超聲波-微波協(xié)同萃取豆蔻明工藝研究

◎ 劉佳哲，吳小芝，路 暢，張東娜，姜曉坤

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林 吉林 132001）

草豆蔻為姜科山姜屬植物草豆蔻的干燥近成熟種子，味辛、性溫，具有去異增香的作用。草豆蔻一般作為食品香辛料添加劑，適用于香辛料和調(diào)味品的生產(chǎn)、流通、使用[1-2]。草豆蔻中含有的豆蔻明具有抗炎、抗菌、抗血小板聚集、抗氧化等多種生物活性[3-5]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料與試劑

草豆蔻（市購(gòu)，無(wú)腐爛變質(zhì)）；動(dòng)物血液（市購(gòu))；無(wú)水乙醇（天津市鼎盛鑫化工有限公司）；豆蔻明標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司）。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

AL-2045電子天平（上海菁海儀器有限公司）；HH-4恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；SY-720超聲波清洗機(jī)（昆山超聲儀器公司）；BCD-221WDPT冰柜（青島海爾股份有限公司）；DHL-820A恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；H2050R高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀試驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；UV-721PC紫外分光光度計(jì)（上海馳唐儀器設(shè)備有限公司）；微波爐。

1.2 豆蔻明提取的操作流程

①篩選草豆蔻、烘干。將購(gòu)買的草豆蔻用清水洗凈，去除雜質(zhì)，放入65 ℃干燥箱內(nèi)烘干。②粉碎、過(guò)篩。將烘干的的草豆蔻放入粉碎機(jī)中粉碎，過(guò)篩。③稱重。稱取草豆蔻粉末20 g。④超聲波-微波輔助提取。設(shè)置超聲波功率600 W，超聲波時(shí)間12 min，微波功率600 W，微波時(shí)間80 s。⑤過(guò)濾。將提取液用濾紙過(guò)濾。⑥濃縮。將濾液放入蒸發(fā)皿用水浴鍋將濾液濃縮。⑦純化。利用大孔吸附樹(shù)脂的特性將濃縮物進(jìn)行純化。⑧干燥。將純化后的待測(cè)物進(jìn)行濃縮干燥。⑨將0.01 g粗制豆蔻明溶于80%的乙醇溶液中制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法測(cè)定吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出豆蔻明的濃度。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取0.01 g豆蔻明標(biāo)準(zhǔn)品制成0.1 mg·mL-1的豆蔻明標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL和1.2 mL于試管中，用蒸餾水補(bǔ)至2 mL，搖勻后在波長(zhǎng)346 nm處測(cè)定吸光度值，橫坐標(biāo)為豆蔻明濃度，縱坐標(biāo)為吸光度值，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取純化前樣品溶液5 mL稀釋1倍后，在波長(zhǎng) 346 nm處測(cè)定吸光值，將測(cè)得的吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，獲得豆蔻明濃度。

1.4 豆蔻明含量計(jì)算

豆蔻明含量（mg·g-1）計(jì)算公式為

式中：c為樣品中豆蔻明濃度，mg·mL-1；f為稀釋倍數(shù)；V為待測(cè)樣溶液體積，mL；m為草豆蔻粉末的質(zhì)量，g。

1.5 單因素試驗(yàn)

（1）不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)豆蔻明含量的影響。固定超聲波功率600 W、超聲波時(shí)間10 min、微波功率200 W、微波時(shí)間60 s，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（20%、40%、60%、80%和100%）對(duì)豆蔻明含量的影響。

（2）不同超聲波功率對(duì)豆蔻明含量的影響。固定乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、超聲波時(shí)間10 min、微波功率200 W、微波時(shí)間60 s，考察超聲功率400 W、500 W、600 W、700 W和800 W對(duì)豆蔻明含量的影響。

（3）不同超聲時(shí)間對(duì)豆蔻明含量的影響。固定乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、超聲波功率600 W、微波功率240 W、微波時(shí)間60 s，考察超聲時(shí)間6 min、8 min、10 min、12 min和14 min對(duì)豆蔻明含量的影響。

（4）不同微波功率對(duì)豆蔻明含量的影響。固定乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、超聲波功率600 W、超聲波時(shí)間12 min和微波時(shí)間60 s，考察微波功率分別為300 W、400 W、500 W、600 W和700 W對(duì)豆蔻明含量的影響。

（5）不同微波時(shí)間對(duì)豆蔻明含量的影響。固定乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、超聲波功率600 W、超聲波時(shí)間12 min和微波功率600 W，考察微波時(shí)間20 s、40 s、60 s、80 s和100 s對(duì)豆蔻明含量的影響。

1.6 豆蔻明的定性分析

分別移取3.0 mL 0.1 mol?L-1的豆蔻明標(biāo)準(zhǔn)乙醇溶液和提取出的溶液于兩只比色管中，在268 nm到 465 nm間掃描得到紫外吸收光譜，掃描對(duì)照兩者的吸收光譜。

1.7 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇3個(gè)對(duì)豆蔻明含量影響最大的因素做響應(yīng)面試驗(yàn)，確定最優(yōu)的豆蔻明提取條件。

1.8 豆蔻明與抗血小板聚集活性的研究

取動(dòng)物血漿，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.8%枸櫞酸鈉抗凝，在800 r·min-1下離心10 min，制備富血小板血漿。分別在測(cè)定管中加入265 μL 富血小板血漿，分別加入豆蔻明和阿司匹林至溶液終濃度分別為0.1 mmol·L-1，溫孵5 min，加入5 μL二磷酸腺苷，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的二甲基亞砜作空白，觀察記錄5 min內(nèi)最大聚集率，計(jì)算豆蔻明和阿司匹林對(duì)二磷酸腺苷誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制率，計(jì)算公式為

2 結(jié)果與分析

2.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

將1.3中的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液在波長(zhǎng)346 nm處測(cè)定吸光度值，橫坐標(biāo)為豆蔻明濃度，縱坐標(biāo)為吸光度值，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。由圖1可知，y=88.757x+0.0293，R2=0.9997，線性關(guān)系良好。

圖1 豆蔻明的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取液中豆蔻明含量 的影響

由圖2可知，豆蔻明的含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)達(dá)到最高值，然后逐漸降低，通過(guò)分析，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、80%、100%進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取液中豆蔻明含量的影響圖

2.2.2 不同超聲波功率對(duì)豆蔻明含量的影響

由圖3可知，隨著超聲波功率的升高，提取液中豆蔻明含量逐漸增加，當(dāng)超聲波功率達(dá)到600 W時(shí)，豆蔻明提取率達(dá)到最高；超過(guò)600 W后，隨著超聲波功率的升高，豆蔻明的提取率逐漸降低。由此選擇超聲波功率600 W較好，并選擇500 W、600 W、700 W進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖3 超聲波功率對(duì)提取液中豆蔻明含量的影響圖

2.2.3 不同超聲波時(shí)間對(duì)提取液中豆蔻明含量的影響

由圖4可知，隨著超聲波時(shí)間的延長(zhǎng)，豆蔻明含量逐漸增加，當(dāng)達(dá)到8 min時(shí)，豆蔻明提取率達(dá)到最高，超過(guò)8 min后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)豆蔻明的提取率逐漸降低。因此，超聲波時(shí)間選擇8 min。

圖4 超聲波時(shí)間對(duì)提取液中豆蔻明含量的影響圖

2.2.4 不同微波功率對(duì)提取液中豆蔻明含量的影響

由圖5可知，隨著微波功率的升高，豆蔻明的含量逐漸增加，當(dāng)微波功率達(dá)到600 W時(shí)，豆蔻明含量達(dá)到最高，超過(guò)600 W后微波功率升高，豆蔻明含量逐漸降低。由此選擇微波功率600 W較好，并選擇500 W、600 W、700 W進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖5 微波功率對(duì)提取液中豆蔻明含量的影響圖

2.2.5 不同微波時(shí)間對(duì)提取液中豆蔻明含量的影響

由圖6可知，隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，豆蔻明含量逐漸增加，當(dāng)達(dá)到80 s時(shí)，豆蔻明含量達(dá)到最高，超過(guò)80 s后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，豆蔻明的含量逐漸降低。因此，微波時(shí)間選擇80 s。

圖6 微波時(shí)間對(duì)豆蔻明含量的影響圖

2.3 豆蔻明的定性分析

分別移取3.0 mL 0.1 moL·L-1的豆蔻明標(biāo)準(zhǔn)品、乙醇溶液和樣品提取液于兩支比色管中，在268 nm到 465 nm間掃描得到紫外吸收光譜，掃描對(duì)照兩者的吸收光譜。由圖7、圖8可知，待測(cè)樣的掃描光譜與豆蔻明標(biāo)準(zhǔn)品的掃描光譜中，主要波峰基本吻合，可證明待測(cè)樣中含有豆蔻明。

圖7 豆蔻明標(biāo)準(zhǔn)品掃描光譜圖

圖8 待測(cè)樣品掃描光譜圖

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇微波功率、超聲波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)這3個(gè)對(duì)豆蔻名含量影響最大的因素做響應(yīng)面試驗(yàn)，確定最優(yōu)的豆蔻明提取條件，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定3因素3水平共17組試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn) 表2，以吸光度為響應(yīng)值做響應(yīng)面試驗(yàn)。由表3可知，模型P值＜0.0001，失擬項(xiàng)P值=0.0894，說(shuō)明該模型擬合程度較好。AC、A2、B2、C2均達(dá)到極顯著 水平。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果表

表3 Box-Behnken Design分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)表

由Box-Behnken回歸分析，得到多元二次響應(yīng)面回歸模型為Y=2.54+0.060A-0.029B-0.073C-0.012AB-0.21AC-0.014BC-0.65A2-0.83B2-0.68C2，其決定系數(shù)R2=0.9990，說(shuō)明回歸方程擬合度很好，98%的吸光度值與各因素變量之間關(guān)系可以用此模型解釋，且調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.9977與R2接近，表明實(shí)測(cè)值和模型預(yù)測(cè)值具有較好的相關(guān)性。預(yù)測(cè)決定系數(shù)R2pred=0.9863，表明該模型可以預(yù)測(cè)98.63%的吸光度值與各因素變量之間關(guān)系。根據(jù)二次回歸方程預(yù)測(cè)求極值得：當(dāng)乙醇提取分?jǐn)?shù)為81.116%、超聲波功率為598.225 W、微波功率為593.842 W時(shí)，吸光度有最大值為2.548。結(jié)合操作可行性，將工藝條件調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，超聲波功率600 W，微波功率 600 W。對(duì)最佳試驗(yàn)條件進(jìn)行驗(yàn)證，豆蔻明提取液吸光度為2.542，與理論值相比，誤差為0.1%，響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。各因素對(duì)吸光度影響的響應(yīng)面和等高線圖見(jiàn)圖9。

圖9 各因素對(duì)吸光度影響的響應(yīng)面和等高線圖

2.5 豆蔻明與抗血小板聚集活性的研究

由表4知，豆蔻明對(duì)于抑制血漿中的血小板的聚集有一定的效果，但是效果不如阿司匹林。

表4 不同時(shí)間下血漿中加入藥品后的透射比表

3 結(jié)論

本文是關(guān)于超聲微波協(xié)同萃取草豆蔻中豆蔻明及其與血小板聚集活性的研究。利用超聲波和微波的空化作用對(duì)豆蔻明進(jìn)行提取并以此為原料進(jìn)行豆蔻明與抗血小板聚集活性相互作用的研究，操作技術(shù)簡(jiǎn)單，提取效率高，能大大縮短提取時(shí)間。通過(guò)定性試驗(yàn)的結(jié)果可以得出，試驗(yàn)所萃取的提取液中確實(shí)含有豆蔻明。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于草豆蔻中的豆蔻明的最佳萃取條件為乙醇分?jǐn)?shù)80%，超聲波功率600 W，超聲波時(shí)間8 min，微波功率600 W，微波時(shí)間80 s。由豆蔻明與抗血小板聚集活性研究試驗(yàn)可以得出，豆蔻明對(duì)血小板聚集有部分抑制效果。