基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)參麥注射液緩解CIPN作用機(jī)制分析

高叢，竇明金，隋繼英

(山東第一醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院<山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院>，山東 濟(jì)南 250031)

化療所致周圍神經(jīng)毒性(chemotherapy-induced peripheral neurotoxicity，CIPN) 是目前臨床廣泛使用的鉑類、紫杉烷類、長(zhǎng)春堿類等化療藥物常見(jiàn)不良反應(yīng)，其主要癥狀表現(xiàn)為針刺樣疼痛、燒灼感、手足麻木及觸覺(jué)減弱等。據(jù)報(bào)道20%～40%癌癥患者使用具有神經(jīng)毒性的化療藥物后會(huì)出現(xiàn)不同程度的CIPN[1]。CIPN可在化療期間急性發(fā)生，患者無(wú)法耐受時(shí)會(huì)減少化療藥物劑量或停止化療，干擾正常治療；同時(shí)對(duì)少部分患者可能造成永久性損害。CIPN發(fā)生機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，目前尚無(wú)統(tǒng)一結(jié)論。目前有研究報(bào)道[2]其可能與膠質(zhì)細(xì)胞活化、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、離子通道改變、脫髓鞘、細(xì)胞修復(fù)系統(tǒng)改變、DNA損傷、炎癥因子、下行抑制系統(tǒng)功能降低和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化等多種機(jī)制有關(guān)[3]。目前對(duì)于CIPN患者的治療選擇十分有限，一般通過(guò)減少劑量或停止化療來(lái)進(jìn)行急性管理，尚未發(fā)現(xiàn)有效的治療手段[4]。目前臨床常用預(yù)防和緩解CIPN的主要藥物有：神經(jīng)生長(zhǎng)因子及細(xì)胞保護(hù)劑類、抗氧化劑類、維生素類、核苷酸類、鈣鎂合劑等[5]。

目前大量臨床研究轉(zhuǎn)向關(guān)注傳統(tǒng)中醫(yī)藥在降低神經(jīng)毒性方面產(chǎn)生的作用，以期改善患者生活質(zhì)量、提高患者對(duì)化療的耐受性和依從性。參麥注射液是參麥方的一種臨床應(yīng)用形式，源于古方“生脈散”的衍變，由傳統(tǒng)中藥紅參與麥冬兩味藥組成，主要活性成分為人參皂苷、麥冬皂苷和少量的麥冬多糖等。中醫(yī)理論認(rèn)為參麥方有益氣固脫、養(yǎng)陰生津之功效[6]。參麥注射液臨床應(yīng)用于多種疾病，包括病毒性心肌炎、冠心病和粒細(xì)胞減少癥等，也常與化療藥物同用，提高機(jī)體免疫力，起到增效減毒的作用。近年來(lái)對(duì)中藥注射劑成分作用的研究愈加深入，其中人參皂苷已被多項(xiàng)臨床研究證實(shí)具有調(diào)節(jié)血管生成、保護(hù)心血管、興奮腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)以及增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能，從而可實(shí)現(xiàn)改善全身臟器的供血、毛細(xì)血管微循環(huán)及抗凝作用。這是近年來(lái)解釋參麥注射液用于緩解CIPN的作用機(jī)制之一[7]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過(guò)融合系統(tǒng)生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)、分子藥理學(xué)等多學(xué)科技術(shù)構(gòu)建整合“疾病-表型-基因-藥物”網(wǎng)絡(luò)，用于分析藥物在網(wǎng)絡(luò)中與特定節(jié)點(diǎn)的相互作用關(guān)系，進(jìn)而從系統(tǒng)、整體角度探索藥物與機(jī)體相互作用的一門新學(xué)科。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可用于揭示中藥復(fù)方的科學(xué)內(nèi)涵、發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)、指導(dǎo)中藥新藥研發(fā)[8]。因此，本文擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析參麥注射液緩解CIPN的作用機(jī)制，在現(xiàn)有臨床應(yīng)用基礎(chǔ)上提供細(xì)胞分子層面的參考。

1 方法

1.1 參麥方成分收集及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 以“紅參”“麥冬”為關(guān)鍵詞，借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/index.php)以及中醫(yī)藥百科全書(shū)(ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)檢索參麥注射液主要組分中的化學(xué)成分，并參考相關(guān)文獻(xiàn)[9]報(bào)道進(jìn)行補(bǔ)充。

類藥性(druglikeness weight，DL值)是指化合物與已知藥物的相似性。由于常見(jiàn)中藥成分繁多復(fù)雜，因此利用類藥性數(shù)值，可篩選出成藥可能性較高的目標(biāo)成分[10]。借助 TCMSP、ETCM數(shù)據(jù)平臺(tái)，篩選出紅參與麥冬中符合DL值≥0.18的化學(xué)成分作為目標(biāo)成分，并收集其潛在的靶點(diǎn)信息。

1.2 CIPN靶點(diǎn)收集篩選 以“chemotherapy-induced peripheral neurotoxicity”“neurotoxicity of chemotherapy”為關(guān)鍵詞，在Disgenet(https://www.disgenet.org/)、OMIM(https://www.omim.org/)以及GeneCards(https://www.genecards.org/)等數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與CIPN相關(guān)的基因。

1.3 參麥成分與靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò) 將“1.1”與“1.2”項(xiàng)下得到的參麥成分與CIPN的共同靶點(diǎn)，利用Cytoscape 3.9.1構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)得到的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建及核心網(wǎng)絡(luò)的篩選 將“1.3”項(xiàng)下的共同靶點(diǎn)上傳至STRING 11.5(https://string-db.org)，設(shè)定物種智人(Homo sapiens)，置信度設(shè)為“medium confidence=0.4”，獲取蛋白相互作用的關(guān)系并保存PPI網(wǎng)絡(luò)文件。將網(wǎng)絡(luò)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件中利用Network Analyzer功能進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，獲取度中心性(degree centrality)、介數(shù)中心性(betweenness centrality)和緊密度(closeness centrality)的數(shù)據(jù)，利用以上3個(gè)參數(shù)的平均數(shù)值篩選PPI中的核心靶蛋白[11]，進(jìn)而得到蛋白互作核心網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction core network，PPICN)。

1.5 核心靶點(diǎn)的GO富集分析與KEGG通路分析 將“1.4”項(xiàng)下的核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(https://metascape.org/)，輸入靶基因名稱列表并限定物種為人，設(shè)定檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P<0.01，進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選 通過(guò)TCMSP、ETCM檢索以及文獻(xiàn)查找，搜集到紅參、麥冬中化合物組分共86個(gè)，其中紅參成分34個(gè)，麥冬成分52個(gè)，如表1所示。

表1 紅參-麥冬有效成分匯總

2.2 參麥注射液-CIPN靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集構(gòu)建 通過(guò)Disgenet、OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)搜集到紅參與麥冬活性化合物共334個(gè)作用靶點(diǎn)，CIPN相關(guān)基因共1 460個(gè)。通過(guò)在線韋恩圖得出參麥注射液與CIPN共有基因135個(gè)(見(jiàn)圖1)。

圖1 參麥-CIPN共同靶點(diǎn)

2.3 化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò) 利用Cytoscape 3.9.1軟件，得到參麥成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖2)。共有143個(gè)節(jié)點(diǎn)(即38個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)與105個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn))和234條邊。如圖2所示，紅色代表紅參成分，紫色代表麥冬成分，綠色代表靶點(diǎn)，每條邊表示紅參、麥冬成分與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)篩選度值(degree)較大的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，這些度值較大節(jié)點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起到樞紐的作用，可能是關(guān)鍵活性成分。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，有26%的化合物的作用靶點(diǎn)≥10個(gè)。麥冬有效成分6個(gè)，占比60%。度值排名前10位的化合物見(jiàn)表2。

圖2 參麥成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

表2 度值排名前10位的成分化合物

2.4 參麥-CIPN蛋白互作核心網(wǎng)絡(luò)(PPICN)的構(gòu)建 將參麥-CIPN靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集中的靶點(diǎn)信息導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape軟件構(gòu)進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析后，以“degree”“betweenness”和“closeness”的平均值作為篩選值。上述網(wǎng)絡(luò)中degree平均值為19.970 370 370 370 4，betweenness平均值為0.008 340 918 631 570 61，closeness平均值為0.485 526 621 226 082，選取同時(shí)滿足三個(gè)卡值的節(jié)點(diǎn)作為參麥-CIPN-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的核心作用蛋白，共23個(gè)：GAPDH、IL-1β、PPARG、MMP9、AKT1、IL-6、TNF、PPARA、ABCB1、NR3C1、MAPK3、TP53、CASP3、CYP3A4、JUN、GSTP1、ESR1、HSPA8、DPP4、FOS、CREB1、AR、TRPV1。

將23個(gè)核心蛋白導(dǎo)入STRING得到PPICN(圖3)，共包含23個(gè)節(jié)點(diǎn)，188條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值為16.3。

圖3 參麥注射液-CIPN蛋白互作核心網(wǎng)絡(luò)

2.5 靶點(diǎn)通路分析 將23個(gè)核心靶點(diǎn)輸入到Metascape工具中進(jìn)行GO富集分析(檢驗(yàn)水準(zhǔn)P<0.01，靶點(diǎn)富集數(shù)目≥3，富集因子>1.5)。結(jié)果顯示GO條目34個(gè)，其中細(xì)胞組成(CC)相關(guān)的條目5個(gè)，生物過(guò)程(BP)條目相關(guān)的20個(gè)，分子功能(MF)相關(guān)的條目9個(gè)。

對(duì)GO-CC進(jìn)行聚類分析(見(jiàn)圖4)，主要涉及有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、膜筏、富含ficolin-1的顆粒管腔、膜側(cè)、細(xì)胞前緣等。

圖4 GO富集分析-細(xì)胞成分

對(duì)GO-BP進(jìn)行聚類分析(見(jiàn)圖5)，主要涉及有細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)、miRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控、對(duì)異種刺激的反應(yīng)、對(duì)活性氧的反應(yīng)、磷酸鹽代謝過(guò)程的負(fù)調(diào)控、對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、miRNA介導(dǎo)的基因沉默的調(diào)節(jié)、細(xì)胞死亡的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)激素刺激的反應(yīng)、激素水平的調(diào)節(jié)、對(duì)腫瘤壞死因子的反應(yīng)、膠質(zhì)細(xì)胞活化、對(duì)糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)、調(diào)節(jié)血壓、對(duì)酮的反應(yīng)、對(duì)輻射的反應(yīng)、破骨細(xì)胞分化的正向調(diào)節(jié)、Ⅰ-κB激酶/NF-κB信號(hào)的調(diào)節(jié)、對(duì)含嘌呤化合物的反應(yīng)等。

圖5 GO富集分析-生物過(guò)程

對(duì)GO-MF進(jìn)行聚類分析(見(jiàn)圖6)，主要涉及：RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、R-SMAD結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、磷脂結(jié)合等。

圖6 GO富集分析-分子功能

KEGG通路富集分析得到9條信號(hào)通路(見(jiàn)圖7)，主要涉及脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥途徑、非酒精性脂肪肝、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、前列腺癌、胰島素抵抗、長(zhǎng)壽調(diào)節(jié)通路、甲狀腺癌、抗原加工和呈遞等。

圖7 KEGG信號(hào)通路分析

3 討論

CIPN屬于劑量限制性毒性反應(yīng)，隨著化療療程的推進(jìn)，藥物劑量持續(xù)累積，CIPN的癥狀表現(xiàn)也會(huì)隨之進(jìn)行性加重，甚至造成永久性神經(jīng)損傷。為保障患者化療后的生活質(zhì)量以及腫瘤治療的順利進(jìn)行，急需解決CIPN的防治難題。目前實(shí)際臨床用于治療CIPN的方法和藥物較多，但作用效果仍有待研究[12]。參麥注射液以紅參、麥冬為主要原料，經(jīng)現(xiàn)代制劑加工而成，具有益氣固脫、養(yǎng)陰生津之功效，能加強(qiáng)機(jī)體器官抗應(yīng)激能力。參麥注射液與化療藥物合用時(shí)，有一定的減毒作用。姜超等[13]研究90例接受含奧沙利鉑方案化療的結(jié)直腸癌患者，在化療開(kāi)始同時(shí)分別給予參麥注射液靜脈或口服甲鈷胺片比較兩組神經(jīng)毒性反應(yīng)發(fā)生情況及神經(jīng)傳導(dǎo)速度。結(jié)果顯示與口服甲鈷胺片比較，對(duì)于接受含奧沙利鉑輔助化療方案的結(jié)直腸癌患者，靜脈注射參麥注射液更能有效減少周圍神經(jīng)毒性反應(yīng)。張潔等[14]將125例應(yīng)用含紫杉醇化療方案化療的癌癥患者隨機(jī)分為2組，其中試驗(yàn)組(64例)化療前1 d開(kāi)始加用參麥注射液。結(jié)果試驗(yàn)組神經(jīng)毒性發(fā)生率為26.6%(17/64)，對(duì)照組為57.4%(35/61)；周圍神經(jīng)功能測(cè)定，試驗(yàn)組腓神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MNCV)及感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(SNCV)均優(yōu)于對(duì)照組，表明參麥注射液對(duì)含紫杉醇化療方案所致的周圍神經(jīng)毒性具有明顯的防治作用。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法，得到參麥注射液對(duì)于改善CIPN癥狀相關(guān)的有效成分，包括腺苷、β-谷固醇、齊墩果酸、豆甾醇、花生酸、麥冬素A、刺五加苷A、麥冬素C、正二十四烷、人參皂苷Rh2等?；趶臄?shù)據(jù)庫(kù)獲得的作用靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)，對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行映射，得到“參麥-CIPN”數(shù)據(jù)集，對(duì)PPICN中的23個(gè)核心靶點(diǎn)用Metascape進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號(hào)通路分析，結(jié)果表明參麥注射液改善CIPN的生物過(guò)程主要涉及有細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)、miRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控、對(duì)異種刺激的反應(yīng)、對(duì)活性氧的反應(yīng)、磷酸鹽代謝過(guò)程的負(fù)調(diào)控、對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、miRNA介導(dǎo)的基因沉默的調(diào)節(jié)、細(xì)胞死亡的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)激素刺激的反應(yīng)、激素水平的調(diào)節(jié)、對(duì)腫瘤壞死因子的反應(yīng)、膠質(zhì)細(xì)胞活化、對(duì)糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)、調(diào)節(jié)血壓、對(duì)酮的反應(yīng)、對(duì)輻射的反應(yīng)、破骨細(xì)胞分化的正向調(diào)節(jié)、Ⅰ-κB激酶/NF-κB信號(hào)的調(diào)節(jié)、對(duì)含嘌呤化合物的反應(yīng)等。所作用的信號(hào)通路主要有脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、胰島素抵抗、長(zhǎng)壽調(diào)節(jié)通路抗原加工和呈遞等。

綜上，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理念與方法，應(yīng)用多種生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)和分析工具對(duì)參麥注射液的有效組分、作用靶點(diǎn)以及對(duì)CIPN作用機(jī)制進(jìn)行了探討。參麥注射液中對(duì)CIPN關(guān)鍵活性成分源自麥冬的組分占比60%，相比紅參，麥冬可能起到更重要的作用；GO富集分析與KEGG通路分析共獲得34個(gè)相關(guān)條目及9條相關(guān)信號(hào)通路，即參麥注射液通過(guò)多靶點(diǎn)與多通路的協(xié)同作用緩解CIPN。目前對(duì)于參麥注射液在CIPN領(lǐng)域應(yīng)用的研究較多，但通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討其作用機(jī)制并不多見(jiàn)。同時(shí)由于本研究的結(jié)論仍需要進(jìn)一步分子對(duì)接等相關(guān)驗(yàn)證，因此本文可為后續(xù)研究提供信息和依據(jù)。