基于SERS技術(shù)的食源性致病菌芽孢拉曼光譜特征結(jié)構(gòu)分析及快速識(shí)別

劉世杰， 朱瑤迪, 2， 李苗云, 2*， 趙改名, 2， 趙莉君, 2， 馬陽(yáng)陽(yáng), 2， 王 娜

1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 河南 鄭州 450000 2. 河南省肉品加工與安全國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室， 河南 鄭州 450000

引 言

食源性致病菌引起的食源性疾病每年導(dǎo)致全球約2 000萬(wàn)人死亡， 2.6億人致病， 其中多數(shù)案例與食源性致病菌芽孢菌相關(guān)， 如產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)引起的氣性壞疽和食物中毒、 艱難梭菌(C.difficile)引起的嚴(yán)重且經(jīng)常致命的腹瀉或偽膜性腸炎， 以及蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)引起的嘔吐和腹瀉綜合癥[1]。 芽孢是細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞在環(huán)境脅迫下(營(yíng)養(yǎng)匱乏、 干旱、 高溫等)在胞內(nèi)形成的休眠體， 對(duì)紫外輻射、 干燥、 強(qiáng)酸強(qiáng)堿和一些有毒化學(xué)物品等有極強(qiáng)的抵抗力， 在休眠狀態(tài)下可以保持活力數(shù)年甚至數(shù)百年。 當(dāng)條件有利于生長(zhǎng)時(shí)， 芽孢感知外界萌發(fā)信號(hào)， 開(kāi)始萌發(fā)， 其一旦萌發(fā)即會(huì)產(chǎn)生毒素， 危及人體健康， 存在極大的安全隱患。 因此， 探究快速、 高效、 無(wú)損的食源性致病菌芽孢檢測(cè)方法迫在眉睫[2]。

近年來(lái)隨著光譜技術(shù)的發(fā)展， 許多光譜技術(shù)被用于食品質(zhì)量與安全檢測(cè)， 但這些方法對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)都有一定的局限性。 例如， 熒光光譜技術(shù)， 圖譜合一鑒別快速， 但缺乏化學(xué)信息的特異性， 易受元素相互干擾和重疊峰的影響[3]； 近紅外光譜技術(shù)， 快捷且無(wú)損， 但不適用于水溶液的測(cè)量[4]。 拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)雖然檢測(cè)信號(hào)弱， 但結(jié)合固體金屬粗糙表面或者納米溶膠懸浮液為基底(例如金、 銀等貴金屬)， 開(kāi)發(fā)表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)(SERS)， 可實(shí)現(xiàn)拉曼信號(hào)的顯著增強(qiáng)， 從而獲得更多的微生物信號(hào)。 SERS作為一種生物指紋識(shí)別技術(shù)， 可以提供豐富的分子結(jié)構(gòu)和組成信息， 具有無(wú)需標(biāo)記、 操作簡(jiǎn)便、 檢測(cè)時(shí)間短且無(wú)損等優(yōu)勢(shì)， 可以滿足食品質(zhì)量與安全領(lǐng)域快速檢測(cè)的需求[5]。

目前， 國(guó)內(nèi)外許多研究表明SERS技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)研究方面具有巨大的優(yōu)勢(shì)和潛力。 Witkowska等[6]采用電化學(xué)方法將銀納米粒子沉積于FTO鍍膜玻璃板作為SERS基底， 檢測(cè)了五種不同食品基質(zhì)中的食源性致病菌； Yang等[7]使納米顆粒在盡可能多的點(diǎn)和盡可能近的部位與細(xì)菌表面， 基于SERS技術(shù)區(qū)分3株大腸桿菌DSM菌株； Li等[8]提出一種Fe3O4@PEI@bacteria復(fù)合物形式與SERS技術(shù)結(jié)合的方法識(shí)別金黃色葡萄球菌、 鮑氏不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌。 然而基于SERS技術(shù)對(duì)不同食源性致病菌芽孢的光譜解析及快速識(shí)別還未見(jiàn)報(bào)道。

因此， 以不同食源性致病菌芽孢為研究對(duì)象， 以檸檬酸鈉還原法制備的AgNPs溶膠為基底材料， 用SERS技術(shù)對(duì)培養(yǎng)的芽孢進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)。 依據(jù)拉曼圖譜間峰位歸屬和出峰強(qiáng)度差異解析食源性致病菌芽孢之間的分子結(jié)構(gòu)以及不同芽孢之間的差異， 并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析， 實(shí)現(xiàn)食源性致病菌芽孢的快速識(shí)別， 為快速、 便捷地檢測(cè)食源性致病菌芽孢提供有效手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

菌株C.perfringensATCC 13124，C.difficileATCC 43593和B.cereusCMCC(B)63303， 來(lái)源于中國(guó)菌種保藏中心和廣東環(huán)凱微生物技術(shù)有限公司。 腦心輸注肉湯培養(yǎng)基(BHI)， 液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FTG)， 胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)， 營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)， 庖肉培養(yǎng)基， 購(gòu)于青島海博有限公司； 胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基(TSC)， 胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)， 胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)， 產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基， 購(gòu)于北京陸橋有限公司； 酵母提取物， L-半胱氨酸， ?；悄懰徕c， 硫酸錳， 濃鹽酸， 濃硝酸， 均為分析純。

1.2 儀器

LabRAM HR Evolution激光共聚焦拉曼光譜儀， HORIBA 上海茂培科技有限公司； Winner802納米激光粒度儀， 濟(jì)南微納顆粒儀器股份有限公司； BHC-1000IIA2 生物安全柜， 上海川一實(shí)驗(yàn)儀器有限公司； Hirayama HVE-50蒸汽壓力滅菌鍋， 廣州市深華生物技術(shù)有限公司； BECKMAN COULTER高速冷凍離心機(jī)， 廣州立諾自動(dòng)化設(shè)備有限公司； ECLIPSE 80i生物顯微鏡， 日本NIKON公司； MIR-254低溫培養(yǎng)箱， 日本SANYO公司； OSJ-UP-30L超純水機(jī)， 濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司， 等。

1.3 方法

1.3.1 不同食源性致病菌芽孢的培養(yǎng)

產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢的制備。 將冷凍的C.perfringens磁珠在TSC培養(yǎng)基上劃線后， 在培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24～48 h。 從TSC平板上挑取典型的黑色菌落接種到庖肉培養(yǎng)基中， 37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。 取培養(yǎng)完成的菌液接種到新制備的FTG培養(yǎng)基中， 在水浴鍋中75 ℃加熱20 min， 并在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。 取該培養(yǎng)液接種到的FTG培養(yǎng)基中活化， 37 ℃培養(yǎng)4 h。 將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到配置好的產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基中， 在培養(yǎng)箱中37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。 將培養(yǎng)完成的芽孢液在水浴鍋中70 ℃加熱25 min破壞營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞， 用無(wú)菌水離心(7 012 r·min-1， 20 min， 4 ℃)重復(fù)洗滌芽孢懸浮液3次。 通過(guò)相差顯微鏡100倍油鏡進(jìn)行芽孢檢測(cè)， 將離心洗滌的芽孢重新懸浮于無(wú)菌蛋白胨水中， 并保存于-20 ℃環(huán)境中待用。

艱難梭菌芽孢的制備。 將冷凍的C.difficile磁珠FTG平板上37 ℃厭氧培養(yǎng)24～48 h。 從TSC平板上挑取單個(gè)菌落接種到已加入促芽孢生長(zhǎng)因子(1%酵母提取物、 0.1% L-半胱氨酸和0.05%?；悄懰徕c)的BHI肉湯中37 ℃厭氧培養(yǎng)5 d。 離心、 鏡檢與保存方法同上。

蠟樣芽孢桿菌芽孢的制備。 將冷凍的B.cereus磁珠在BHI平板上劃線， 在培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24～48 h。 挑取典型的蠟樣芽孢桿菌菌落接種到胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基中， 在培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。 轉(zhuǎn)接到添加50 mg·L-1MnSO4的TSB培養(yǎng)基中， 之后在37 ℃下孵育7 d。 離心、 鏡檢與保存方法同上。

1.3.2 AgNPs溶膠的制備

把45 mg AgNO3溶解在250 mL超純水中， 在回流下加熱到沸騰。 在劇烈攪拌下滴加5 mL新鮮制備的1%檸檬酸鈉溶液。 將混合物保持沸騰并攪拌90 min， 然后緩慢冷卻至室溫。 將得到的AgNPs保持在4 ℃避光保存?zhèn)溆肹9]。

1.3.3 納米材料的表征

通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-Vis)、 納米激光粒度儀和透射電子顯微鏡(TEM)對(duì)AgNPs進(jìn)行表征。 UV-Vis表征和納米激光粒度儀表征時(shí)用超純水對(duì)納米材料進(jìn)行適當(dāng)稀釋后上機(jī)檢測(cè)； TEM表征時(shí)將制備好的納米金溶膠樣品滴在碳支持膜， 用濾紙吸去樣品表面多余的液體， 干燥固定后進(jìn)行鏡檢。

1.3.4 載玻片的清洗

進(jìn)行拉曼光譜掃描前， 將載玻片用王水(VHCl∶VHNO3=3∶1)浸泡清洗， 去除其表面的雜質(zhì)， 之后用超純水洗滌三遍， 用氮?dú)獯蹈奢d玻片， 備用。

1.3.5 SERS樣品的制備

將培養(yǎng)所得的不同芽孢液各取1 mL， 離心3次后重懸備用。 將芽孢液稀釋10倍和AgNPs 1∶1混合， 振蕩均勻90 s， 取200 μL混合液滴在處理好的載玻片上， 并將AgNPs和3種芽孢分別在載玻片上做空白對(duì)照， 放置在無(wú)菌操作臺(tái)中自然晾干備用。

1.3.6 拉曼光譜檢測(cè)

樣品檢測(cè)之前， 以520.7 cm-1峰作為基準(zhǔn)峰使用硅片(Si)對(duì)拉曼儀器進(jìn)行校正。 表面增強(qiáng)拉曼光譜采集使用532.8 nm的激光作為激發(fā)光源， 將激光強(qiáng)度設(shè)置為最大強(qiáng)度(15 mW)， 物鏡設(shè)置成100倍， 積分時(shí)間為30 s， 積分3次。 檢測(cè)的光譜范圍為400～1 800 cm-1， 分辨率為1 cm-1。 將制備處理好的樣品進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)， 之后使用LabSpec 6.0軟件對(duì)樣品進(jìn)行光譜采集， 對(duì)每個(gè)樣品分別隨機(jī)采集12次。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

使用EXCEL 2010、 Origin 8.0與SPSS 16.0工具對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 食源性致病菌芽孢的鏡檢結(jié)果

在100倍油鏡的相差顯微鏡下觀察產(chǎn)氣莢膜梭菌芽孢(C.perfringensspores)、 艱難梭菌芽孢(C.difficilespores)和蠟樣芽孢桿菌芽孢(B.cereusspores)， 三種芽孢率均達(dá)到90%以上， 單一芽孢分布明顯， 清晰可見(jiàn)， 中心“光亮”， 呈圓形或卵圓形。

2.2 AgNPs溶膠的表征

按1.3.2方法制備的AgNPS溶膠顏色為灰綠色， 對(duì)其進(jìn)行UV-Vis、 激光粒度和TEM表征。 由圖2(a)可知， 通過(guò)UV-Vis表征， AgNPs溶膠的最大吸收單一峰在415 nm附近， 表明制備出AgNPs溶膠。 用納米激光粒度儀對(duì)AgNPs的粒度大小進(jìn)行檢測(cè)， 結(jié)果表明AgNPS溶膠的粒徑大小主要分布在35～55 nm范圍內(nèi)， 如圖2(b)所示。 由圖2(c)透射電鏡圖可知， AgNPs溶膠， 球體顆粒均一， 通過(guò)Nano Measurer計(jì)算得到AgNPs溶膠的平均尺寸約為45 nm。

圖1 三種食源性致病菌的相差顯微鏡鏡檢圖

圖2 AgNPs溶膠的的紫外可見(jiàn)光光譜圖(a)、 粒度分布圖(b)和TEM圖(c)

2.3 食源性致病菌芽孢的SERS圖譜及解析

通過(guò)SERS技術(shù)對(duì)AgNPs、 3種芽孢和3種芽孢與AgNPs偶聯(lián)的復(fù)合物分別進(jìn)行12次隨機(jī)拉曼數(shù)據(jù)采集， 經(jīng)基線校正、 歸一化和平滑處理， AgNPs對(duì)3種食源性致病菌芽孢的SERS增強(qiáng)效果、 3種食源性致病菌芽孢的SERS平均指紋圖譜和SERS光譜拉曼位移的暫定歸屬如圖3、 圖4和表1所示。 3種食源性致病菌芽孢與AgNPs復(fù)合物進(jìn)行SERS檢測(cè)的結(jié)果如圖3所示。 在無(wú)AgNPs偶聯(lián)的情況下， 3種食源性致病菌芽孢的拉曼光譜圖未出現(xiàn)任何顯著特征峰型， 而經(jīng)過(guò)AgNPs偶聯(lián)的C.perfringensspores，C.difficilespores和B.cereusspores均顯示出明顯增強(qiáng)效應(yīng)的拉曼光譜， 且3種芽孢的拉曼信號(hào)譜峰圖之間差異明顯。 因此， 采用以AgNPs溶膠為基底的SERS技術(shù)檢測(cè)和區(qū)分這3種食源性致病菌芽孢是可行的。

圖3 AgNPs對(duì)3種食源性致病菌芽孢的SERS增強(qiáng)效果

圖4 三種食源性致病菌芽孢的SERS平均指紋圖譜

在3種食源性致病菌芽孢SERS光譜中Ca2+-DPA的拉曼振動(dòng)峰數(shù)量和出峰強(qiáng)度占主要地位， 原因是芽孢中Ca2+-DPA濃度較高(估計(jì)為芽孢干重的5%～15%)， 其拉曼振動(dòng)峰位置大約在657～663， 818～820， 1 017， 1 389～1 393， 1 441～1 449和1 572～1 576 cm-1波段。 將Ca2+-DPA的六個(gè)特征峰分別編號(hào)為C1—C6， 并對(duì)C1—C6分別在3種芽孢的出峰強(qiáng)度進(jìn)行對(duì)比， 結(jié)果如表2所示。 由表1可知， Ca2+-DPA的六個(gè)特征峰在3種芽孢SERS光譜中差異明顯，C.difficilesporesSERS光譜中Ca2+-DPA的六個(gè)特征峰峰強(qiáng)度均高于C.perfringensspores和B.cereusspores，C.perfringensspores次之。 3種芽孢的Ca2+-DPA在1 017 cm-1(Ca2+-DPA)處拉曼峰強(qiáng)度均最高且差異明顯， 是Ca2+-DPA的主要特征峰， 也是區(qū)別三種芽孢的主要特征峰。

表1 三種食源性致病菌芽孢SERS光譜拉曼位移的暫定歸屬[10-13]

表2 Ca2+-DPA六個(gè)特征峰分別在3種芽孢SERS光譜的出峰強(qiáng)度對(duì)比

2.4 三種芽孢食源性致病菌SERS光譜重現(xiàn)性試驗(yàn)

SERS基底的重現(xiàn)性對(duì)于常規(guī)分析的實(shí)際應(yīng)用至關(guān)重要。 為檢驗(yàn)基于AgNPs溶膠基底材料對(duì)五種食源性致病菌SERS檢測(cè)的重現(xiàn)性， 使用激光共聚焦拉曼光譜儀分別對(duì)3種食源性致病菌樣本隨機(jī)掃描12次， 并對(duì)3種食源性致病菌芽孢在1 017 cm-1(Ca2+-DPA)處拉曼峰值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)進(jìn)行計(jì)算。 3種食源性致病菌芽孢SERS光譜的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示， 每種芽孢的12次 SERS光譜具有良好的的一致性。 經(jīng)計(jì)算，C.perfringensspores在1 017 cm-1處的拉曼峰值RSD為0.96%，C.difficilespores在1 017 cm-1處的拉曼峰值RSD為0.77%，B.cereusspores在1 017 cm-1處的拉曼峰值RSD為1.58%， 表明基于AgNPS溶膠為基底材料的SERS技術(shù)檢測(cè)食源性致病菌芽孢具有高度重現(xiàn)性， 為基于SERS技術(shù)對(duì)食源性致病菌芽孢的快速檢測(cè)提供了強(qiáng)有力的支持。

圖5 三種食源性致病菌芽孢SERS光譜的重復(fù)性試驗(yàn)

2.5 多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

主成分分析(PCA)可以提取3種芽孢SERS光譜中具有最高累積方差的前兩個(gè)主成分 PC1和 PC2并進(jìn)行PCA二維散點(diǎn)圖繪制， 將復(fù)雜的多維空間數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變?yōu)橹庇^可見(jiàn)的分布散點(diǎn)圖。 系統(tǒng)聚類(lèi)分析(HCA)可以將3種芽孢SERS光譜進(jìn)行先聚類(lèi)再判斷分析并構(gòu)建樹(shù)狀圖， 判斷研究對(duì)象種群之間的相似性與差異性。

為了更好地實(shí)現(xiàn)不同食源性致病菌芽孢的定性識(shí)別， 避免相似的拉曼振動(dòng)光譜對(duì)微生物分類(lèi)和鑒定的干擾。 利用PCA和HCA分析， 評(píng)估基于AgNPs溶膠為基底材料的SERS技術(shù)檢測(cè)3種食源性致病菌芽孢的圖譜差異性， 分析結(jié)果如圖6和圖7所示。 PCA分析結(jié)果顯示PC1和PC2方差貢獻(xiàn)率分別為51.1%和39.7%， 累積貢獻(xiàn)率達(dá)90.8%， 且PCA分析可以很明顯地將3種芽孢的聚集成3個(gè)獨(dú)立的簇， 每個(gè)簇獨(dú)立無(wú)重復(fù)， 每種芽孢都能彼此區(qū)分開(kāi)。 HCA分析可以看出3種芽孢被分為三個(gè)聚類(lèi)， 3種各自聚類(lèi)無(wú)交叉干擾。 在聚類(lèi)距離21處C.perfringensspores和C.difficilespores被聚為一類(lèi)， 相對(duì)于B.cereusspores，C.perfringensspores和C.difficilespores的SERS特征拉曼光譜較相似， 表明屬于梭菌屬芽孢的C.perfringensspores和C.difficilespores化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成相似性較高， 屬于桿菌屬芽孢的B.cereusspores在結(jié)構(gòu)和組成成分上與其存在區(qū)分， 與Christie[14]等研究相似。 通過(guò)PCA和HCA分析不僅有效實(shí)現(xiàn)了3種芽孢之間的區(qū)分， 也實(shí)現(xiàn)了梭菌屬芽孢和桿菌屬芽孢的區(qū)分。

圖6 三種食源性致病菌芽孢SERS圖譜的主成分分析(PCA)二維散點(diǎn)圖

3 結(jié) 論

利用檸檬酸鈉還原法制備AgNPs溶膠的SERS增強(qiáng)作用， 通過(guò)激光共聚焦拉曼光譜檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)與AgNPs偶聯(lián)的C.perfringensspores，C.difficilespores和B.cereusspores均顯示出明顯增強(qiáng)效應(yīng)的拉曼光譜圖且光譜重現(xiàn)性良好。 3種芽孢的SERS光譜中Ca2+-DPA的拉曼振動(dòng)峰數(shù)量和出峰強(qiáng)度占主要地位， 且在SERS圖譜中可以觀察到拉曼振動(dòng)峰的差異， 表明以AgNPs溶膠為基底的SERS技術(shù)具有區(qū)分不同類(lèi)型食源性致病菌芽孢的能力。 結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析， 不僅有效實(shí)現(xiàn)了3種芽孢之間的區(qū)分， 也實(shí)現(xiàn)了梭菌屬芽孢和桿菌屬芽孢的區(qū)分， 為食源性致病菌芽孢檢測(cè)和食品安全風(fēng)險(xiǎn)控制及檢測(cè)提供了有效手段。