PCR檢驗(yàn)的質(zhì)量控制

◎ 徐 楓，艾 萍，金 浩，劉 卓，陳振宇，趙 詠

（1.錦州市疾病預(yù)防控制中心，遼寧 錦州 121000；2.錦州市第二醫(yī)院，遼寧 錦州 121000；3.錦州市婦嬰醫(yī)院，遼寧 錦州 121000；4.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121000）

食品的安全問題一直是社會(huì)關(guān)心的熱點(diǎn)，它直接關(guān)系到公眾的身體健康以及生命安全，并對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展以及社會(huì)的穩(wěn)定產(chǎn)生影響。PCR技術(shù)以其高特異性、高靈敏性和簡(jiǎn)便快捷的特點(diǎn)，為食品安全與質(zhì)量安全問題提供科學(xué)依據(jù)。但PCR要求比較嚴(yán)格，容易造成實(shí)驗(yàn)污染和操作污染引起的假陽(yáng)性結(jié)果。如果擴(kuò)增儀溫度不準(zhǔn)確、反應(yīng)液處理不好，會(huì)導(dǎo)致PCR抑制物進(jìn)入反應(yīng)體系且出現(xiàn)假陰性結(jié)果。為保證PCR檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，做好PCR的質(zhì)量控制至關(guān)重要。影響PCR檢驗(yàn)質(zhì)量的因素很多，總體上涉及以下幾個(gè)方面。

1 實(shí)驗(yàn)室設(shè)置設(shè)施

PCR反應(yīng)是一種廣泛用于使特定DNA或RNA樣本快速生成數(shù)百萬至數(shù)十億個(gè)拷貝的方法。在擴(kuò)增過程中，會(huì)產(chǎn)生大量的擴(kuò)增產(chǎn)物，如果控制不好極易造成實(shí)驗(yàn)室污染。為防止這種污染的發(fā)生，需要對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行合理分區(qū)。標(biāo)準(zhǔn)的PCR實(shí)驗(yàn)室分為相互獨(dú)立的4個(gè)區(qū)域，涵括試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣品制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)以及產(chǎn)物分析區(qū)[1]。各工作區(qū)域有明確的標(biāo)識(shí)，各區(qū)的實(shí)驗(yàn)物品不得混用，應(yīng)貼上不同顏色標(biāo)識(shí)予以區(qū)別。進(jìn)入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按照試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣品制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)方向依次進(jìn)行，避免造成 交叉污染。

2 人員管理

實(shí)驗(yàn)人員要具有相關(guān)的專業(yè)知識(shí)及2年以上的檢驗(yàn)工作經(jīng)歷，具備熟練的技術(shù)操作和正確分析判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的能力。應(yīng)定期對(duì)實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行專業(yè)知識(shí)和安全知識(shí)的培訓(xùn)，做好人員的能力評(píng)估。

3 性能驗(yàn)證

開展新的檢驗(yàn)前，對(duì)提取和擴(kuò)增設(shè)備、提取和擴(kuò)增試劑在內(nèi)的全套實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行全面的性能驗(yàn)證。增加新的檢驗(yàn)設(shè)備、更換提取和擴(kuò)增試劑廠家、儀器設(shè)備進(jìn)行大維修及更換關(guān)鍵部件等可能會(huì)影響到性能時(shí)也需要進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證一般包括以下幾種方法。

（1）方法符合率。選取陰性樣本5例，陽(yáng)性樣本10例，按照樣本檢驗(yàn)程序，所得結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相比較，計(jì)算符合率（表1）。陰性樣本及陽(yáng)性樣本的符合率應(yīng)達(dá)到100%。

（2）檢出限。使用定值標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，稀釋至廠家聲明的檢出限濃度，重復(fù)測(cè)定5次，必須100%檢出靶核酸?；蛟诓煌蝺?nèi)對(duì)該濃度樣本進(jìn)行20次重復(fù)測(cè)定，必須檢出至少18次靶核酸。

（3）抗干擾能力。在弱陽(yáng)性樣本（弱陽(yáng)性質(zhì)控品）中加入干擾物質(zhì)（如血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素、免疫球蛋白G、類風(fēng)濕因子和藥物等）溶液，使得干擾物質(zhì)的終濃度與廠家聲明的濃度相同[2]。與常規(guī)樣本一樣處理，對(duì)照組加入等量的溶劑，至少重復(fù)測(cè)定3次以上，弱陽(yáng)性樣本檢驗(yàn)仍為弱陽(yáng)性結(jié)果，則驗(yàn)證通過。通過表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出SARS-CoV-2 RNA對(duì)血紅蛋白、白蛋白、利巴韋林+阿奇霉素具有抗干擾能力。

表2 抗干擾能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

（4）交叉反應(yīng)。應(yīng)驗(yàn)證與檢測(cè)對(duì)象可能存在交叉反應(yīng)的核酸物質(zhì)對(duì)檢測(cè)的影響。主要指與檢測(cè)對(duì)象核酸序列具有同源性，易引起相同或相似臨床癥狀的病原體核酸。例如，取含冠狀病毒假病毒陽(yáng)性樣本的分析特異性參考品（如國(guó)際參考品、國(guó)家參考品、廠家參考品）與常規(guī)陰性樣本一樣處理，至少重復(fù)檢驗(yàn)3次結(jié)果都為陰性，則交叉反應(yīng)驗(yàn)證合格。交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

（5）正確度。參加國(guó)家組織的實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)或與同級(jí)別或高級(jí)別的機(jī)構(gòu)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，至少包括異常值和正常值的5份樣品，以≥80%的結(jié)果在規(guī)定范圍內(nèi)為正確度驗(yàn)證通過。

（6）重復(fù)性。選擇至少兩個(gè)水平穩(wěn)定的評(píng)價(jià)樣本，同一批次內(nèi)對(duì)樣本進(jìn)行20次重復(fù)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)至少檢驗(yàn)一個(gè)質(zhì)控品。依據(jù)兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（水平1、2），分別計(jì)算結(jié)果的均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。以能力驗(yàn)證/室間質(zhì)評(píng)評(píng)價(jià)界限（靶值±lg0.4）作為允許總誤差（TEa），要求重復(fù)性精密度＜3/5 TEa（0.24），中間精密度＜4/5 TEa（0.32）[3]。

4 儀器設(shè)備

實(shí)驗(yàn)室必須有質(zhì)量可靠的儀器設(shè)備，以保證檢驗(yàn)質(zhì)量。溫度偏離程序設(shè)定的目標(biāo)值對(duì)PCR擴(kuò)增效果有一定影響，對(duì)于低含量的模板樣品，溫度偏差可能導(dǎo)致陰陽(yáng)性的結(jié)果改變。因此，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該固定日期對(duì)PCR儀的反應(yīng)孔進(jìn)行溫度校準(zhǔn)以及期間核查，還需要對(duì)PCR檢驗(yàn)相關(guān)的儀器設(shè)備進(jìn)行檢定校準(zhǔn)，保證所出數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確，同時(shí)規(guī)范儀器設(shè)備的使用和維護(hù)[4]。

5 試劑和關(guān)鍵耗材

試劑應(yīng)有專人保管，在有效期內(nèi)使用，按照其規(guī)定的保存要求存放。試劑批間比對(duì)，一般選取5個(gè)舊批次試劑檢驗(yàn)過的樣品，覆蓋測(cè)量區(qū)間（包括陰性、臨界值、低值、中值和高值），用新批次試劑進(jìn)行檢驗(yàn)。對(duì)兩批次檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行偏差計(jì)算分析，至少有4個(gè)樣品結(jié)果偏差小于±7.5%，且陰性和臨界值樣本符合預(yù)期，則提示兩批次試劑批間差異符合要求[5]。

耗材的質(zhì)量也會(huì)影響PCR的檢驗(yàn)結(jié)果，關(guān)鍵耗材應(yīng)不含抑制物，必須使用帶濾芯的吸頭，但不能使用玻璃離心管，避免造成泄露。樣品采集管和PCR反應(yīng)管管帽應(yīng)密閉完好，防止產(chǎn)生氣溶膠。

6 對(duì)標(biāo)本的要求

標(biāo)本的采集時(shí)間、采樣量和采樣容器嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)要求執(zhí)行。采樣所用的抗凝劑及相關(guān)試劑材料不應(yīng)對(duì)核酸擴(kuò)增及檢驗(yàn)過程造成干擾。所有標(biāo)本采集后，應(yīng)盡快送往實(shí)驗(yàn)室，標(biāo)本在室溫（25 ℃）放置不宜超過4 h。如果需要長(zhǎng)途運(yùn)輸，采用干冰等制冷方式進(jìn)行保藏，標(biāo)本運(yùn)送期間避免反復(fù)凍融。

7 實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)室要經(jīng)常參加實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)和能力驗(yàn)證，通過實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)和能力驗(yàn)證評(píng)價(jià)參加者的能力，監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，提高實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)?zāi)芰Α?/p>

8 結(jié)語(yǔ)

PCR檢驗(yàn)的質(zhì)量控制是實(shí)驗(yàn)室的核心活動(dòng)，要做好質(zhì)量控制，最重要的是要了解影響檢驗(yàn)質(zhì)量的所有因素，控制好這些影響因素，對(duì)出具準(zhǔn)確的檢驗(yàn)結(jié)果可以起到至關(guān)重要的作用。