基于銅離子(Ⅱ)類過氧化物酶性質(zhì)可視化比色法檢測過氧化氫

馬 紀(jì)， 黃國霞， 李軍生， 閻柳娟， 張 倩

1. 廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生物與化學(xué)工程學(xué)院， 廣西科技大學(xué)， 廣西 柳州 545006 2. 廣西柳州螺螄粉工程技術(shù)研究中心， 廣西 柳州 545006

引 言

過氧化氫(H2O2)是一種強(qiáng)氧化劑， 具有漂白、 防腐、 殺菌和消毒作用， 廣泛應(yīng)用于工業(yè)、 食品和醫(yī)療領(lǐng)域， 但其過量添加產(chǎn)生的副作用日益凸顯。 過氧化氫進(jìn)入人體可產(chǎn)生羥基自由基， 導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、 加速人體衰老、 誘發(fā)心血管疾病和癌癥等[1]。 美國食品和藥物管理局(FDA)規(guī)定了H2O2的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為15 μmol·L-1[2]。 因此， 開發(fā)一種簡便、 快速、 靈敏度高、 成本低的過氧化氫檢測方法刻不容緩。

目前， 有關(guān)過氧化氫的分析方法主要有色譜法[3]、 化學(xué)發(fā)光法[4]、 電化學(xué)法[5-6]、 熒光光度法[7-8]、 比色傳感法[9-11]等。 其中， 比色傳感法因具有操作簡單、 檢測速度快、 分析成本低及檢測結(jié)果可視化等優(yōu)點(diǎn)被廣泛關(guān)注。 比色傳感法主要是在酶的催化作用下， 利用過氧化氫氧化底物光學(xué)性質(zhì)的變化為檢測信號。 比色法通常使用的酶是辣根過氧化物酶(HRP)， 由于天然酶存在易失活、 穩(wěn)定性差及制備過程繁瑣等限制了其廣泛應(yīng)用。 因此， 許多研究者探索人工模擬酶替代天然酶。 自Fe3O4納米粒子首次被證實(shí)具有類HRP的催化活性以來[12]， 納米酶在科學(xué)技術(shù)和研究中迅速得到了發(fā)展。 越來越多不同形貌、 尺度的模擬酶相繼出現(xiàn)[13-14]。 然而， 部分納米材料模擬酶存在合成復(fù)雜、 合成使用的有機(jī)溶劑易造成二次污染、 需要表征、 水溶性差、 穩(wěn)定性不高及催化活性低等不足。 為了快速靈敏檢測H2O2， 尋找高效的過氧化物模擬酶是一項(xiàng)迫切的任務(wù)。

與HRP和納米過氧化物酶相比， 銅離子(Ⅱ)類過氧化物酶不僅具有靈敏度高的特點(diǎn)， 而且易獲得、 不需要復(fù)雜的合成、 易儲存、 不需修飾可直接使用、 操作簡單及成本低廉等優(yōu)點(diǎn)[15]。 因此， 我們開發(fā)一種基于銅離子(Ⅱ)類過氧化物酶的比色法檢測過氧化氫的新方法。 利用銅離子(Ⅱ)類過氧化物酶的活性催化過氧化氫氧化TMB產(chǎn)生氧化態(tài)TMB， 使溶液顏色從無色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色， 變藍(lán)的程度與過氧化氫的濃度呈正比， 構(gòu)建線性關(guān)系， 從而確定過氧化氫的含量。 在此基礎(chǔ)上， 采用該方法高靈敏地檢測了銀耳中的過氧化氫含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

Cary60紫外可見分光光度計， 美國安捷倫科技有限公司(取樣間隔： 3 nm； 掃描速度： 快速； 波長范圍： 500～750 nm)。 梅特勒AL104分析天平(110 g/0.1 mg電子天平)， 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。 30%過氧化氫(H2O2)， 醋酸鈉(NaAc)， 冰乙酸(HAc)， 醋酸銅， 天津威晨化學(xué)試劑科貿(mào)有限公司； 3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)， 上海阿拉丁生化科技股份有限公司； 實(shí)驗(yàn)所用的水為去離子水。

1.2 方法

1.2.1 基于銅離子模擬酶催化檢測過氧化氫

在5 mL具塞試管中， 分別加入一定量的0.1 mol·L-1醋酸銅溶液、 一定量的5×10-3mol·L-1TMB溶液以及一定量不同濃度的過氧化氫， 用緩沖溶液(pH 3.0)定容至2.5 mL， 將試管置于40 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min。 采用紫外-分光光度計在500～750 nm范圍內(nèi)對溶液進(jìn)行光譜測定。 記錄652 nm波長下吸光度值A(chǔ)和相同條件下空白溶液的吸光度A0， 計算ΔA=A-A0。

1.2.2 銀耳實(shí)際樣品處理與測定

待測樣品為銀耳， 購買于當(dāng)?shù)爻小?將5.0 g銀耳粉碎， 溶于5.0 mL HAc-NaAc緩沖溶液中， 超聲震蕩20 min， 經(jīng)過離心和0.45 μm孔徑濾膜過濾， 除去不溶物， 向處理好的1.0 mL樣品溶液中分別加入1.0×10-5， 2.0×10-5， 3.0×10-5mol·L-1的過氧化氫， 定容至2.5 mL， 得到處理后分別添加1.0×10-5， 2.0×10-5和3.0×10-5mol·L-1過氧化氫的待測樣品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 可視化檢測過氧化氫的原理

圖1為銅離子(Ⅱ)比色法檢測過氧化氫的原理圖。 銅離子(Ⅱ)具有類過氧化物酶性質(zhì)[圖1(a)]， 過氧化氫氧化TMB， 在銅離子(Ⅱ)的催化下溶液從無色變?yōu)樗{(lán)色[圖1(b)]。 該反應(yīng)系統(tǒng)可以肉眼可視化和紫外-可見分光光度計檢測。 通過銅離子(Ⅱ)催化過氧化氫氧化TMB顯色， 建立快速檢測過氧化氫的比色傳感器。

圖1 銅離子(Ⅱ)-H2O2-TMB比色反應(yīng)(a)和比色法檢測過氧化氫的示意圖(b)

2.2 檢測體系可行性研究

采用比色法對體系進(jìn)行可行性實(shí)驗(yàn)。 如圖2所示， H2O2能緩慢氧化TMB使溶液呈現(xiàn)很淺的藍(lán)色， 在652 nm附近有一個弱的吸收峰(圖2a)； Cu2+不能氧化TMB(圖2b)， 但當(dāng)在TMB-H2O2體系加入Cu2+后， H2O2氧化TMB的速度明顯加快， 使溶液呈現(xiàn)深藍(lán)色， 在652 nm處的吸收峰強(qiáng)度顯著增加(圖2c)， 說明銅離子(Ⅱ)具有類過氧化物酶活性， 能催化TMB-H2O2體系并能可視化檢測過氧化氫。

圖2 可行性試驗(yàn)的紫外可見光譜圖， 插圖為各曲線對應(yīng)的反應(yīng)體系的照片

2.3 條件優(yōu)化

考察了緩沖溶液pH值對體系吸光度值的影響。 隨著pH值的增大， 溶液在652 nm處的紫外吸光度值逐漸增大， 當(dāng)pH 3.0時溶液在652 nm處的吸光度值ΔA最大， 之后溶液吸光度值逐漸降低。 因此， 反應(yīng)體系最佳pH值為3.0。 考察了溫度對體系吸光度值的影響， 結(jié)果表明， 40 ℃時體系在652 nm處的吸光度值最大， 從而確定最佳反應(yīng)溫度為40 ℃。 考察了銅離子(Ⅱ)濃度對體系吸光度值的影響。 當(dāng)Cu2+濃度達(dá)到8.0×10-3mol·L-1時， 溶液在652 nm處的吸光度值ΔA達(dá)到最大， 從而確定檢測試劑中銅離子的最佳濃度為8.0×10-3mol·L-1。 考察了TMB濃度對體系吸光度值的影響。 當(dāng)TMB濃度為6.0×10-4mol·L-1時， 溶液在652 nm處的吸光度值最大， 之后溶液吸光度值趨于平緩。 因此， 確定檢測試劑中TMB溶液的最佳濃度為6.0×10-4mol·L-1。 考察了反應(yīng)時間對體系吸光度值的影響。 如圖3所示， 20 min后溶液在652 nm處的吸光度值ΔA達(dá)到最大， 從而確定最佳反應(yīng)時間為20 min。

圖3 反應(yīng)時間的影響

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在最優(yōu)條件下， 按1.2.1的實(shí)驗(yàn)方法分別測定不同濃度的過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液， 采集紫外光譜(圖4)， 以紫外光譜中652 nm處的紫外吸收強(qiáng)度變化值ΔA(A-A0)對過氧化氫的濃度建立定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)。 根據(jù)圖5擬合得到線性方程ΔA=0.026 8c-0.028 9，r2=0.998 0。 過氧化氫的濃度范圍為0.08～40 μmol·L-1， 檢測限為0.14 μmol·L-1。

圖4 Cu2+-TMB-H2O2體系紫外吸收光譜

圖5 紫外吸收強(qiáng)度與濃度的線性擬合圖

2.5 樣品分析

對銀耳中的過氧化氫進(jìn)行檢測分析。 向3支5 mL具塞刻度試管中， 分別加入0.1 mol·L-1醋酸銅溶液200 μL和5.0×10-3mol·L-1TMB溶液250 μL， 用緩沖液定容至2.5 mL， 分別加入上述處理后的待測樣品溶液250 μL， 40 ℃水浴反應(yīng)20 min。 采集紫外光譜， 讀取652 nm處的紫外吸光強(qiáng)度值， 每個樣品重復(fù)測樣3次， 求平均值， 計算得到銀耳中過氧化氫的含量為12.24 μg·g-1(見表1)。 通過加標(biāo)實(shí)驗(yàn)得到樣品的加標(biāo)回收率在97.10%～107.08%之間， 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于5%， 表明該檢測方法準(zhǔn)確度高， 選擇性好。

表1 本方法檢測銀耳中過氧化氫的結(jié)果

3 結(jié) 論

建立了一種銅離子(Ⅱ)類過氧化物酶活性催化過氧化氫氧化TMB顯色， 利用紫外分光光度法檢測過氧化氫的新方法。 在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下， 過氧化氫的濃度在0.08～40 μmol·L-1范圍與體系的吸光度變化值ΔA呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系， 檢測限(3σ)為0.14 μmol·L-1。 該法用于銀耳樣品中過氧化氫含量的測定， 結(jié)果令人滿意。 所建立的食品中過氧化氫的檢測方法具有簡便、 快速、 靈敏、 成本低廉等優(yōu)點(diǎn)， 在食品分析領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。