高功率半導(dǎo)體激光對復(fù)雜根管消毒效果的體外研究

周強(qiáng)強(qiáng) 韋曉玲 謝 玉 劉 輝

（上海市口腔醫(yī)院，上海市顱頜面發(fā)育與疾病重點(diǎn)實(shí)驗室，上海 200001）

眾所周知，根管治療的關(guān)鍵在于根管消毒，常規(guī)清理根管的方法包括機(jī)械預(yù)備和化學(xué)消毒，由于根管的解剖變異，常規(guī)的消毒方法難以徹底清理復(fù)雜根管系統(tǒng)內(nèi)的根管峽區(qū)、根尖分歧，側(cè)支根管等區(qū)域，殘留的細(xì)菌是導(dǎo)致根管治療失敗的主要原因[1]。大量研究都從治療失敗的根管中分離出糞腸球菌[2]。

有研究表明：高濃度NaClO 與細(xì)菌發(fā)生接觸后，對其有明確的殺滅作用，但NaClO 對根管系統(tǒng)中無法接觸到的細(xì)菌難以清除[3]。目前臨床上急需一種高效、徹底、針對復(fù)雜根管的消毒方法。隨著激光在口腔治療中的應(yīng)用發(fā)展，不同種類的激光被開發(fā)并應(yīng)用于根管消毒。這些激光在以往的研究中都被證明對根管消毒有一定作用[4]，其中半導(dǎo)體激光因具有波長短，穿透能力強(qiáng)，不易被水、牙釉質(zhì)、血液等口腔內(nèi)物質(zhì)吸收的特點(diǎn)，相較于超聲活化蕩洗和其他類型激光在消毒效果上有優(yōu)勢[5]。但目前大量研究局限于低功率半導(dǎo)體激光結(jié)合光敏劑的殺菌效果[6]，且多數(shù)是建立簡單根管感染模型來評估效果，由于根管生物膜是一種非常復(fù)雜的、有組織的實(shí)體，單根管年輕生物膜的研究可能過度簡化了這種生態(tài)現(xiàn)象，無法真實(shí)反映臨床中的殺菌效果，容易得到假陽性結(jié)果。

本研究利用錐形束 CT 篩選含有峽區(qū)的復(fù)雜根管，期望通過建立復(fù)雜根管感染模型，多維度地探討半導(dǎo)體激光在體外對復(fù)雜根管系統(tǒng)內(nèi)糞腸球菌的殺滅效果，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

錐 形 束 CT（CBCT Planmeca Pro-Max?3Dmax，芬蘭）；糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株凍干粉（ATCC29212，美國）； 機(jī)用鎳鈦銼（登士柏x·smart ? plus，美國）；半導(dǎo)體激光治療儀 （Doctor Smile? D5，意大利） ；掃描電子顯微鏡電鏡（SEM日立Hitachi 3400N，日本）、激光共聚焦顯微鏡（CLSM 尼康A(chǔ)1HD25，日本）； 厭氧培養(yǎng)箱（DY-2，中 國）；CystalspecTM比 濁 儀（Becton Dickinson，美國）。LIVE/DEADTMBacLightTM細(xì)菌活力檢測試劑盒（InvitrogenTML-7012，美國）

1.2 建立根管感染模型

1.2.1離體牙收集與處理 收集 2020 年6 月至12月期間于上海市口腔醫(yī)院因牙周病或正畸需要而拔除的人新鮮前磨牙、磨牙若干顆。患者均知情同意。離體牙的納入標(biāo)準(zhǔn)： 牙根完整、根尖孔發(fā)育完全、未行根管治療、 無裂紋。5.25%NaClO 浸泡消毒后，置于自制的托盤上，拍攝CBCT（見圖1），篩選含有峽部的牙齒42 顆（其中前磨牙21顆、磨牙21 顆）。用高速手機(jī)從釉牙骨質(zhì)界截冠，剩余牙根用機(jī)用鎳鈦銼（Protaper Universal）配合17%EDTA 常規(guī)操作預(yù)備根管，按照ISO 標(biāo)準(zhǔn)預(yù)備至06 錐度，30#，高溫高壓消毒后，使用復(fù)合樹脂封閉根尖孔。

1.2.2感染根管模型的建立 將糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)株凍干粉（ATCC29212，美國）常規(guī)復(fù)蘇后劃線接種于腦-心浸液 （ BHI） 瓊脂培養(yǎng)皿， 置于37℃、5% CO2厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h， 分離單菌落并接種于含有腦-心浸液肉湯培養(yǎng)基的無菌試管中，繼續(xù)37℃厭氧培養(yǎng)24 h。使用麥?zhǔn)媳葷醿x將菌液濃度調(diào)整到1×108CFU·mL-1，再將制備好的牙根浸沒于含有1×108CFU·mL-1的菌懸液中，連續(xù)厭氧培養(yǎng)21 d，每3 d 換液一次。培養(yǎng)結(jié)束后隨機(jī)抽取 2 個牙齒樣本， 用1 mL 無菌生理鹽水（NS）溶液沖洗根管，使用無菌紙尖收集沖洗液進(jìn)行接種培養(yǎng)24 h。將牙根縱向劈開進(jìn)行SEM 觀察；檢測感染根管模型是否建立成功。

1.3 實(shí)驗分組和根管消毒

將剩余40 個樣本隨機(jī)分為 4 組（n= 10），本實(shí)驗中各組的消毒處理方法見表1。

表1 各組根管消毒處理方法

各組NS 與NaClO 的沖洗液用量為1 mL，沖洗60 s，結(jié)束后無菌紙尖吸干根管。半導(dǎo)體激光模式設(shè)置為Endo-02 脈沖輸出、功率為2.5 W、光纖直徑200 μm，以2 mm/s 的速度從根尖螺旋移動10 s（激光輻射方法按照廠商提供的說明書進(jìn)行）。

1.4 根管消毒效果研究

1.4.1 菌落計數(shù)分析 各組處理后用1 mL 生理鹽水沖洗根管，每組各取06 錐度，25#無菌紙尖置于根管內(nèi)30 s，收集沖洗液培養(yǎng)，然后將無菌紙尖置于2.5 mL 的BHI 培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h 后按照1 000 倍比例稀釋，接種于BHI 瓊脂培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)24 h，計算各組形成的菌落數(shù)。殺菌率=（處理前菌落數(shù)-處理后菌落數(shù)）/處理前菌落數(shù)

×100%。

1.4.2 SEM 觀察根管峽區(qū)及內(nèi)壁 從采菌后的各組中隨機(jī)抽取1 個樣本，采用高速裂鉆沿牙根長軸方向制備出兩條較平行的深溝，不貫通到根管內(nèi)壁，劈開牙根，暴露根管壁及峽區(qū)。置于2.5% 戊二醛中4℃冰箱靜置固定24 h 后，依次用50%、70%、90%、100% 乙醇梯度脫水，每個梯度20 min，常溫下自然干燥，隨后粘膠、噴金，應(yīng)用掃描電鏡觀察牙冠剖面。

1.4.3 細(xì)菌活死染色及CLSM 觀察 使用LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability 試劑盒對剩余糞腸球菌生物膜樣本進(jìn)行染色。將各組牙根剖面向上放置于每孔含1 mL 生理鹽水的12 孔板中，使剖面完全浸于染液中，隨后每孔加入3 μL（SYTO 9/PI）1 ∶1 混勻的染色液，常溫避光孵育15 min，PBS 緩沖液沖洗3 次，立即使用CLSM 進(jìn)行觀察。每個樣本隨機(jī)選取5 個視野于20 倍鏡下進(jìn)行觀察，調(diào)整步長為10 μm，掃描層厚200 μm。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較用 LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)P= 0.05。

2 結(jié)果

2.1 糞腸球菌感染根管模型的建立

培養(yǎng)21 d 后，隨機(jī)抽取樣本的菌落培養(yǎng)24 h的結(jié)果顯示：根管內(nèi)壁大量糞腸球菌（圖2A）。SEM 觀察：糞腸球菌生物膜形成，表面玷污層存在（圖2B）；根管內(nèi)壁密集了大量的糞腸球菌，并阻塞了牙本質(zhì)小管開口?？v向劈開的根管內(nèi)壁可見細(xì)菌侵入牙本質(zhì)小管深層（圖2C、D）。

2.2 各組菌落計數(shù)結(jié)果

處理后菌落計數(shù)結(jié)果如表2 顯示：A、B、C組處理后菌落計數(shù)均小于D 組（P＜0.05），其中B組殺菌效果最好，殺菌率高達(dá)98.4%；A、D 組殺菌率低于B、C 組（P＜0.05）；單純使用激光組不如傳統(tǒng)沖洗液組的殺菌效果好（P＜0.05），見圖3。

表2 各組菌落計數(shù)及殺菌率（n=10， ±s）

表2 各組菌落計數(shù)及殺菌率（n=10， ±s）

注： *表示同組內(nèi)處理前后比較P＜0.05；abcd 表示不同組間兩兩比較P＜0.05。

組別菌落計數(shù)（CFU·mL-1） 殺菌率（%）處理前 處理后A 80.4±5.32 53.2±8.67* 33.89±9.35bcd B 85.2±6.06 1.40±1.34* 98.40±1.59acd C 85.2±4.32 14.6±4.93* 82.84±5.58abd D 85.6±3.51 82.4±2.30* 3.68±2.30abc

2.3 SEM 觀察根管內(nèi)壁細(xì)菌清除作用

觀察各組處理后根管內(nèi)壁糞腸球菌定植情況，SEM 結(jié)果如圖4 所示：0.9%NaCl 沖洗組（圖4D組）表面玷污層存在，表面大量糞腸球菌定植在，阻塞牙本質(zhì)小管開口；激光處理（圖4A 組）未能完全去除表面玷污層，仍有部分細(xì)菌殘留；5.25%NaClO 沖洗液處理組（圖4C 組）玷污層已被清除，根管壁平整無細(xì)菌，但牙本質(zhì)小管內(nèi)仍有少量細(xì)菌殘留；半導(dǎo)體激光聯(lián)合5.25% NaClO（圖4B 組）表面細(xì)菌和玷污層被完全清除，根管壁光滑平整，牙本質(zhì)小管開放，此外縱向切開的牙本質(zhì)小管內(nèi)無細(xì)菌附著。

2.4 CLSM 觀察細(xì)菌染色結(jié)果

染色后活菌發(fā)綠色熒光，死菌因菌膜受損被紅色熒光染色，三維重建 CLSM 圖像后進(jìn)行整合（見圖5）。經(jīng)Image-Pro Plus 6.0 軟件計算死細(xì)菌比例并進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示：0.9%NaCl 組（圖5D1）感染的根管系統(tǒng)顯示均勻的綠色熒光，紅色熒光幾乎未見，提示根管壁聚集大量糞腸球菌，細(xì)菌滲透深度達(dá)200 μm 以上；進(jìn)行不同處理后綠色熒光減弱，紅色熒光增強(qiáng)，提示各處理組與空白組相比，死菌比例均有明顯提高（P＜0.05，見圖6）；其中Diode 激光+5.25%NaClO（圖5B 組）綠色熒光信號最弱，紅色熒光強(qiáng)度信號最強(qiáng)（圖5B2），在各組中殺菌效果最好（P＜0.05）。

3 討論

現(xiàn)代根管治療的核心內(nèi)容是徹底清除根管內(nèi)的感染和嚴(yán)密的三維充填，而研究顯示目前所有的方法都不能完全清理位于RCI 的細(xì)菌生物膜。Estrela 針對1 400 顆恒牙的研究表明：RCI 在下頜第一磨牙的發(fā)生率最高，為87.9%，下頜第二磨牙、上頜第一磨牙的發(fā)生率分別為66.3%、60.8%[7]。本研究通過CBCT 篩選含峽區(qū)的離體牙，采用了連續(xù)培養(yǎng)3 周、簡單、標(biāo)準(zhǔn)化和重現(xiàn)性好的成熟單菌種生物膜系統(tǒng)，首次建立了復(fù)雜根管感染模型，多維度比較各分組間的殺菌效果，結(jié)果顯示：B 組激光聯(lián)合NaClO 沖洗液殺菌效果最好，殺菌率高達(dá)98.4%，說明激光聯(lián)合NaClO 沖洗液在復(fù)雜根管的消毒中可以取得較好地效果，與其他學(xué)者研究結(jié)果一致。單純次氯酸鈉和單純激光處理的殺菌率約為83%和34%，說明半導(dǎo)體激光可作為傳統(tǒng)消毒方法的補(bǔ)充，聯(lián)合使用可取得理想的殺菌效果，但尚不能取而代之。

半導(dǎo)體激光殺菌原理是光熱生物作用，通過瞬時局部高溫殺菌，但是有報道指出溫度升高可能導(dǎo)致牙本質(zhì)碳化，牙根變性和根尖周圍壞死等[8]。激光引起升溫的影響因素有激光類型，功率，頻率，波長、操作工作時間和方法等，且不同的解剖形態(tài)，牙根厚度，對溫度變化也有影響。有學(xué)者利用二極管激光輔助牙髓治療后檢測到牙根表面的溫度變化都控制在閾值以下，說明高功率二極管激光是安全的[9、10]。本研究中通過脈沖輻射、連續(xù)移動、間歇激光照射的方法，按照廠家推薦的使用方法，以減少周圍組織熱損傷。為避免熱損傷的出現(xiàn)，臨床使用中應(yīng)該嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作，控制激光照射時間，保證診療安全。

近年來，隨著各種輔助沖洗技術(shù)的臨床應(yīng)用，超聲活化蕩洗（PUI）因效果明確、操作簡單受到了較多的關(guān)注，超聲輔助沖洗的原理在于形成空穴效應(yīng)和聲流作用，前提都是沖洗液存在，Pacheco 的研究結(jié)果表明正壓沖洗、XP-endo Finisher、PUI 三種技術(shù)處理磨牙根管峽區(qū)，沖洗液分布面積沒有差異，可能由于沖洗液一旦在根管內(nèi)形成氣鎖作用，超聲就無法發(fā)揮作用[11]，而且超聲的高頻振動可能會把沖洗液推出根尖孔。大量研究都表明不管是超聲還是激光聯(lián)合傳統(tǒng)沖洗液，可以達(dá)到較好的根管消毒的效果，但兩者作為輔助根管消毒的方法并不對立，兩者之間的比較尚無定論[12、13]。最后，本實(shí)驗與以往大多實(shí)驗的建立簡單根管感染模型相比有一定進(jìn)步，但無法完全復(fù)制真實(shí)的根管系統(tǒng)，其結(jié)果有待高質(zhì)量的臨床研究加以驗證。

4 結(jié)論

綜上所述，高功率半導(dǎo)體激光聯(lián)合傳統(tǒng)次氯酸鈉沖洗液比兩者單獨(dú)使用具有更高的殺菌率，能夠有效清除復(fù)雜根管（含峽區(qū)）內(nèi)的細(xì)菌微生物，但激光尚不能取代傳統(tǒng)沖洗液在根管消毒中的作用，可作為傳統(tǒng)消毒方法的補(bǔ)充在臨床進(jìn)行推廣應(yīng)用。