-1時(shí)1 116， 1 447和1 573 cm-1這3個(gè)位置的峰依舊清晰可見(jiàn)， 當(dāng)濃度再下降時(shí)， 無(wú)法觀測(cè)到相應(yīng)特征峰， 因此可得SERS檢測(cè)齊帕特羅的檢測(cè)限可1 mg·L-1。

對(duì)1 116， 1 447和1 573 cm-1這3個(gè)位置的峰的SERS強(qiáng)度與濃度關(guān)系進(jìn)行研究， 發(fā)現(xiàn)特征峰的SERS強(qiáng)度與濃度的對(duì)數(shù)值存在一定的線性關(guān)系， 如圖5所示， 以濃度對(duì)數(shù)值與SERS特征峰強(qiáng)度進(jìn)行擬合， 線性擬合方程R2值均在0.9以上。

圖5 峰強(qiáng)與濃度線性關(guān)系圖

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)

豬肉是一種復(fù)雜的食品基質(zhì)， 其含有的蛋白質(zhì)、 脂肪等成分對(duì)拉曼信號(hào)的干擾十分嚴(yán)重[10]， 蛋白質(zhì)、 脂肪等物質(zhì)與金溶膠結(jié)合后， 會(huì)影響到目標(biāo)物分子與金納米顆粒的結(jié)合， 從而使目標(biāo)物特征峰信號(hào)減弱甚至被掩蓋， 因此需要對(duì)前處理方法進(jìn)行優(yōu)化。

齊帕特羅在弱堿性條件下更容易溶解到有機(jī)溶劑中[3]， 因此提取過(guò)程中加入了一定量的碳酸鈉溶液。 在提取溶劑的選取過(guò)程中， 首先使用了乙腈與異丙醇混合液(4∶1)對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行提取， 發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物特征峰被完全掩蓋， 圖譜中1 020～1 130與1 400～1 500 cm-1處的峰應(yīng)該是豬肉中未除盡脂類的峰[11]， 于是在乙腈提取后再加入正己烷進(jìn)行除脂， 1 020～1 130與1 400～1 500 cm-1處的脂類峰強(qiáng)度有所下降， 但目標(biāo)物的特征峰信號(hào)強(qiáng)度仍然很弱， 最后確定使用乙酸乙酯進(jìn)行兩次萃取， 由圖6可以發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取效果最好， 雜質(zhì)的峰基本不會(huì)干擾目標(biāo)物。

圖6 不同提取溶劑對(duì)比

2.5 回收率的確定

為了考察SERS技術(shù)檢測(cè)豬肉提取液中齊帕特羅殘留量的可靠性， 利用所得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程， 對(duì)不同加標(biāo)濃度齊帕特羅樣本進(jìn)行預(yù)測(cè)。 考察結(jié)果如表1所示。

表1 回收率和精密度確定結(jié)果

選擇1， 2和20 mg·kg-1為加標(biāo)濃度進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)， 結(jié)果得到預(yù)測(cè)樣本中齊帕特羅的平均加標(biāo)回收率為90.39%～101.24%， RSD值為7.90%～8.94%， 說(shuō)明采用該方法檢測(cè)豬肉中齊帕特羅殘留量準(zhǔn)確度高， 精確性好， 可以用于豬肉中齊帕特羅殘留的快速檢測(cè)。

3 結(jié) 論

對(duì)豬肉中齊帕特羅殘留的SERS檢測(cè)方法進(jìn)行了研究， 確定了拉曼檢測(cè)金膠與齊帕特羅的混合體積比以及混勻時(shí)間， 同時(shí)對(duì)多種提取溶劑進(jìn)行比較， 最終確定了乙酸乙酯為提取溶劑。 在最佳檢測(cè)條件下， 在齊帕特羅特征峰 SERS 強(qiáng)度與濃度對(duì)數(shù)值(1～100 mg·L-1)之間建立了良好的線性關(guān)系， 線性方程R2值均在0.9以上。 對(duì)樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)， 平均回收率90.39%～101.24%， RSD值為7.90%～8.94%。 這說(shuō)明可以用該SERS方法進(jìn)行大規(guī)?，F(xiàn)場(chǎng)篩查， 從而達(dá)到對(duì)齊帕特羅殘留量進(jìn)行監(jiān)控的作用。