丙戊酸鈉抑制脯氨酰內(nèi)肽酶活性對(duì)非酒精性脂肪性肝病進(jìn)展的影響

李夢(mèng)婷，蔣黛西，張建斌，魏建東，陳長喜，李紅亮

1.寧波大學(xué)附屬人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 寧波 315000；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院 消化內(nèi)科，上海 200092；3.上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 急診科，上海 201900

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）在全球患病人數(shù)不斷增加，非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis, NASH）是其嚴(yán)重類型[1]。脯氨酰內(nèi)肽酶（prolyl endopeptidase, PREP）是一種能特異性水解神經(jīng)活性肽、小肽類激素和多種細(xì)胞因子的絲氨酸蛋白酶，在肝臟中活性較高[2-3]。筆者前期體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)肝細(xì)胞脂肪變時(shí)伴PREP活性升高[2-4]，抑制PREP活性[2]或PREP表達(dá)缺失[5]均可抑制肝細(xì)胞脂肪變，提示抑制PREP對(duì)NAFLD進(jìn)展可能有保護(hù)作用。丙戊酸及其鈉鹽是目前世界上最常用的抗癲癇藥物，有研究稱長期服用丙戊酸對(duì)人體肝功能有一定的損害作用[6]，但同時(shí)丙戊酸有顯著的PREP活性抑制作用[7-8]，它對(duì)NAFLD進(jìn)展的影響目前鮮見報(bào)道。本研究采用高脂高膽固醇飲食構(gòu)建小鼠NAFLD模型，并用具有PREP活性抑制功能的丙戊酸鈉進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)NAFLD進(jìn)展的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：42 只雄性7～8 周齡，體質(zhì)量18～20 g，無特殊病原體野生型C57BL/6J小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）2012-0002。

1.1.2 主要試劑：高脂高膽固醇飼料（10%豬油+2%膽固醇+88%基礎(chǔ)飼料，總熱卡4.8 kcal/g）購自南通特洛菲飼料科技有限公司；丙戊酸鈉購自荷澤方明藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；底物Suc-Gly-Pro-AMC購自瑞士BaChem公司；7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin, AMC）購自美國Sigma-Aldrich公司；蘇木精-伊紅（HE）試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；兔抗小鼠PREP抗體購自美國Abcam公司；其他抗體均購自上海碧云天生物科技研究所。RT-qPCR和TRIzol試劑盒均購自日本Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備：用標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)小鼠1周后，將小鼠分為對(duì)照組（15只）、模型組（10只）和干預(yù)組（17只），對(duì)照組喂以普通飼料，模型組和干預(yù)組喂以高脂飼料，8周后干預(yù)組給予0.4%丙戊酸鈉飲用水[9-10]，繼續(xù)干預(yù)8周后，隔夜禁食，次日稱量體質(zhì)量，通過眼眶靜脈取血，頸椎脫臼處死小鼠，解剖留取肝組織和血清，保存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 血生化指標(biāo)測定：采用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清生化指標(biāo)。

1.2.3 病理標(biāo)本制備：取部分肝組織經(jīng)4%多聚甲醛固定2 h后予石蠟包埋，制備切片，常規(guī)HE染色后置于光鏡下觀察肝組織形態(tài)。采用NAFLD活動(dòng)度積分（NAFLD activity score, NAS）進(jìn)行評(píng)分（0～8分），NAS≥5分可診斷NASH，NAS＜3分可排除NASH，處于兩者之間為NASH可能[11]。

1.2.4 肝組織中PREP活性測定：取100 mg小鼠肝組織，加入濃度為10 mmol/L，pH 7.4 的Tris-HCl 500 μL后均勻裂解，在4 ℃ 16 000×g的離心機(jī)中離心20 min。取10 μL上清液，加入到465 μL上述濃度Tris-HCl中，放置于30 ℃水浴箱中恒溫孵育30 min。后加入25 μL底物Suc-Gly-Pro-AMC（4 mmol/L），繼續(xù)放置于30 ℃水浴箱中恒溫反應(yīng)60 min，用500 μL醋酸鈉緩沖液（1 mol/L，pH 4.2）終止反應(yīng)。取100 μL終末反應(yīng)液加入至96孔板中，用BioTek Synergy H4檢測終末反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波：360 nm，吸收波：460 nm）[12]。同時(shí)以AMC作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定其熒光強(qiáng)度并計(jì)算終末反應(yīng)液中AMC的濃度。用BCA法測定上清液中總蛋白濃度，各樣本中PREP酶活性的高低以每毫克蛋白每分鐘能水解產(chǎn)生的AMC量（pmol·min-1·mg-1）來表示。

1.2.5 肝組織中PREP mRNA測定：稱取50 mg肝組織，采用TRIzol法進(jìn)行RNA提取并測定各組RNA濃度及純度，通過RT-qPCR法將mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用cDNA進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算PREP基因相對(duì)表達(dá)量，最終結(jié)果以RQ值（2-ΔΔCT）表示。各基因引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，GAPDH上游引物5’-TGC ACCACCAACTGCTTAG-3’，下游引物5’-GGATGCAGGGATG ATGTTC-3’；PREP上游引物5’-GACCACTGATTACGGGTG CT-3’，下游引物5’-AGAAGCATGGACGGGTACTG-3’。

1.2.6 肝組織中PREP蛋白檢測：提取肝組織內(nèi)蛋白，采用BCA法測定各組蛋白濃度（BCA試劑購自上海碧云天生物科技研究所）。采用蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法對(duì)蛋白樣本進(jìn)行電泳，將分離開的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用脫脂牛奶封閉后加入一抗（兔抗小鼠PREP抗體，1:1 000），4 ℃孵育過夜，用1×TBST洗膜15 min×3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h，再用1×TBST洗膜15 min×3次，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色。以β-Actin作為內(nèi)參，用Image Lab軟件分析條帶灰度值，并計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)和睪脂指數(shù)比較 模型組小鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)、睪脂指數(shù)與對(duì)照組相比均顯著升高（P＜0.05）；干預(yù)組小鼠肝指數(shù)與模型組相比顯著下降（P＜0.05）。見表1。

表1 3組小鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)和睪脂指數(shù)比較（±s）

表1 3組小鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)和睪脂指數(shù)比較（±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.05；與模型組比：bP＜0.05

?

2.2 小鼠血清生化指標(biāo)的比較 除谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）外，模型組小鼠血清總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）、甘油三酯（TG）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、空腹血糖（FBG）、胰島素等均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；干預(yù)組小鼠血清TC、TG、ALT較模型組顯著下降（P＜0.05），LDL、AST、ALP、FBG、胰島素等與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 3組小鼠血清生化指標(biāo)比較（±s）

表2 3組小鼠血清生化指標(biāo)比較（±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.05；與模型組比：bP＜0.05

?

2.3 小鼠肝組織形態(tài)及病理學(xué)改變和NAS比較

2.3.1 肝臟大體形態(tài)：在相同曝光條件下，用同一背景板作襯墊，觀察解剖時(shí)小鼠在體肝臟外觀形態(tài)?？梢妼?duì)照組小鼠肝臟呈暗紅色，形態(tài)正常，質(zhì)地較軟，被膜光滑，邊緣銳利，切面無油膩感；模型組小鼠肝臟呈現(xiàn)奶黃色，體積顯著增大，邊緣鈍圓，被膜緊張，切面明顯油膩感；干預(yù)組小鼠肝臟黃帶暗紅，體積較模型組略小，邊緣稍鈍，切緣稍油膩感。見圖1。

圖1 3組小鼠肝臟大體形態(tài)

2.3.2 肝臟HE染色：對(duì)照組小鼠具有完整的肝小葉結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞內(nèi)未見明顯的脂滴沉積；模型組小鼠肝組織發(fā)生廣泛大泡性脂肪變性，間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞明顯浸潤，門脈區(qū)可見壞死灶及炎癥細(xì)胞聚集，同時(shí)易見氣球樣變性；干預(yù)組小鼠脂肪變性明顯減輕，可見個(gè)別炎性細(xì)胞浸潤，肝小葉和匯管區(qū)結(jié)構(gòu)無明顯改變。見圖2。

圖2 3組小鼠肝臟組織HE染色結(jié)果（×200）

2.3.3 各組小鼠肝臟NAS比較：與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟出現(xiàn)明顯的脂肪變性、炎癥及氣球樣變（P＜0.05），經(jīng)丙戊酸鈉干預(yù)后，脂肪變性和炎癥明顯改善，NAS顯著下降（P＜0.05），見表3。

表3 3組小鼠肝臟NAS比較

2.4 3組小鼠肝組織內(nèi)PREP mRNA及其蛋白表達(dá)和活性水平比較 模型組肝組織PREP mRNA及PREP蛋白活性均高于對(duì)照組（P＜0.05）；干預(yù)組肝組織PREP mRNA與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；干預(yù)組PREP蛋白活性相比于模型組降低（P＜0.05）；3組之間肝組織PREP蛋白相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 各組小鼠肝組織PREP表達(dá)及活性

3 討論

NAFLD是以肝細(xì)胞脂肪變性和炎癥改變?yōu)樘卣鞯呐R床病理綜合征[13]。雖然目前已經(jīng)認(rèn)識(shí)到飲食、代謝、環(huán)境和遺傳等多種綜合因素共同導(dǎo)致的脂肪組織增生、胰島素抵抗和腸道微生態(tài)紊亂等是NAFLD的發(fā)病基礎(chǔ)[1，14]，但NAFLD特別是NASH的發(fā)病機(jī)制仍有待深入闡明。

丙戊酸鈉是目前癲癇類疾病治療的首選藥物，有研究顯示丙戊酸鈉可造成微泡性脂肪性肝炎和肝硬化。那么，在NAFLD患病率不斷增加的背景下，丙戊酸鈉是否仍可以安全地使用于NAFLD人群目前仍缺乏相關(guān)研究證據(jù)。

丙戊酸鈉具有顯著的PREP抑制活性[8]。PREP是一種在體內(nèi)廣泛分布的絲氨酸蛋白酶，作為酶功能可特異性水解短肽鏈中脯氨酸殘基羧基端肽鍵[2]。在肝臟中，庫普弗細(xì)胞和肝細(xì)胞均可表達(dá)PREP蛋白，同時(shí)兩者是肝損傷修復(fù)的關(guān)鍵細(xì)胞[17]。研究表明，PREP參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)積聚[2]，而肝內(nèi)炎癥微環(huán)境和脂肪變性正是促使NASH發(fā)生發(fā)展的兩個(gè)基本要素[18]。已有研究顯示，抑制PREP活性能減輕中性粒細(xì)胞性炎癥，其機(jī)制可能與中性粒細(xì)胞趨化因子脯氨酰-甘氨酰-脯氨酸（proline-glycineproline, PGP）的生成減少有關(guān)[7]。PREP可與基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMP）-8/9協(xié)同，水解膠原蛋白I/II產(chǎn)生三肽PGP[19]，PGP結(jié)合于中性粒細(xì)胞表面趨化性細(xì)胞因子CXC受體（CXC receptor, CXCR1和CXCR2），進(jìn)而對(duì)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生聚集效應(yīng)[20]，抑制PREP或MMP活性及運(yùn)用PGP拮抗劑均可顯著抑制中性粒細(xì)胞性炎癥。上述現(xiàn)象已在結(jié)腸炎[21]、動(dòng)脈粥樣硬化[22]、慢性阻塞性肺病[23]等炎癥疾病中觀察到。

肝內(nèi)炎癥微環(huán)境形成的原因是細(xì)胞免疫失衡，病理表現(xiàn)為多種炎癥細(xì)胞浸潤和激活[24]。肝內(nèi)庫普弗細(xì)胞是較早認(rèn)識(shí)的促進(jìn)NAFLD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞之一，在小鼠NAFLD模型中，通過TOLL樣受體9 激活信號(hào)可刺激庫普弗細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變、炎癥和纖維化[25]。而近年來，中性粒細(xì)胞在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的作用受到更為廣泛的關(guān)注。例如中性粒細(xì)胞釋放免疫調(diào)控蛋白LCN-2（Lipocalin-2）作用于巨噬細(xì)胞，促進(jìn)其炎癥反應(yīng)，并分泌LCN-2誘導(dǎo)自身表達(dá)CXCR2，進(jìn)而激活ERK1/2導(dǎo)致多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞肝內(nèi)浸潤，形成炎癥級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)[26]。我們團(tuán)隊(duì)在先前的研究結(jié)果中觀察到PREP基因敲除小鼠肝組織中巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞聚集減少，眾多炎癥因子例如TNF-α、IL-6、IL-1β、LCN-2、CXCR2、ERK1/2表達(dá)顯著下降，同時(shí)PREP基因敲除小鼠肝臟中MMP-8、MMP-9和PGP的產(chǎn)生均較野生型小鼠明顯減少[5]。

本研究顯示，NAFLD模型鼠給予丙戊酸鈉處理后，脂肪變和炎癥沒有加重，反而得到一定程度改善，同時(shí)，肝內(nèi)PREP活性也受到明顯抑制。結(jié)合團(tuán)隊(duì)先前的研究結(jié)果，猜測丙戊酸鈉改善NAFLD小鼠肝臟炎癥可能與抑制PREP活性后MMP-8/9 和PGP產(chǎn)生減少有關(guān)，從而改善了中性粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞炎癥瀑布反應(yīng)，進(jìn)一步驗(yàn)證上述炎癥因子、MMP-8/9和PGP表達(dá)量有助于回答以上問題。

有研究發(fā)現(xiàn)，PREP蛋白/活性下調(diào)后，能夠改善促進(jìn)NAFLD/NASH發(fā)病的不良因素如肥胖[27]、糖代謝異常[28]等。此外，PREP活性與細(xì)胞脂質(zhì)代謝密切相關(guān)。本團(tuán)隊(duì)在先前的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變時(shí)伴隨PREP活性升高，抑制PREP活性或PREP基因敲除后成脂相關(guān)基因如脂肪酸合成酶、過氧化物酶體增生物激活受體-γ、膽固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白-1c、乙酰輔酶A羧化酶等表達(dá)量顯著下調(diào)，肝細(xì)胞脂肪變性顯著改善[2，5]，因此我們推測，丙戊酸鈉改善NAFLD小鼠脂肪變性可能與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因有關(guān)，后續(xù)將進(jìn)一步驗(yàn)證上述基因表達(dá)量。

雖然已有研究報(bào)道丙戊酸鈉會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗及肝臟脂肪變性，促進(jìn)NAFLD進(jìn)展[29]，但本研究展示了不同的結(jié)果，這可能與丙戊酸鈉的劑量、作用方式、肝臟的微環(huán)境狀態(tài)有關(guān)，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，丙戊酸鈉在體內(nèi)對(duì)肝臟的作用機(jī)制多樣，NAFLD小鼠應(yīng)用0.4%丙戊酸鈉并未加重肝損傷，推測可能與NAFLD階段體內(nèi)微環(huán)境改變有關(guān)，NAFLD患者應(yīng)用丙戊酸鈉的安全性值得進(jìn)一步研究。