不同來源有色溶解性有機物光化學/微生物降解過程*

張怡晅，龐 銳，任源鑫，程丹東

(1：西北大學城市與環(huán)境學院，陜西省地表系統(tǒng)與環(huán)境承載力重點實驗室，西安 710127) (2：英國伯明翰大學，地理、地球和環(huán)境科學學院，伯明翰 B15 2TT)

有色可溶性有機物(chromophoric dissolved organic matter, CDOM)是廣泛分布于自然水體中的一類成分和結構復雜、含有多種高活性化學官能團的大分子聚合物，是水體溶解有機物(dissolved organic matter, DOM)的重要組分，對水生生態(tài)系統(tǒng)健康、能量流動及生物地球化學循環(huán)有重要影響[1-2]. CDOM含有光特性基團因而具有光吸收特性，能有效吸收紫外輻射，從而保護水生生物；CDOM與生物地球化學循環(huán)密切相關，為水生生態(tài)系統(tǒng)中細菌和浮游植物生長供應營養(yǎng)；CDOM作為全球碳庫的關鍵組成部分，由于復雜的來源、組成和分子結構，其遷移轉化過程也是全球碳循環(huán)中的重要環(huán)節(jié)[3-5]. 因此，CDOM遷移轉化機理及影響因素受到了越來越多的關注[6-7]. 光化學反應和微生物代謝過程被認為是控制水體CDOM轉化和降解的主要因素. 研究表明，光化學轉化過程通過改變CDOM的生物利用度來促進或抑制微生物代謝，影響CDOM的轉化與降解[8]. 例如，光化學降解將大分子CDOM轉化為易于被微生物利用的小分子有機物，提高CDOM的微生物代謝[9-10]. 生物代謝通過釋放CDOM增加DOM光化學活性[11-12]. 同時，光照會降低光敏性微生物的豐度，從而抑制CDOM的微生物代謝[13-14].

CDOM的光反應性和生物活性都與其組成、來源和化學特性有關[15]. 研究表明，微生物代謝和光化學降解都可能在水體中競爭CDOM轉化和分解[16]. 然而，由于不同的結構特征，一些CDOM(如內源CDOM)更容易被微生物消耗，但難以被光化學降解，而另一些(如芳香族腐殖質)則呈現相反的可利用模式[15]. 此外，微生物趨向優(yōu)先消耗非有色DOM[17]. 快速發(fā)展的城市化改變了CDOM的輸入途徑，城市排污管道溢流、非透水地面形成的徑流及城市中大面積的景觀草地向水體提供大量獨特的有機物，如生物可利用度高的CDOM[18]. 城市水體中高度動態(tài)化的CDOM反映了不同來源CDOM在不同時空尺度下的相互作用和非線性混合及其轉化的范圍與程度[19]. 這些獨特的CDOM在轉化過程中消耗氧氣，對生態(tài)系統(tǒng)功能，如氮的循環(huán)分解，產生顯著影響[20]. 而城市非點源輸入對水體CDOM的遷移轉化的影響，以及城市水體不同來源CDOM轉化與降解過程在微生物和光化學作用之間關系的重疊程度研究較少. 為了滿足水質監(jiān)管要求，厘清城市水體復雜的CDOM遷移轉化過程是至關重要的，不僅有利于評估城市流域碳循環(huán)過程，也有助于對城市流域的可持續(xù)開發(fā)與管理.

伯明翰是英國除倫敦外最大的城市，人口密集，也是典型的工業(yè)城市[21]. 作為全國運河網的交匯點，伯明翰擁有多種不同類型的水體. 由于多樣的流域環(huán)境以及人類活動，其城市水體中的CDOM來源與組成更為復雜且更容易受到影響[20]. 因此，為解析城市化水體非點源輸入對CDOM濃度及組成的影響，闡明光化學過程和微生物代謝對不同城市水體CDOM降解與轉化的貢獻，本研究在英國伯明翰選擇了3種不同的城市水體. 通過實驗室光化學和微生物控溫培養(yǎng)，揭示光化學及微生物影響下CDOM特性的變化，比較分析光化學或/和微生物優(yōu)先利用的CDOM組分. 以期為不同城市水體CDOM來源及活性差異特征研究提供了新的思路，針對光化學和微生物處理過程中CDOM特性的改變方式形成了新的認識，結果對研究全球城市化快速發(fā)展背景下城市流域碳循環(huán)及水陸界面碳交換也具有重要的理論意義.

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)域概況

本研究選取英國伯明翰市內3類具有代表性的典型DOM來源水體，分別是布恩河(B，城市河流)、韋爾湖(V，城市湖泊)以及埃德巴斯頓湖(E，非城市湖泊)(圖1). 布恩河位于伯明翰市區(qū)(52°26′51"N, 1°55′49"W)，流經伯明翰大學，上游沒有直接的污染源，但是接受城市雨水和合流污水系統(tǒng)溢流. 韋爾湖位于布恩河支流查德河下游，屬于人工湖，西側毗鄰學生公寓，東側為城市公園. 埃德巴斯頓湖四周環(huán)境以森林草地為主. 該湖泊及其周邊地區(qū)因其多樣的林地和濕地棲息地而被授予具有特殊科學價值的地點(SSSI)地區(qū). 于2016年6-7月在點位B、V及E分別采集表層(0～10 cm)水樣，每個點位多點水樣采集并混合后置于2 L聚乙烯采樣瓶中4℃避光冷藏運回實驗室，用0.22 μm聚碳酸酯濾膜(Millipore)過濾[13,22]，并保存于-20℃ 的黑暗環(huán)境中直至分析. 現場用Hanna便攜式水質測試儀與YSI ODO測試儀測定水溫(T)、pH、電導率(EC)以及溶解氧(DO)等參數(表1).

圖1 采樣點分布示意圖Fig.1 Map of the study area showing the location and station name of the sampling sites

表1 各點位基本水質指標

1.2 光/微生物降解實驗設計

培養(yǎng)實驗分為4組(表2),分別考察不同類型水體的CDOM的光降解、微生物降解，以及光-微生物聯(lián)合降解作用. 簡而言之，將各樣點經過0.22 μm濾膜過濾后的水樣等量(100 mL)置于事先經過10% HCl潤洗的玻璃培養(yǎng)瓶中，在需要微生物的處理的水樣中加入2 mL取自布恩河并經過2.7 μm孔徑濾膜過濾后的接種水[22]. 不需要光照的樣品瓶用鋁箔包裹，以避免光輻照. 各降解培養(yǎng)體系均為三樣平行培養(yǎng)(n=36)，在實驗室培養(yǎng)箱光照恒溫條件下((25000±2500) lx, 25℃)進行為期9天的培養(yǎng).

表2 光/微生物降解室內培養(yǎng)實驗設置

1.3 樣品分析方法

水體葉綠素采用D3731-87(2004)標準和Dos Santos等[23]所述的丙酮萃取法提取和測定，取樣點背景值見表1. 通常使用350 nm處的吸收系數(A350)來表示CDOM的相對濃度. CDOM吸收光譜使用FENAC UV-vis紫外-可見分光光度計進行測定，以Milli-Q水為空白，掃描波長范圍為200～500 nm.A350可根據公式(1)計算：

aλ=2.303Aλ/L

(1)

式中，λ為波長，nm；aλ波長λ處的吸收系數，m-1；L為光程路徑，cm；Aλ為波長為λ處的吸光度，m-1. 根據Helms等[24]，光譜斜率S可由公式(2)計算：

aλ=aλrefe-s(λ-λref)

(2)

式中，aλ和aλref分別為水樣在波長λ和λref處的吸收系數，在本研究中計算波長范圍為275～295 nm(S275～295)和350～400 nm(S350～400)，兩者比值為光譜斜率比值SR，與CDOM相對分子量呈負相關.

三維熒光光譜(EEM)采用Cary Eclipse熒光分光光度計(安捷倫技術公司)進行測定，使用1 cm石英比色皿，以Milli-Q水為空白，激發(fā)波長(Ex)為200～400 nm，間隔5 nm，發(fā)射波長為280～500 nm，間隔2 nm；掃描速度為9600 nm/min，狹縫寬度為5 nm. 所有的樣品需要去除拉曼及瑞利散射，并減去Milli-Q水的EEM. 熒光指數(FI)、腐殖化指數(HIX)以及自生源指數(BIX)分別用來指示CDOM來源，腐殖化程度以及內源物質對CDOM的相對貢獻[25]. 采用MATLAB2016軟件中的DOMFluor工具箱通過平行因子分析法(PARAFAC)進行CDOM組分分析. PARAFAC分析的原理是將EEMs數據集分解為一系列的三線性項和殘差數矩陣，并使殘差平方和最小化，通過對半檢驗、殘差和負荷分析確定種熒光組分模型并進行驗證.

1.4 統(tǒng)計分析

三維熒光光譜、平行因子分析和各熒光參數指標的分析由MATLAB2016完成. 利用R4.0.5進行統(tǒng)計分析，包括平均值和標準差的計算、正態(tài)分布檢驗、相關性分析、主成分分析(PCA)、方差分析等，P<0.05表示差異顯著. 采樣點分布圖采用ArcGIS 10.1繪制.

2 結果與分析

2.1 初始水體性質分析

2.1.1 平行因子分析結果 利用PARAFAC模型對三維熒光光譜進行解析，所得4組分模型C1～C4能很好地通過對半檢驗(圖2). 在Openfluor數據庫(https://openfluor.lablicate.com/)[26]中進行匹配，選擇Tucker收斂系數(TCC)高于0.95判定熒光組分的具體物質(表3). 其中，組分C1(Ex/Em=<250，345/458 nm)為外源輸入的類腐殖酸，分子中含有很大比例的芳香族碳；組分C2(Ex/Em=<250，295/386 nm)歸為微生物代謝產物的類腐殖酸，由有機物經過微生物降解后產生，與M峰類似，具有一定的自生源特征，在污水、農業(yè)等環(huán)境中較為常見；組分C3(Ex/Em=<250，285/400 nm)為類腐殖酸和類色氨酸混合物，可代表光/微生物降解的產物；組分C4(Ex/Em=<250，280/322 nm)代表類蛋白質中的酪氨酸組分，主要由水生生物或微生物的新陳代謝作用產生，代表內源CDOM.

圖2 平行因子分析得到的4個組分EEMs及載荷Fig.2 Fluorescent spectra and loadings of the four PARAFAC models

表3 OpenFluor數據庫中PARAFAC組分及最大TCC值

2.1.2 不同水體CDOM組成和光學特征 不同水體之間CDOM特征光學參數初始值(t0)見表4. 采用A350表征CDOM相對濃度，各水體間CDOM濃度具有顯著差異，其中湖泊中的A350高于河流，非城市湖泊E點位的A350高于城市湖泊. 非城市湖泊E點位的CDOM相對濃度顯著高于典型城市河流B點位(ANOVA,P<0.001). 這是由于非城市湖泊接受周圍土壤輸入大量有機物，且藻類活動明顯，導致CDOM在湖泊水體累積[25]. 研究認為254 nm處的紫外吸收值(SUVA254)與芳香烴含量呈正比[31]. 本研究中，城市河流B點位的SUVA254明顯高于湖泊(ANOVA:P<0.05)，芳香族化合物濃度較高，說明城市河流受城市化影響顯著，接受污水管道溢流，導致更多芳香族化合物在此區(qū)域積累[25]. 熒光光譜特征參數(FI、BIX和HIX)被用來表征CDOM組分的來源，但其統(tǒng)計學差異并不顯著. 基于CDOM各熒光組分占比，非城市湖泊E點位的陸源腐殖類熒光組分(即C1)貢獻較高，類蛋白質組分占比較低，其CDOM主要源于土壤滲流及地表徑流輸入，受人類活動影響小，代表陸源主導的非城市水體. 而城市湖泊有較強的自生源特征，自生源特征腐殖質(C2)及類蛋白質組分(C4)占比高，為典型城市水體. 最新研究發(fā)現，受人類活動影響的水體中存在類似的生物熒光成分富集現象[7,32]. 與非城市湖泊相比，城市湖泊由于受到人類活動的影響，CDOM來源及組成都相對復雜，這與Lv等[20]的研究結果一致. 而城市河流中陸源腐殖質及自生源腐殖質占比相當，具有混合源的特征，受人類活動影響強烈. 雖然城市河流CDOM濃度較低，但是含有豐富的芳香烴，且由于較短的水力滯留時間，CDOM活性也較高[33].

表4 不同水體的CDOM濃度和光學特征1)

1)數據呈現形式為：均值(標準差)；NS：P>0.05；*: 0.05>P>0.01；**: 0.01>P>0.001；***：P<0.001.

2.2 光/微生物降解過程中CDOM濃度和組成及特征光學參數的變化

2.2.1 不同水體CDOM特征參數的變化 不同培養(yǎng)實驗體系中，不同水體CDOM特征光學參數變化如表5所示. 培養(yǎng)前后不同點位各處理組間的A350及光譜斜率比SR的差異均具有統(tǒng)計學意義(表6). 雖然在培養(yǎng)過程中未發(fā)現FI有明顯變化趨勢，但HIX以及BIX均在9 d的培養(yǎng)實驗中出現明顯的變化. 結果說明在培養(yǎng)過程中，光/微生物對CDOM濃度及組成具有顯著影響，且與CDOM的組成及來源有關. 有趣的是，雖然在初始階段，各水體中的葉綠素含量差異并不顯著，但是反應結束時，不同處理的培養(yǎng)體系中葉綠素濃度(Chl.a)出現明顯的差異(P<0.001)(表5)，意味著光合細菌活動明顯且與培養(yǎng)方式有關.

對于光降解培養(yǎng)體系，各水體中A350均顯著降低，表明CDOM發(fā)生顯著降解. 其中，城市河流CDOM的降解率最高，為16.60%；非城市湖泊CDOM的降解率為15.31%，而自生源主導城市湖泊中CDOM降解率最低為12.03%. 隨著CDOM濃度下降，不同水體的SR相較于未透光的對照組均呈現增加，表明光化學作用可將大分子量的CDOM分解為小分子的有機物[34-35]. 不同水體的HIX值在光照過程中都發(fā)生了顯著的降低，說明CDOM腐殖化程度不斷下降. 結合BIX的變化，光照前后，河流水體中CDOM從較強腐殖化特征向自生源特征轉變. 一方面，相較于靜態(tài)的湖泊水體，河流由于較短的水力滯留時間，其CDOM活性較高. 另一方面，相較于城市湖泊，陸源主導的非城市湖泊CDOM含有豐富的芳香性碳，具有更強的光化學活性[16].

表5 不同培養(yǎng)體系中水體CDOM光學參數特征*

表6 重復方差分析的結果*

2.2.2 不同水體CDOM熒光組分變化特征 不同培養(yǎng)體系中CDOM熒光組分變化如圖3所示. 與CDOM相對濃度相似，所有熒光組分均在9 d的培養(yǎng)實驗中出現明顯的變化(P<0.001). 結果進一步說明光/微生物降解作用依賴于CDOM初始的濃度及組成的不同水平[36].

在本研究中，熒光強度以百分比(%Ci)表示，以減少CDOM濃度的影響[7]. 在光降解培養(yǎng)體系中，非城市湖泊、城市湖泊及城市河流CDOM中陸源腐殖質熒光組分C1的相對豐度都顯著降低(P<0.05)，分別降低了6.33%、4.02%和20.16%. 陸源腐殖質類CDOM比微生物來源的有機物相對更具光反應性，這是由于大分子富里酸和腐殖酸中存在多種苯環(huán)及共軛體系等光敏結構，易吸收紫外光而發(fā)生光化學反應[16,22]. 對于微生物培養(yǎng)體系，各水體CDOM中C1占比變化并不顯著. 陸源腐殖質組分一般以芳香族化合物為主，常被認為是生物難降解的[37]. 而對于光-微生物聯(lián)合培養(yǎng)體系，非城市湖泊中C1組分相對豐度的減少顯著高于光降解培養(yǎng)體系，為9.63%. 表明光降解和微生物代謝這兩個過程通過協(xié)同作用提高了CDOM的降解速率，即光化學過程促進了生物代謝，反之亦然[38]. 而城市水體中這樣的差別并不顯著，進一步說明了城市化會影響光降解和微生物代謝對CDOM的協(xié)同作用. 對于與人為活動相關的微生物源腐殖質C2，湖泊水體在各培養(yǎng)體系中變化并不顯著. 但是城市河流中的C2占比發(fā)生了顯著的變化，在光降解培養(yǎng)體系，微生物培養(yǎng)體系以及光-微生物聯(lián)合培養(yǎng)體系中分別減少了20.71%、7.35%和16.89%. 進一步表明河流CDOM活性較高，這與之前的研究結果一致[37-38]. 微生物培養(yǎng)對不同水體CDOM中C3及C4組分相對豐度的影響并不顯著. 而在光降解培養(yǎng)體系中，城市湖泊與非城市湖泊水體CDOM中光/微生物降解產物C3分別增加了10.68%和5.92%. 且C3相對豐度在光-微生物聯(lián)合培養(yǎng)體系中的增加更為顯著，分別為11.62%和8.66%. 這是由于生物和光對CDOM的降解存在互利的作用，光照將腐殖質類CDOM分解成為易被生物利用的小分子有機物，促進了微生物的代謝[38]. 相較于靜態(tài)的湖泊水體，城市河流中類蛋白質組分C4的相對豐度在光降解培養(yǎng)體系中顯著增加了28.55%. 這可能是由于河流水體中原有的活性較高的類蛋白組分在光照過程中被加速“老化”轉化為難降解的狀態(tài)，出現類蛋白質類CDOM的累積現象[39-40]. 結果表明，CDOM光降解對微生物代謝有促進作用還是抑制作用取決于CDOM的濃度、組成以及來源.

圖3 不同培養(yǎng)實驗體系CDOM熒光組分變化特征(不同字母(a、b、c)表示差異顯著(P<0.05))Fig.3 Variation characteristics of four CDOM fluorescence components in difference incubation systems (Different letters (a, b, c) represent differences are significant at P<0.05)

2.3 光/微生物降解過程中不同水體CDOM組成及光學特征參數的主成分分析(PCA)

對不同培養(yǎng)實驗體系中各水體CDOM組成、光學特征參數以及葉綠素濃度進行主成分分析. 主成分1和2共同解釋了這些參數變化的73.7%(圖4). 主成分1(PC1)解釋了44.8%的變化，與類蛋白質物質C4、SR、BIX以及葉綠素濃度呈正相關；與類腐殖質物質C1及HIX呈負相關(圖4B). 主成分2(PC2)解釋了總方差的28.9%，與A350及類蛋白質組分C3呈正相關，與SUVA254呈負相關. 其中，類蛋白質組分C4與葉綠素濃度呈顯著正相關，說明生物代謝活動會生成小分子量的類蛋白質.

圖4 不同來源CDOM在各培養(yǎng)實驗中主成分分析得分圖(a)以及荷載圖(b)Fig.4 Principal component analysis scores plot (a) and loadings plot (b) for incubation systems

主成分分析得分圖可表示不同水體CDOM在各培養(yǎng)實驗體系之間的變化(圖4A). 城市河流B點位的CDOM與PC2顯示出強正負相關，高分子量的芳香族有機物含量高，表明該來源與城市生活污水有關. 經過9 d的培養(yǎng)，微生物活動及未透光的對照組中城市河流CDOM的變化并不明顯，與初始值存在強相似性，組成仍以強芳香性自生源特征腐殖質為主. 這是由于主導城市河流的自生源特征腐殖質由有機物經過微生物降解后產生，幾乎不含新鮮/不穩(wěn)定的組分[41]. 而經過光降解及光-微生物聯(lián)合培養(yǎng)，城市河流B點位的CDOM與PC1展現出了明顯的正相關，更趨向于小分子量的類蛋白質CDOM，表明城市河流CDOM的光化學活性高. 且城市河流中類蛋白質CDOM與葉綠素濃度呈顯著正相關(圖5A). 表明光照促進了城市河流中CDOM大分子陸源腐殖質降解成為小分子化合物促進微生物代謝生成類蛋白質類有機物[8,42]. 初始的城市湖泊CDOM與PC1呈正相關，表明新鮮的、低分子量的、低芳香烴的、不穩(wěn)定的CDOM占優(yōu)勢. 經過9 d的微生物培養(yǎng)，這些物質與PC1呈現出負相關，表明這一部分有機物的損失以及進一步降解增加的有機物腐殖質部分. 這與Hansen等[31]的研究結果一致，隨著CDOM的生物降解，低分子量的類蛋白質CDOM被優(yōu)先降解，從新鮮物質轉變?yōu)楦迟|. 而經過光照培養(yǎng)，城市湖泊CDOM特征變化較小，與PC2仍表現出微弱的負相關. 這表明光照后的CDOM組成與初始值類似，也進一步說明相較于類蛋白質CDOM，類腐殖質組分更具有光化學活性. 城市湖泊V點位的CDOM在光-微生物聯(lián)合培養(yǎng)中的變化與光照培養(yǎng)類似，并不明顯，組成仍以類蛋白質組分為主，且類蛋白質CDOM的變化與葉綠素濃度無顯著相關性(圖5B). 因此，城市湖泊CDOM中類蛋白質物質的累積是由于光照改變了類蛋白質組分結構，使其更難被微生物利用[38]. 表明光照會抑制類蛋白質組分主導的CDOM的微生物代謝過程[13-14]. 陸源主導的非城市水體CDOM(E)在微生物培養(yǎng)過程中，與PC1的負相關性增強，說明少量的類蛋白質組分被分解生成腐殖質[31]. 與對照組相比，經過光照的陸源主導CDOM由較高的負PC1荷載轉移到較高的負PC2荷載，表明腐殖質占比的減少. 這是由于腐殖質更具光化學活性[16]. 在光-微生物聯(lián)合培養(yǎng)中，由負PC1荷載轉移到負的PC2荷載，陸源主導的非城市水體CDOM逐步展現出具有高蛋白質組分的自生源特征但與葉綠素濃度無明顯相關性(圖5C). 這進一步說明了在經歷光照和生物同時影響時，CDOM組成的變化是非常復雜的.

圖5 不同水體類蛋白質CDOM占比與葉綠素濃度的關系： (A)城市河流B、(B)城市湖泊V和(C)非城市湖泊EFig.5 Relationships between the average percentage of protein-like components CDOM and chlorophyll concentration in different water bodies: (A) urban stream B, (B) urban lake V and (C) non-urban lake E

上述分析表明，由于CDOM成分復雜，對于來源與組成不同的CDOM，其光/微生物降解過程不同，產物也不盡相同. 與非城市水體相比，城市水體中CDOM呈現出自生源貢獻相對大于陸源輸入，并且蛋白質類和/或微生物類CDOM的比例相對較大，具有較強的生物活性. 而非城市水體CDOM的光反應性更強. 本研究是基于短期室內模擬實驗，初步分析光化學過程和微生物代謝對不同城市水體CDOM降解與轉化的貢獻，仍然缺乏對城市水體CDOM的光/微生物降解機理及其環(huán)境效應的深刻理解和定量估計，未來需要更多的受控實驗、長期現場監(jiān)測以及構建CDOM光/微生物反應過程模型，探究無機氮磷以及離子對CDOM組分生物降解的影響，提高我們對驅動CDOM轉化的基本機制及其在全球變暖中作用的理解.

3 結論

1) 城市河流由于接受上游污水排放及較短的水力滯留時間，含有豐富的芳香性碳，其CDOM光化學活性明顯高于湖泊CDOM.

2) 城市湖泊受人類活動影響，微生物熒光成分富集，自生源CDOM主導，由于富含氨基酸、碳水化合物以及糖類物質等，較非城市水湖泊CDOM更具生物活性. 而相較于城市湖泊，非城市湖泊由于接受周圍景觀土壤輸入的大量腐殖質類CDOM，光照對其降解轉化作用較為明顯.

3) 光化學過程和微生物過程對CDOM的轉化降解具有協(xié)同/抑制作用. 光照促進了陸源CDOM中大分子類腐殖質物質降解成為生物活性高的小分子化合物，刺激微生物代謝生成蛋白質類有機物；以類蛋白質物質為主導的自生源CDOM在光照過程中被轉化為難降解的狀態(tài)，生物活性降低，CDOM微生物代謝過程被抑制.