木質(zhì)素降解產(chǎn)物酚羥基測(cè)定方法研究進(jìn)展

李鵬輝， 蔣政偉， 李家全， 任建鵬， 吳文娟

南京林業(yè)大學(xué)輕工與食品學(xué)院， 江蘇 南京 210037

引 言

生物質(zhì)的利用率低直接限制了中國(guó)生物經(jīng)濟(jì)和生物能源產(chǎn)業(yè)的發(fā)展， 尋求來(lái)源廣泛和可持續(xù)的生物質(zhì)供應(yīng)已迫在眉睫[1]。 在木質(zhì)纖維素生物乙醇精煉預(yù)處理中， 原料中大量的木質(zhì)素通常會(huì)當(dāng)作廢物丟棄或?qū)⑵渲苯尤紵a(chǎn)熱[2]， 沒(méi)有得到充分的利用。 木質(zhì)素作為可再生資源， 儲(chǔ)量豐富， 結(jié)構(gòu)中含有大量的官能團(tuán)， 可進(jìn)行接枝改性， 拓展功能木質(zhì)素大分子應(yīng)用[3]； 或降解成小分子， 替代石油化工產(chǎn)品。 因此， 如何有效利用木質(zhì)素成為了人們研究的熱點(diǎn)。 木質(zhì)素是由苯丙烷結(jié)構(gòu)通過(guò)醚鍵或碳碳鍵連接而成的大分子， 在木質(zhì)素降解過(guò)程中， 大量芳基醚鍵的斷裂會(huì)產(chǎn)生較多的酚羥基， 在評(píng)定其降解效率時(shí)， 降解后產(chǎn)物中酚羥基的含量是關(guān)鍵性指標(biāo)。 酚羥基數(shù)值大小體現(xiàn)出酸堿催化醚鍵裂解或者木質(zhì)素氧化還原降解的能力， 因此酚羥基的測(cè)定在制漿和漂白過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。 另外， 木質(zhì)素在各種改性過(guò)程中的化學(xué)反應(yīng)性也受到其酚羥基含量的深刻影響(例如與甲醛反應(yīng)生產(chǎn)木質(zhì)素酚醛樹(shù)脂粘合劑)。 因此， 酚羥基的定量可為了解木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)性以及木質(zhì)素降解的機(jī)理和程度提供相關(guān)依據(jù)[4]。 由于不同的木質(zhì)素樣品的酚型結(jié)構(gòu)均表現(xiàn)出各異的鍵型結(jié)構(gòu)與反應(yīng)活性， 測(cè)量不同木質(zhì)素樣品酚羥基的含量有很多種方法， 如電導(dǎo)滴定法[5]、 電位滴定法[6]、 紫外可見(jiàn)光度法[7]、 高效液相色譜法[8]、 核磁共振波譜法[9-11]、 氣相色譜-質(zhì)譜法[12]、 氨解氣相色譜法[13]和高碘酸鹽氧化氣相色譜法[14]等。 在酚羥基檢測(cè)過(guò)程中， 也會(huì)涉及許多常用的檢測(cè)儀器， 如圖1所示， 例如電位滴定儀、 電導(dǎo)滴定儀、 紫外分光光度計(jì)、 高效液相色譜儀， 核磁共振波譜儀、 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、 氣相色譜儀等。

圖1 木質(zhì)素酚羥基定量檢測(cè)過(guò)程所涉及的譜圖分析方法

1 木質(zhì)素降解產(chǎn)物酚羥基測(cè)定方法

1.1 滴定法

酚羥基的電導(dǎo)滴定法是將一種已知濃度的試劑滴加到含酚羥基的待測(cè)物質(zhì)的介質(zhì)中， 根據(jù)電導(dǎo)率的改變決定滴定終點(diǎn)， 通過(guò)試劑的濃度、 消耗的體積， 計(jì)算出酚羥基的濃度。 歐義芳等[5]提出了在含有少量水的有機(jī)溶劑中， 利用電導(dǎo)滴定測(cè)定未漂桉木紙漿中的酚羥基方法。 滴定介質(zhì)可以是丙酮、 吡啶、 乙醇和水， 滴定劑為KOH-異丙醇， 待測(cè)樣濃度為2.0 g·L-1。 在同樣的滴定條件下， 劉華武等[15]在樣品濃度為2.5 g·L-1條件下， 可以同時(shí)測(cè)出木質(zhì)素中酚羥基和羧基的濃度， 測(cè)得的酚羥基量誤差小于2.0%。 同樣的條件下， 仝麗麗等[16]以蘆葦乙醇木質(zhì)素為原料， 通過(guò)苯酚改性增加木質(zhì)素上酚羥基的含量， 為快速準(zhǔn)確測(cè)定其他種類(lèi)木質(zhì)素上的羥基、 羧基含量提供了理論依據(jù)。

電位滴定測(cè)量滴定木質(zhì)素的酚羥基的方法與電導(dǎo)滴定法相似， 不同點(diǎn)在于它是以測(cè)量電位變化來(lái)確定滴定終點(diǎn)的方法， 其主要適用于滴定酚羥基濃度較小的待測(cè)樣品(水或非水溶液)， Butler等[6]使用了非水電位滴定來(lái)對(duì)木質(zhì)素的酚羥基和羧基進(jìn)行定量， 該實(shí)驗(yàn)選取了鐵杉木質(zhì)素作為原料， 首先將樣品溶于二甲基甲酰胺， 加入偶氮紫指示液， 再用甲醇鉀的苯甲醇溶液來(lái)滴定， 得到的酚羥基含量范圍為2%～8%； 后來(lái)Pobiner[17]改良了電位滴定方法， 選用對(duì)羥基苯甲酸作為內(nèi)標(biāo)物， 用四丁基氫氧化銨的甲醇溶液來(lái)滴定木質(zhì)素磺酸鈉， 得到酚羥基和羧酸基濃度， 并使滴定曲線得以修正， 結(jié)果準(zhǔn)確度大幅度地提升。 而周明松等[18]使用水相的電位滴定分析易溶于無(wú)機(jī)堿性溶液的堿木質(zhì)素與木質(zhì)素磺酸鈉， 得到的酚羥基含量分別為2.8和1.3 mmol·g-1， 打破了非均相溶劑體系的禁錮， 讓能溶于無(wú)機(jī)堿性溶液的多種木質(zhì)素中酚羥基和羧酸基的濃度都能被有效地定量測(cè)量， 在一定程度上簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作并拓展了定量方法。

Serrano等[19]提出了一種不使用有害溶劑、 快速、 經(jīng)濟(jì)、 簡(jiǎn)便的木質(zhì)素酚羥基定量新方法， 首先測(cè)量水介質(zhì)中的酸堿度， 再進(jìn)行電導(dǎo)滴定和酸堿滴定， 并聯(lián)合紫外可見(jiàn)光度、31P-核磁共振、1H核磁共振、13C核磁共振、 Folin-Ciocalteu試劑和氨解-氣相色譜進(jìn)行分析。 結(jié)果表明， 該方法與紫外可見(jiàn)光度和31P-核磁共振(最精確的方法)有良好的統(tǒng)計(jì)相關(guān)性， 數(shù)據(jù)具有較小的變異性(約10%)。

1.2 紫外可見(jiàn)光度法

早在1954年， Goldschmid[20]基于苯酚在堿性溶液中的特征紫外吸收測(cè)定了酚羥基含量， 將樣品在堿性溶液的吸光度與在中性溶液的吸光度進(jìn)行比較并制作差異曲線， 酚羥基含量根據(jù)曲線中的最大吸收值計(jì)算。 原理為： 在堿性條件下， 木質(zhì)素吸收光譜中羥基電離會(huì)產(chǎn)生紅移和增色位移[21-22]。 當(dāng)吸收最大值轉(zhuǎn)移到更長(zhǎng)的波長(zhǎng)時(shí)， 即發(fā)生紅移， 而在某一波長(zhǎng)下， 增色位移會(huì)導(dǎo)致吸收強(qiáng)度的增加[23]。 通過(guò)從堿性光譜中減去中性光譜， 獲得電離差光譜(δ光譜)， 酚羥基的類(lèi)型不同， 特征最大值也不同。 該方法假設(shè)木質(zhì)素在溶劑中完全溶解， 如果不滿足這個(gè)條件， 酚羥基的實(shí)際數(shù)量會(huì)偏低。 測(cè)量時(shí)必須使用適當(dāng)?shù)哪举|(zhì)素模型化合物(例如苯酚、 香草醛以及鄰甲氧基苯酚等)或已知酚羥基含量的木質(zhì)素進(jìn)行校準(zhǔn)， 該方法可應(yīng)用于大多數(shù)來(lái)源的木質(zhì)素。 吳保國(guó)等[24]在紫外可見(jiàn)光度法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步改進(jìn)了木質(zhì)素酚羥基基團(tuán)的測(cè)定方法。 在該方法中， 使用了水而不是二惡烷作為溶劑， 在微分紫外可見(jiàn)光譜中確定模型化合物的最大吸收帶為250 nm， 建立了吸收強(qiáng)度與酚羥基含量之間的線性回歸方程。 以樺木， 蘆葦， 朝鮮松和落葉松的硫酸鹽木質(zhì)素為研究對(duì)象， 計(jì)算了各自酚羥基含量， 得出改進(jìn)的紫外可見(jiàn)光度法所測(cè)的結(jié)果與化學(xué)測(cè)定相當(dāng)接近。

紫外可見(jiàn)光度法是一種基于使用特定的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行檢測(cè)的方法， 在數(shù)據(jù)處理上有一定的局限性， 由于木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性， 會(huì)造成木質(zhì)素在紫外可見(jiàn)光譜除250與300 nm之外也有吸光度， 這就導(dǎo)致了測(cè)定值的偏小[25-26]。 對(duì)于木質(zhì)素降解過(guò)程中的羥基含量(包括酚羥基和烷基羥基的量)， 常使用化學(xué)滴定法測(cè)量木質(zhì)素樣品的總羥基含量， 再使用氫氧化鈉溶液滴定乙?；举|(zhì)素樣品， 然后計(jì)算總羥值。 木質(zhì)素樣品的酚羥基含量則通過(guò)紫外可見(jiàn)光度法測(cè)定[27]。 Goldmann等[21]基于電離差紫外可見(jiàn)光度法(Δε-方法)， 考慮了斜率因素來(lái)對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)， 這樣可以消除在計(jì)算質(zhì)量消光系數(shù)時(shí)的實(shí)驗(yàn)變化影響。 以13C-核磁共振定量測(cè)定結(jié)果為對(duì)照， 通過(guò)測(cè)量有機(jī)溶劑木質(zhì)素和硫酸鹽木質(zhì)素的酚羥基含量來(lái)評(píng)價(jià)此方法的可靠性。 結(jié)果表明， 這是一種可以快速檢測(cè)木質(zhì)素的酚羥基含量方法。

與上述方法相似， 利用酚羥基反應(yīng)后物質(zhì)與其自身成比例的原理， 還有一種簡(jiǎn)單快速測(cè)定木質(zhì)素中酚羥基的方法——Folin-Ciocalteu試劑法(簡(jiǎn)稱(chēng)FC法)[28]。 FC法是得名首次發(fā)現(xiàn)這種方法的Folin和Ciocalteu， 該方法的核心就是異磷鎢酸鹽-鉬酸鹽與酚羥基產(chǎn)生特定的反應(yīng)， 生成產(chǎn)物與總酚羥基量具有很好的線性關(guān)系， 符合可見(jiàn)分光光度法定量測(cè)量原理。 該方法的特點(diǎn)是其不僅可以快速、 便捷地測(cè)定木質(zhì)素中酚羥基的含量， 而且可以直接測(cè)定紙漿中酚羥基的含量， 且測(cè)定的數(shù)據(jù)可靠性更好。 賴(lài)玉榮等[7]使用FC法評(píng)價(jià)了用過(guò)氧化氫氧化降解硫酸鹽木質(zhì)素的降解效果， 通過(guò)比較降解起始與結(jié)束酚羥基濃度的變化來(lái)確定降解過(guò)程生成的酚羥基， 并且還比較了不同紙漿殘余木質(zhì)素中酚羥基的濃度。 Rover等[29]將FC法用于定量確定生物油中的總酚， 該方法基于福林酚(FC試劑)對(duì)酚類(lèi)化合物的氧化作用， 通過(guò)使用陽(yáng)性和陰性對(duì)照評(píng)估了其相對(duì)于干擾物的準(zhǔn)確性。 并且將此法與液-液萃取測(cè)量得到的生物油中的總酚含量相比較， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)總酚含量基本相同。

紫外可見(jiàn)光度法和FC法測(cè)定的酚含量值有些許差異， 可能是由于福林酚試劑測(cè)定的是還原能力， 它不是測(cè)定酚含量的特定方法。 紫外可見(jiàn)光度法根據(jù)酚類(lèi)物質(zhì)在紫外區(qū)有吸收光譜原理， 直接通過(guò)光譜掃描測(cè)定酚羥基含量， 測(cè)定結(jié)果不僅是所有酚類(lèi)物質(zhì)的含量， 帶有酚羥基基團(tuán)的物質(zhì)都可以被檢測(cè)到。 FC法是測(cè)定酚含量的常規(guī)方法， 但由于操作方便、 精密度高， 紫外可見(jiàn)光度法也是酚含量測(cè)定的普遍方法。 兩種方法的測(cè)定結(jié)果經(jīng)回歸計(jì)算， 均呈良好的線性關(guān)系[30]。

1.3 高效液相色譜法

高效液相色譜法(HPLC法)既可以定性分析也可以定量分析。 其中定性的主要方法是與已知標(biāo)準(zhǔn)物對(duì)照， 即使更換色譜柱或洗脫液的組分發(fā)生變化時(shí)， 只要待測(cè)物峰的保留值跟標(biāo)準(zhǔn)物一樣時(shí)， 也可得出此待測(cè)物與標(biāo)準(zhǔn)物可能是相同化合物。 以反相色譜為例， 梯度洗脫時(shí)， 待測(cè)品隨梯度起點(diǎn)的流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱入口， 由于起點(diǎn)流動(dòng)相中強(qiáng)洗脫溶劑含量較低。 一段時(shí)間后， 洗脫溶劑增加， 化合物1在柱中的移動(dòng)速率明顯增大， 并且隨著洗脫溶劑的增加， 其移動(dòng)速率愈加快速， 直到流出色譜柱， 被檢測(cè)器檢測(cè)。 洗脫溶劑持續(xù)增加， 在隨后的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)， 化合物2移動(dòng)速率也開(kāi)始變快， 并與化合物1類(lèi)似的方式被洗脫出色譜柱。

定量的最常采用方法是外標(biāo)法， 先用待測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)樣品配比不同濃度， 色譜條件和待測(cè)組分一樣的， 量取相同體積精準(zhǔn)進(jìn)樣， 之后測(cè)量每個(gè)峰的峰高或峰面積， 得到過(guò)原點(diǎn)的待測(cè)樣品濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線， 最終可以直接從曲線上讀出各種酚類(lèi)化合物濃度。 通常用于分析木質(zhì)素衍生酚類(lèi)化合物的傳統(tǒng)色譜方法較為復(fù)雜， Yan等[8]開(kāi)發(fā)了一種新的超高性能液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜法來(lái)分析木質(zhì)素中的酚類(lèi)物質(zhì)， 該方法基于聚合物吸附劑的固相萃取和反相色譜法進(jìn)行樣品凈化， 可分離所有木質(zhì)素衍生酚， 同時(shí)將來(lái)自共洗脫基質(zhì)成分的干擾降至最低。 對(duì)于超低木質(zhì)素酚濃度和高基質(zhì)干擾， 該方法具有穩(wěn)健性和適用性， 且簡(jiǎn)單快速的樣品制備與無(wú)需衍生的分析相結(jié)合， 使其適用于常規(guī)和大容量分析。 Sun等[31]設(shè)計(jì)了一個(gè)超高性能的超臨界流體色譜與二極管陣列檢測(cè)器的方法， 檢測(cè)由堿性氧化銅氧化木質(zhì)素衍生產(chǎn)生的酚類(lèi)化合物。 在對(duì)11種代表性單體木質(zhì)素酚類(lèi)化合物的分析中， 所有化合物在短時(shí)間內(nèi)清晰分離， 峰形極佳， 表明該方法可以對(duì)木質(zhì)素衍生酚類(lèi)化合物進(jìn)行定性和定量分析。

Lobbes等[32]使用反相高效液相色譜二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)了木質(zhì)素產(chǎn)生的酚類(lèi)物質(zhì)， 使用氧化銅氧化而產(chǎn)生的多種主要酚類(lèi)物質(zhì)被清晰、 快速地分離出來(lái)。 二極管陣列檢測(cè)也可檢測(cè)單個(gè)高效液相色譜峰內(nèi)的干擾雜質(zhì)， 使木質(zhì)素衍生酚得到了校正和量化。 江智婧等[33]使用反相高效液相色譜法來(lái)定量檢測(cè)玉米秸稈在蒸汽爆破環(huán)境下木質(zhì)素的降解物， 在經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)處理后， 得到的木質(zhì)素降解物的線性回歸方程具有良好的線性關(guān)系， 加標(biāo)回收率也都高于96%， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差也很低， 充分符合對(duì)于定量檢測(cè)木質(zhì)素降解物的要求。

1.4 核磁共振法

核磁共振譜圖法(NMR法)也應(yīng)用于木質(zhì)素降解后酚羥基的定量檢測(cè)， 主要的核磁共振譜圖有氫譜， 碳譜與磷譜。 核磁共振技術(shù)的發(fā)展使木質(zhì)素定量檢測(cè)邁上了一個(gè)新的臺(tái)階。 Tiainen等[34]提出了一種可靠的分析改性和未改性木質(zhì)素樣品的方法——1H核磁共振方法， 相較于紫外可見(jiàn)光譜法對(duì)鄰苯二酚單元環(huán)中的第二個(gè)芳族羥基檢測(cè)的限制， 核磁共振譜圖能很好地反映木質(zhì)素中酚羥基的存在。1H核磁共振方法是一種通用的方法， 不需要特殊的樣品制備， 弱酸性溶液洗滌即可用于檢測(cè)。

核磁共振譜圖的定量原理是基于譜圖中信號(hào)的峰面積與所檢元素(如31P)的數(shù)目存在正比關(guān)系， 所檢元素的化學(xué)性質(zhì)對(duì)檢測(cè)無(wú)影響， 只需對(duì)該化合物中指定基團(tuán)上質(zhì)子共振造成的峰面積進(jìn)行積分， 即可得到絕對(duì)含量[35]。 目前， NMR定量方法分為兩類(lèi)[36]， 其中， 外標(biāo)法是稱(chēng)取一定已知含量的標(biāo)準(zhǔn)品配成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液， 在同樣試驗(yàn)要求下， 標(biāo)準(zhǔn)曲線以濃度與特征峰面積作為橫縱坐標(biāo)制得， 得到待測(cè)溶液的NMR譜圖， 積分相應(yīng)的峰面積， 再代入曲線計(jì)算可以得到待測(cè)樣濃度。 而內(nèi)標(biāo)法則是用已知純濃度的標(biāo)準(zhǔn)物當(dāng)作內(nèi)標(biāo)物， 向待測(cè)樣溶液中添加已知量的內(nèi)標(biāo)， 由內(nèi)標(biāo)化合物特征峰面積與樣品中某一特征峰面積的比值即可計(jì)算樣品濃度。 內(nèi)標(biāo)法的計(jì)算公式為[37]

式中：mx為待測(cè)物含量， mg·L-1；mstd為內(nèi)標(biāo)含量， mg·L-1；Mx為待測(cè)物分子量；Mstd為內(nèi)標(biāo)分子量；Ax為待測(cè)物定量峰信號(hào)面積；Astd為內(nèi)標(biāo)物定量峰信號(hào)面積；nx為待測(cè)樣品定量峰包含的磷原子數(shù)；nstd為內(nèi)標(biāo)物包含的磷原子數(shù)。

31P NMR波譜分析技術(shù)因其獨(dú)特的表征能力和廣泛的潛在適用性， 使其成為一種頗具前途的羥基分析技術(shù)。 與傳統(tǒng)的化學(xué)分析技術(shù)相比， 定量31P NMR波譜分析技術(shù)在單譜高分辨率測(cè)定羥基含量方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。31P NMR在較短的時(shí)間內(nèi)以及采用30 mg的樣品即可提供完整的定量信息[38]。 Faleva等[39]將31P NMR光譜法用于檢測(cè)和定量云杉和樺木韌皮部木質(zhì)素游離酚羥基， 對(duì)于云杉韌皮部-二惡烷木質(zhì)素， 游離酚羥基的含量很高(占木質(zhì)素重量的10%)， 大部分酚羥基來(lái)自于愈創(chuàng)木基和對(duì)羥苯基單元， 同時(shí)， 兒茶酚型和對(duì)羥基苯基型游離酚羥基在云杉韌皮部木質(zhì)素組成中有著很大的占比。 Argyropoulos等[9]使用磷化試劑(1,3,2-二氧磷雜環(huán)戊烷氯化物)以及弛豫試劑(乙酰丙酮酸鉻)處理樣品， 采用內(nèi)標(biāo)法定量檢測(cè)木質(zhì)素的酚羥基含量。 此法可以發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素三種前體類(lèi)型中酚羥基在制漿過(guò)程降解的特點(diǎn)且測(cè)得其含量。 核磁共振磷譜的定量分析無(wú)需待測(cè)樣的標(biāo)準(zhǔn)物， 而且原理簡(jiǎn)單， 準(zhǔn)確度較高。 但核磁共振磷譜的定量也存在一些不足， 比如靈敏度不高， 對(duì)微量成分進(jìn)行準(zhǔn)確定量仍存在難度； 并且核磁共振設(shè)備的普及率遠(yuǎn)不及其他色譜儀器， 導(dǎo)致磷譜的定量技術(shù)發(fā)展緩慢。

13C NMR波譜分析技術(shù)在提供木質(zhì)素詳細(xì)結(jié)構(gòu)信息方面具有重要的潛力， 特別是二維核磁共振技術(shù)的出現(xiàn)， 大大擴(kuò)展了木質(zhì)素結(jié)構(gòu)分析的前景。 同時(shí)，13C NMR在定量測(cè)定木質(zhì)素不同結(jié)構(gòu)單元含量中是必不可少的方法[40]。 乙?；举|(zhì)素的酚乙酰基可以通過(guò)核磁共振波譜技術(shù)進(jìn)行測(cè)定， Robert等[10]用亞硫酸鹽蒸煮液在不同條件下對(duì)楊木木材樣品進(jìn)行蒸汽爆炸處理， 以氘代二甲基亞砜為溶劑， 將純化后的木質(zhì)素磺酸鹽通過(guò)13C-NMR定量。 將分析數(shù)據(jù)與元素分析和甲氧基分析相結(jié)合， 對(duì)木質(zhì)素蒸汽爆炸過(guò)程中的酚羥基變化進(jìn)行了綜合描述， 并給出了磺化程度的信息。 Capanema[41]等結(jié)合NMR技術(shù)， 提出了一種用于量化磨木木質(zhì)素(MWL)中不同木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的詳細(xì)方法。 該方法發(fā)現(xiàn)未乙酰化和乙?；脑粕糓WL的1H-13C異核多量子相干性和定量13C NMR具有協(xié)同作用， 從而在通過(guò)NMR表征木質(zhì)素部分方面取得了重大進(jìn)展。

1H NMR波譜分析技術(shù)是根據(jù)氫譜中不同質(zhì)子的化學(xué)位移、 偶合常數(shù)及峰的裂分情況來(lái)分析某些官能團(tuán)的特定質(zhì)子， 并測(cè)出各種官能團(tuán)中氫質(zhì)子的數(shù)目之比， 這對(duì)推斷結(jié)構(gòu)式至關(guān)重要。 氫譜的優(yōu)點(diǎn)是譜圖中氫的積分峰面積正好跟氫原子數(shù)是正比關(guān)系， 精準(zhǔn)度遠(yuǎn)高于紫外可見(jiàn)光譜。 Li等[11]深入研究了采用1H NMR技術(shù)以解析木質(zhì)素結(jié)構(gòu)并估算云杉磨木木質(zhì)素中不同結(jié)構(gòu)酚羥基的含量， 如5-5’、 β-O-4、 β-5’、 醛基、 羧基等。

對(duì)于上述三種核磁共振(磷譜、 碳譜和氫譜)定量方法， 楊喻[42]從測(cè)定結(jié)果、 測(cè)定結(jié)構(gòu)和測(cè)定條件等方面總結(jié)評(píng)價(jià)了它們的優(yōu)缺點(diǎn)。 從測(cè)定結(jié)果方面看：1H NMR法、13C NMR法與31P NMR法測(cè)定得到的酚羥基含量均很接近，1H NMR法和13C NMR法準(zhǔn)確性高。 從測(cè)定條件方面看：31P NMR法雖然測(cè)定時(shí)間短(9 min左右)， 但在測(cè)定時(shí)所需磷化試劑TMDP購(gòu)買(mǎi)周期很長(zhǎng)且價(jià)格昂貴， 若自制磷化試劑因其毒性大、 操作復(fù)雜而難以快速檢測(cè)； 而且制樣樣品極不穩(wěn)定， 需要現(xiàn)配現(xiàn)測(cè)。13C NMR法則需要較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間(9 h左右)才能夠得到質(zhì)量較好的核磁譜圖， 且需要70～100 mg樣品。1H NMR法測(cè)定木質(zhì)素樣品則需使用少量(2 mg左右)的干燥木質(zhì)素樣品用于檢測(cè)， 且檢測(cè)時(shí)間僅需30 min左右便可得到譜圖。 所以綜合來(lái)看，1H NMR法是一種快速準(zhǔn)確、 節(jié)約樣品、 無(wú)毒無(wú)害的定量測(cè)定木質(zhì)素酚羥基結(jié)構(gòu)含量的方法。

除了核磁共振磷譜、 碳譜和氫譜定量檢測(cè)， 近年來(lái)氟譜的發(fā)展也不容忽視。 Esakkimuthu等[43]選擇含酚和脂族羥基的木質(zhì)素模型化合物進(jìn)行氟芐基化反應(yīng)， 所得反應(yīng)介質(zhì)用13C和19F核磁共振譜分析。 模型化合物結(jié)果顯示酚羥基完全衍生化， 而脂肪族羥基的轉(zhuǎn)化率最低， 并證實(shí)19F核磁共振化學(xué)位移從1.15×10-4到1.17×10-4對(duì)應(yīng)的是酚基。19F核磁共振分析可以成功地應(yīng)用于氟芐基化后的有機(jī)溶劑商業(yè)木質(zhì)素， 以確定其酚基含量。 Esakkimuthu[44]將5種工業(yè)木質(zhì)素的羥基衍生乙?；c氟衍生方法(氟芐基化和氟苯甲?；?進(jìn)行比較， 通過(guò)電導(dǎo)和電位滴定， 氨解-氣相色譜， 紅外和差示紫外可見(jiàn)光譜以及(1H，13C，19F和31P)NMR光譜法對(duì)羥基官能團(tuán)進(jìn)行定量。 氟衍生化增加了木質(zhì)素在溶劑中的溶解度并改善了色譜結(jié)果， 且可對(duì)羥基官能團(tuán)進(jìn)行精確定量。

1.5 氣相色譜-質(zhì)譜法

單獨(dú)使用氣相色譜可對(duì)酚類(lèi)化合物進(jìn)行高效分離與鑒別， 而質(zhì)譜的加入使其鑒別更加精準(zhǔn)， 可以對(duì)其中酚類(lèi)化合物逐個(gè)作出定性鑒別與定量分析。 Ma等[45]使用頂空固相微萃取技術(shù)與氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(GC-MS)， 將每種揮發(fā)物的峰面積與總峰面積進(jìn)行比較， 對(duì)鑒定出的揮發(fā)油進(jìn)行半定量， 按照歸一化方法得到揮發(fā)性化合物的相對(duì)百分比含量， 可以初步鑒定并確定58種揮發(fā)性化合物(包括苯酚在內(nèi))。 Pierce等[46]介紹了一種用氣相色譜/質(zhì)譜法分析苯酚等物質(zhì)的方法。 這種衍生技術(shù)是通過(guò)提高色譜性能和在分析物中引入可追蹤的基團(tuán)， 進(jìn)而提高分析的靈敏度。 通過(guò)選擇性地使用離子監(jiān)測(cè)， 該方法可適用于苯酚的定量分析。 Fang等[12]以商業(yè)木質(zhì)素磺酸鈉在溫和條件下的解聚溶液為基礎(chǔ)， 使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀很好地建立了一種用于表征實(shí)際木質(zhì)素解聚產(chǎn)物的改進(jìn)方法， 該方法能夠檢測(cè)主要的37種木質(zhì)素基芳香族產(chǎn)物， 通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 根據(jù)相對(duì)峰面積對(duì)這些近似產(chǎn)品進(jìn)行量化評(píng)估。

1.6 氣相色譜法

酚類(lèi)化合物具有高極性、 高沸點(diǎn)以及鄰、 對(duì)甲酚之間的分離困難等特點(diǎn)， 使得它們的氣相色譜分析變得困難。 大多數(shù)低分子量的單官能團(tuán)酚具有足夠的揮發(fā)性用于氣相色譜分析， 但是它們會(huì)帶來(lái)寬尾峰。 這些化合物在微量水平上的分析通常受到它們?cè)谥械奈健?“重影”現(xiàn)象以及一些氣相色譜檢測(cè)器的低靈敏度的限制。 另外由于酚羥基的極性， 很難對(duì)這些化合物進(jìn)行分析， 這極易導(dǎo)致樣品制備過(guò)程中分析物的損失。 為了克服這些缺點(diǎn)， 酚羥基通常選用合適的衍生試劑進(jìn)行衍生， 衍生后的酚羥基可產(chǎn)生更尖銳的峰， 使樣品得到更好的分離和更高的靈敏度。 此外， 合適的樣品制備程序也至關(guān)重要， 如微萃取技術(shù)和衍生反應(yīng)[47]。 微萃取方法因其簡(jiǎn)單、 環(huán)保和低成本的特點(diǎn)而作為經(jīng)典萃取和樣品制備方法。 曾家源等[48]采用固相萃取-氣相色譜法一次性檢測(cè)定量了多種酚類(lèi)化合物， 整個(gè)過(guò)程不需要衍生反應(yīng)， 工藝簡(jiǎn)易， 準(zhǔn)確度也很高。 工程中采用的是固相萃取柱富集， 使用外標(biāo)法定量分析， 繪制的曲線具有良好的線性關(guān)系。

氣相色譜法(GC法)用于定量測(cè)定酚羥基是基于化學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上， 對(duì)其衍生的氣體進(jìn)行測(cè)定的方法， 其主要包括氨解法與高碘酸鹽氧化法。 其中， 氨解法需要對(duì)樣品進(jìn)行乙?；?， 選用的試劑一般為吡咯烷。 對(duì)于木質(zhì)素降解物的酚羥基定量測(cè)量， 首先將木質(zhì)素降解物進(jìn)行乙?；磻?yīng)， 由于乙?；竽举|(zhì)素產(chǎn)物在進(jìn)行氨解反應(yīng)時(shí)會(huì)很快斷裂酚乙酰基， 而此時(shí)脂肪族乙?；鶖嗔阉俣冗^(guò)慢可忽略不計(jì)， 氣相色譜一開(kāi)始檢測(cè)到的1-乙酰吡咯烷的量， 對(duì)其進(jìn)行換算即可得到酚羥基的含量。 由于脂肪族乙?；陌狈纸鈺?huì)導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果不是非常精準(zhǔn)， 相比于上述的一些方法， 此法也存在不足， 例如測(cè)定過(guò)程不簡(jiǎn)便， 檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等。 木質(zhì)素中羥基的總量通過(guò)乙?；瘶悠返耐耆砘?氫氧化鈉)， 然后用氣相色譜法測(cè)定釋放的乙酸及其芐酯的量來(lái)估算[13]。 而高碘酸鹽氧化法， 主要是采用高碘酸鹽作為氧化劑， 對(duì)木質(zhì)素降解物的酚羥基(木質(zhì)素結(jié)構(gòu)中甲氧基與酚羥基是鄰位)進(jìn)行氧化， 產(chǎn)生甲醇， 然后通過(guò)氣相色譜法對(duì)其進(jìn)行定量測(cè)定， 最后換算成木質(zhì)素降解物中酚羥基的含量。 由于高碘酸鹽的氧化性較強(qiáng)， 對(duì)樣品的要求降低， 可檢測(cè)大多數(shù)木質(zhì)纖維原料中的酚羥基含量[49]。 正如上述所言， 酚羥基與甲氧基相鄰才能被檢測(cè)到， 若某些鄰位缺少甲氧基(例如對(duì)羥苯基與兒茶酚型酚羥基等)， 則其無(wú)法被檢測(cè)到， 導(dǎo)致該方法存在一定的局限性。 Lai等[14]使用高碘酸鈉溶液對(duì)云杉和白楊木進(jìn)行氧化， 通過(guò)定量檢測(cè)甲醇揮發(fā)量來(lái)?yè)Q算木質(zhì)纖維原料中酚羥基的具體含量， 經(jīng)過(guò)對(duì)比， 使用高碘酸鹽氧化定量檢測(cè)的兩種木質(zhì)原料的酚羥基量與氨解法測(cè)量得到的基本一致。

2 展 望

上述對(duì)于測(cè)定木質(zhì)素降解過(guò)程產(chǎn)生的酚羥基物質(zhì)含量的方法各有優(yōu)缺點(diǎn)， 研究人員在實(shí)際應(yīng)用時(shí)須根據(jù)樣品的性質(zhì)及研究目的加以選用。 紫外可見(jiàn)光度法可以直接快速通過(guò)光譜掃描， 經(jīng)簡(jiǎn)單的計(jì)算即可得到酚羥基含量， 前提是樣品需要進(jìn)行稀釋。 由紫外可見(jiàn)光度法衍生的Folin-ciocalteu法在酚羥基定量應(yīng)用廣泛， 測(cè)定結(jié)果比紫外可見(jiàn)光度更為精準(zhǔn)， 前期需要使用FC試劑與樣品溶液混合反應(yīng)， 測(cè)定步驟稍復(fù)雜。 傳統(tǒng)的電導(dǎo)滴定與電位滴定法， 步驟較少， 操作便捷， 相對(duì)其他方法存在操作性誤差， 況且不同來(lái)源的木質(zhì)素以及降解產(chǎn)物很難溶于同一溶劑體系， 從而造成操作難度與誤差。 氨解-氣相色譜法與高碘酸鹽-氣相色譜法則是將酚羥基進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)， 再通過(guò)間接手段進(jìn)行檢測(cè)； 由于不是直接測(cè)量， 所以其缺乏系統(tǒng)性的實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化。 高效液相色譜法則要求所測(cè)物質(zhì)成分不能過(guò)于復(fù)雜， 使得實(shí)際測(cè)量受到了一定的局限。 對(duì)于氣相色譜， 大部分需要將羥基衍生化使其更好分離與更加靈敏， 這些都亟需進(jìn)行深入的研究， 而核磁共振譜圖中的氫譜不僅可以精準(zhǔn)快速環(huán)保的對(duì)酚羥基的含量進(jìn)行定量， 還可節(jié)約樣品。 磷譜樣品不穩(wěn)定、 磷化試劑昂貴； 碳譜檢測(cè)時(shí)間稍長(zhǎng)； 氟譜需將其氟芐基化。 經(jīng)綜合比較， FC法與核磁共振氫譜法優(yōu)勢(shì)較多， 在進(jìn)行酚羥基含量的檢測(cè)工作中可以優(yōu)先選取。 此外， 可以多種方法組合使用， 以及尋找酚羥基特定衍生化方法、 酚類(lèi)物質(zhì)高效檢測(cè)或?qū)ζ涔倌軋F(tuán)進(jìn)行特異性識(shí)別等改進(jìn)方法， 對(duì)木質(zhì)素降解后酚羥基的定量體系的建立和完善具有重大意義。