小兒寶泰康顆粒對(duì)呼吸道病毒感染的抗病毒作用研究

劉軍，楊光，沈夢(mèng)欣，劉媛媛，楊占秋

(1.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)病毒學(xué)研究所，湖北 武漢 430071；2.湖北省婦幼保健院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430070)

病毒性疾病嚴(yán)重威脅著人類的生命與健康，具有傳播快、危害大等特點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，80%以上的傳染病是由病毒感染引起，其中經(jīng)呼吸道感染的病毒種類和型別最多，且最為常見。由于嬰幼兒免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，難以抵抗病毒入侵，易于受到病毒感染，其中呼吸道病毒和腸道病毒是最為常見的感染，而在呼吸道病毒感染中，最常見的就是呼吸道合胞病毒和腺病毒感染[1-2]。呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)屬副粘病毒科肺炎病毒屬成員，是嬰幼兒下呼吸道感染的重要病原體，常引起嬰幼兒急性毛細(xì)支氣管炎、肺炎、流行性喘憋性肺炎等反復(fù)發(fā)作性疾病，而且嚴(yán)重程度與病毒基因型有關(guān)，對(duì)嬰幼兒健康危害極大[3-4]。腺病毒(adenovirus，AdV)是雙股DNA無包膜病毒，它也是兒童呼吸道感染的常見病毒，可引起咽結(jié)膜炎、肺炎、支氣管炎等癥。腺病毒肺炎是嬰幼兒肺炎的嚴(yán)重類型，年齡越小越易感染。何義林等[5]對(duì)2012-2019年泰州市呼吸道感染性疾病的病原學(xué)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)呼吸道合胞病毒和腺病毒仍是5歲以下兒童感染的主要病因。由于呼吸道病毒種類多，難以用疫苗預(yù)防病毒感染，尋找抗病毒藥物意義重大。RSV感染目前尚無安全有效的疫苗進(jìn)入市場，帕麗珠單克隆抗體對(duì)RSV 感染高危患兒有預(yù)防作用。但也不適用于某些RSV易感人群，如嬰幼兒和免疫力低下的人群[6]。在抗病毒治療方面，美國FDA批準(zhǔn)用于治療RSV感染的藥物，僅有利巴韋林。由于該藥的骨髓抑制毒性，只能通過少量的氣霧劑經(jīng)呼吸道給予，但仍可出現(xiàn)可逆性貧血等毒副作用[7]，也有報(bào)道阿比朵爾有抗RSV作用，但未進(jìn)入市場[8]。劉敏寧等[9]指出在常規(guī)治療基礎(chǔ)上，用孟魯司特鈉，一種 CysLTs 受體拮抗劑，能改變炎癥因子水平，治療兒童RSV感染有效，但實(shí)驗(yàn)室沒有證明它的抗病毒作用。曲麗欣等[10-11]報(bào)道紫草素、黃芪甲苷和穿心蓮內(nèi)酯等中藥均有抗腺病毒作用。Liu等[12]也報(bào)道一種復(fù)方中藥制劑在體內(nèi)外有抗流感病毒和RSV作用。但是這些中藥僅為實(shí)驗(yàn)研究，未進(jìn)入市場，缺乏臨床應(yīng)用效果依據(jù)。因此，尋找安全有效的抗呼吸道病毒藥物用于臨床一直是人們的研究目標(biāo)。

小兒寶泰康顆粒是由連翹、地黃、滇柴胡、玄參和桑葉等12味中藥組成的復(fù)方中成藥制劑，具有解表清熱、止咳化痰作用。臨床上廣泛用于小兒風(fēng)熱外感，癥見發(fā)熱、流涕、咳嗽、脈浮等病癥的治療，效果較好。羅迪等[13-14]報(bào)道指出小兒寶泰康顆粒對(duì)小兒呼吸道感染有較好的臨床治療效果，它能夠改善患兒癥狀特征，降低炎癥因子水平，但是這些研究缺乏病毒學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)，而且小兒寶泰康顆粒對(duì)呼吸道合胞病毒和腺病毒有無抗病毒作用尚未見報(bào)道。為此，我們從體外細(xì)胞水平觀察了健民藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)的小兒寶泰康顆粒對(duì)呼吸道合胞病毒和腺病毒的抗病毒作用，以便為該藥的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人喉癌上皮細(xì)胞株(HEp-2細(xì)胞)購于武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心。該細(xì)胞株對(duì)呼吸道合胞病毒和腺病毒易感，細(xì)胞生長液為DMEM培養(yǎng)基，加10%小牛血清，100 U·mL-1青霉素，100 μg·mL-1鏈霉素。細(xì)胞維持液除小牛血清為2%外，其余同細(xì)胞生長液。

1.2 病毒 ①呼吸道合胞病毒(RSV)Long株， 由英國Glasgow大學(xué)兒童衛(wèi)生系Paton博士贈(zèng)送。病毒經(jīng)HEp-2細(xì)胞活化增殖，細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect，CPE)達(dá)75%以上時(shí)收獲，滴定RSV滴度為104TCID50/0.1 mL；②腺病毒(AdV)7 型為本所保存。RSV、AdV經(jīng)HEp-2細(xì)胞活化增殖，CPE達(dá)75%以上時(shí)收獲。

1.3 藥物 小兒寶泰康顆粒，生產(chǎn)日期：2021年3月7日，批號(hào)：210341。由健民藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司制備提供。本品為棕色至棕紅色的顆粒，由連翹、地黃、滇柴胡、玄參、桑葉、浙貝母、蒲公英、南板藍(lán)根、滇紫草、桔梗、菔子和甘草等12味中藥組成的復(fù)方中成藥制劑。

陽性對(duì)照藥物：利巴韋林(即商品名：病毒唑)(注射液，1 g/支)，天津藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：0203071。

1.4 主要試劑與儀器 MTT(4，5二甲基噻唑-2，5-二苯基四唑溴化物)為Sigma公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基(主要成分為糖、脂肪、氨基酸和維生素，是細(xì)胞生長的基礎(chǔ)培養(yǎng)基)和胎牛血清為Gibico公司產(chǎn)品；二甲基亞砜(DMSO)購自上海菲達(dá)有限公司。 AC2-4 S1 型生物安全工作臺(tái)(新加坡ESCO公司)；Olympus IMT-413型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；RT-2100C型自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Rayto公司)。二氧化碳培養(yǎng)箱Series Ⅱ(美國Thermo公司)。

1.5 方法

1.5.1 小兒寶泰康顆粒的制備與配制 小兒寶泰康顆粒組成成分中的浙貝母、滇紫草用70%乙醇回流提取兩次，濾過，合并濾液，回收乙醇并濃縮至適量。連翹等10味中藥加水煎煮兩次，濾過，合并濾液濃縮至適量，加乙醇使含醇量達(dá)70%，靜置，取上清液回收乙醇并濃縮至適量。合并全部濾液，制成干燥顆粒，存放備用。稱取小兒寶泰康顆粒(生藥含量)100 mg，加入蒸餾水溶解，定容至10 mL，8磅高壓滅菌(溫度110 ℃) 15 min備用。臨用時(shí)用DMEM細(xì)胞維持培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。陽性對(duì)照藥物利巴韋林用生理鹽水無菌稀釋至0.1 g·mL-1儲(chǔ)存?zhèn)溆茫R用時(shí)用同上用DMEM細(xì)胞維持培養(yǎng)基稀釋。

1.5.2 病毒培養(yǎng)與滴定 病毒液制備：將腺病毒病毒液1 mL接種單層HEp-2細(xì)胞，置 37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每日觀察CPE。第2天細(xì)胞收縮破裂，出現(xiàn)CPE特征，達(dá)到75%以上時(shí)收獲病毒，將病毒液凍于-20 ℃冰箱，反復(fù)凍融3次，分裝備用。測定病毒滴度時(shí)按10倍稀釋，分別為原液、10-1到10-6等7個(gè)不同稀釋度，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，48 h，MTT測得AdV滴度為104.62TCID50/0.1 mL。實(shí)驗(yàn)時(shí)兩種病毒用100 TCID50/0.1 mL。將呼吸道合胞病毒病毒液1 mL接種單層HEp-2細(xì)胞，置細(xì)胞培養(yǎng)箱 35 ℃，5%CO2培養(yǎng)。第3天CPE達(dá)到75%以上時(shí)收獲病毒，采用Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度[15]，滴定RSV為106TCID50/0.1 mL，AdV為10-7.9TCID50/0.1 mL。實(shí)驗(yàn)時(shí)兩種病毒均用100 TCID50/0.1 mL。

1.5.3 小兒寶泰康顆粒對(duì)HEp-2細(xì)胞的毒性作用觀察 用胰蛋白酶將生長良好的HEp-2細(xì)胞單層分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，然后用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106，加入至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入0.1 mL，置 37 ℃，5%CO2培養(yǎng)，24 h后，加入用DMEM培養(yǎng)基稀釋小兒寶泰康顆粒至不同濃度，即10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156 mg·mL-1等7個(gè)不同濃度的含藥維持液，再置 37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞變化。48 h后，MTT法檢測細(xì)胞存活率。每一藥物濃度均重復(fù)4孔。同時(shí)設(shè)不加藥的DMEM培養(yǎng)基作用正常細(xì)胞的溶劑對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

MTT法檢測小兒寶泰康顆粒對(duì)HEp-2細(xì)胞毒性作用參照文獻(xiàn)加以改進(jìn)[16]。即小兒寶泰康顆粒處理的HEp-2細(xì)胞48 h后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液上清，每孔加入含5 mg·mL-1MTT的PBS溶液50 μL，置 37 ℃，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h后，棄上清，每孔加溶解液100 μL，振蕩5 min，待結(jié)晶完全溶解，置酶標(biāo)測定儀上，測定570 nm波長處的光密度OD值，并根據(jù)下式計(jì)算細(xì)胞存活率，計(jì)算半數(shù)細(xì)胞毒性濃度(TC50)。

1.5.4 小兒寶泰康顆粒對(duì)呼吸道合胞病毒和腺病毒復(fù)制增殖的抑制作用 單層Hep-2細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，然后用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106，加入至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入0.1 mL，置 37 ℃，5%CO2培養(yǎng)，24 h后，每孔接種50 μL的100 TCID50的RSV和AdV病毒液，分別于35 ℃、37 ℃吸附90 min(因?yàn)閮煞N病毒的生長溫度不同)，棄病毒上清液。根據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在小兒寶泰康顆粒半數(shù)細(xì)胞毒性濃度范圍內(nèi)，加入不同濃度的含小兒寶泰康顆粒的細(xì)胞維持液，每孔0.2 mL，濃度分別為2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25、0.078 125 mg·mL-1，分別置 35 ℃、37 ℃，5%CO2培養(yǎng)。隔天換新鮮含藥維持液。每種濃度重復(fù)4孔。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)加藥物溶解稀釋液的細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組、陽性藥物對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，同“1.5.3”項(xiàng)下用MTT法檢測小兒寶泰康顆粒對(duì)病毒感染細(xì)胞的抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.5 小兒寶泰康顆粒對(duì)呼吸道合胞病毒和腺病毒的直接滅活作用 將不同無毒濃度的小兒寶泰康顆粒與100 TCID50/0.05 mL的呼吸道合胞病毒和腺病毒等量混合，35 ℃作用2 h，再將其接種于細(xì)胞密度為5×106，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的單層Hep-2細(xì)胞中，每孔加入0.1 mL，置 37 ℃，5%CO2培養(yǎng)，吸附2 h后棄含病毒上清液，PBS洗滌，加入細(xì)胞維持液，分別置35 ℃和37 ℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病變情況。72 h后，同“1.5.3”項(xiàng)下用MTT法檢測病毒抑制率。每一藥物濃度重復(fù)4孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.6 呼吸道合胞病毒和腺病毒的抑制率測定 采用“1.5.3”項(xiàng)下MTT法，檢測小兒寶泰康顆粒對(duì)呼吸道合胞病毒和腺病毒的抑制作用。根據(jù)CPE觀察結(jié)果，在病毒感染細(xì)胞后第3天，病毒對(duì)照組CPE為75%以上時(shí)棄培養(yǎng)液上清，每孔加入含5 mg·mL-1MTT的培養(yǎng)液50 μL， 繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h后，洗去MTT上清，加DMSO溶解液每孔100 μL，混勻，5～10 min后，用酶標(biāo)儀測570 nm波長處的光密度OD值。并按下述公式計(jì)算小兒寶泰康顆粒對(duì)呼吸道合胞病毒和腺病毒的抑制率。

1.5.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理 根據(jù)小兒寶泰康顆粒的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和抗病毒實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，用統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。多組數(shù)據(jù)間的對(duì)比用One-way ANOVA 進(jìn)行分析比較，細(xì)胞存活率和病毒抑制率與藥物濃度之間的關(guān)系用Probit回歸進(jìn)行分析，計(jì)算小兒寶泰康顆粒半數(shù)毒性濃度(TC50)和半數(shù)有效濃度(EC50)，得到小兒寶泰康顆粒的抗病毒指數(shù)(treatment index,TI=TC50/EC50)。

2 結(jié)果

2.1 小兒寶泰康顆粒半數(shù)毒性濃度測定 從表1可以看出，小兒寶泰康顆粒從10 mg·mL-1稀釋至0.157 mg·mL-1等7個(gè)濃度時(shí)，細(xì)胞存活率從33.2%提高到86.7%，細(xì)胞存活率與藥物濃度呈反向梯度關(guān)系，未用小兒寶泰康顆粒處理的正常細(xì)胞存活率為100%。用Probit回歸分析測得小兒寶泰康顆粒對(duì)HEp-2細(xì)胞的半數(shù)細(xì)胞毒性濃度為4.4 mg·mL-1。

表1 小兒寶泰康顆粒對(duì)HEp-2細(xì)胞的細(xì)胞毒作用

2.2 小兒寶泰康顆粒對(duì)呼吸道合胞病毒和腺病毒復(fù)制增殖的抑制作用 根據(jù)小兒寶泰康顆粒對(duì)HEp-2細(xì)胞的半數(shù)細(xì)胞毒性濃度，我們選擇了從2.5 mg·mL-1稀釋至0.078 mg·mL-1等6個(gè)濃度進(jìn)行抗呼吸道合胞病毒和腺病毒活性觀察，結(jié)果見表2～3。這些數(shù)據(jù)經(jīng)過One-way ANOVA 和Probit回歸分析，最低濃度(0.078 mg·mL-1至0.156 mg·mL-1)未顯示出對(duì)病毒的抑制作用，表現(xiàn)在病毒抗原OD值與病毒對(duì)照組相近，病毒抑制率在1%范圍內(nèi)。當(dāng)小兒寶泰康顆粒濃度進(jìn)一步增加，兩種病毒的抑制率明顯提高，并有量效關(guān)系，在2.5 mg·mL-1時(shí)，兩種病毒的抑制率均達(dá)到85%以上，病毒抗原OD值接近正常細(xì)胞對(duì)照OD值水平，高低濃度組比較，P<0.05。小兒寶泰康顆粒對(duì)呼吸道合胞病毒的EC50為2.03 mg·mL-1，而腺病毒的EC50為0.65 mg·mL-1，抗病毒指數(shù)分別為2.17和6.75。我們以128 mg·mL-1的利巴韋林作為陽性藥物對(duì)照，結(jié)果顯示其對(duì)呼吸道合胞病毒和腺病毒的抑制率分別為92.7%和80.16%，病毒抗原OD值分別為0.874和0.709。

表2 小兒寶泰康顆粒對(duì)呼吸道合胞病毒和腺病毒復(fù)制增殖的抑制作用

2.3 小兒寶泰康顆粒對(duì)呼吸道合胞病毒和腺病毒的直接滅活作用 將小兒寶泰康顆粒與病毒混合作用后，觀察藥物對(duì)病毒的直接殺滅作用是證明藥物抗病毒效果和抗病毒作用機(jī)制的方式之一。我們的結(jié)果顯示出小兒寶泰康顆粒對(duì)呼吸道合胞病毒和腺病毒有直接殺滅作用(見表3)。這些數(shù)據(jù)經(jīng)過One-way ANOVA 和Probit回歸分析，病毒抑制率和病毒抗原OD值隨藥物濃度增加而升高，同樣顯示出量效關(guān)系，高低濃度組比較，P<0.05。而且從表3還可以看出小兒寶泰康顆粒對(duì)呼吸道合胞病毒的直接殺滅作用強(qiáng)于腺病毒，表現(xiàn)在病毒抑制率和病毒抗原OD值高于腺病毒。兩種病毒的EC50分別為4.13和8.99 mg·mL-1。

表3 小兒寶泰康顆粒對(duì)呼吸道合胞病毒和腺病毒的直接滅活作用

3 討論

由于呼吸道合胞病毒和腺病毒均對(duì)HEp-2細(xì)胞敏感，這兩種病毒均可在這種細(xì)胞上復(fù)制增殖，故本實(shí)驗(yàn)用同一種細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。我們首先觀察了小兒寶泰康顆粒的細(xì)胞毒作用，發(fā)現(xiàn)小兒寶泰康顆粒對(duì)HEp-2細(xì)胞的半數(shù)細(xì)胞毒性濃度為4.4 mg·mL-1，說明該藥細(xì)胞毒濃度較高，安全性較大?；诖耍緦?shí)驗(yàn)以該藥半數(shù)細(xì)胞毒性濃度為依據(jù)，進(jìn)行了6個(gè)不同濃度的抗病毒活性研究，結(jié)果顯示小兒寶泰康顆粒對(duì)呼吸道合胞病毒和腺病毒均有抗病毒活性，表現(xiàn)為病毒抑制率伴隨著藥物濃度增加而增加，顯示出明顯的量效關(guān)系。小兒寶泰康顆粒對(duì)呼吸道合胞病毒的半數(shù)有效濃度為2.03 mg·mL-1，而腺病毒的半數(shù)有效濃度為0.65 mg·mL-1。此外，本文用DMEM培養(yǎng)基作為溶劑對(duì)照，該對(duì)照溶劑成分為糖、脂肪、氨基酸和維生素，是細(xì)胞生長的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用其作為藥物稀釋液對(duì)細(xì)胞無毒無害，而且也排除了用其他溶劑對(duì)結(jié)果可靠性的影響。利巴韋林陽性藥物對(duì)照，結(jié)果顯示128 mg·mL-1對(duì)呼吸道合胞病毒和腺病毒的抑制率分別為92.7%和80.16%，提示本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)是穩(wěn)定可靠的。這些結(jié)果都從不同角度證明了小兒寶泰康顆粒是一種對(duì)呼吸道合胞病毒和腺病毒感染有抗病毒作用的藥物。羅迪等將小兒寶泰康顆粒用于小兒呼吸道感染的治療有較好的臨床效果[13-14]，但其臨床觀察缺少實(shí)驗(yàn)室病毒學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)，我們的結(jié)果從實(shí)驗(yàn)室角度證明了羅迪等的臨床觀察，它為該藥在治療兒童呼吸道病毒感染中的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)，也表明該藥應(yīng)用前景廣闊。

抗病毒指數(shù)反映了藥物毒性和抗病毒活性之間的正比關(guān)系。我們的結(jié)果顯示小兒寶泰康顆粒對(duì)呼吸道合胞病毒和腺病毒的抗病毒指數(shù)不同，兩種病毒的抗病毒指數(shù)分別為2.17和6.75，即效果存在差異，這是因?yàn)閮煞N病毒屬于不同的病毒種類，結(jié)構(gòu)特征亦不同，呼吸道合胞病毒是RNA病毒，而腺病毒屬于DNA病毒，故對(duì)藥物的敏感性存在差異，進(jìn)一步的效果評(píng)價(jià)仍需要?jiǎng)游矬w內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用來證明。

由于病毒必須寄生在活細(xì)胞內(nèi)才能進(jìn)行復(fù)制增殖，從病毒進(jìn)入細(xì)胞到從細(xì)胞釋放稱為一個(gè)復(fù)制周期?？共《舅幬锏脑O(shè)計(jì)也是基于這一原理設(shè)計(jì)的。了解它們的抗病毒作用的可能機(jī)制。由于小兒寶泰康顆粒是作為治療用藥用于兒童呼吸道感染的臨床治療[13-14]，基于這一結(jié)果，本文觀察了病毒進(jìn)入細(xì)胞后加藥的抗病毒機(jī)制研究和藥物直接滅活病毒作用的研究，結(jié)果顯示病毒進(jìn)入細(xì)胞后，藥物濃度為2.5 mg·mL-1時(shí)，兩種病毒的抑制率達(dá)到85.84%和89.76%；而在同樣濃度下，直接滅活病毒作用的實(shí)驗(yàn)中，呼吸道合胞病毒和腺病毒的抑制率分別為37.45%和21.45%，藥物對(duì)病毒的復(fù)制增殖抑制作用明顯優(yōu)于直接滅活病毒作用。這些結(jié)果說明小兒寶泰康顆粒對(duì)呼吸道合胞病毒和腺病毒的抗病毒作用是病毒進(jìn)入細(xì)胞后的復(fù)制增殖環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，或者說作為病毒感染后的治療用藥作用更好。進(jìn)一步的分子機(jī)制研究有待深入。