番茄醬中關鍵致腐菌快速篩選方法的建立

孫勝敏，張宇鑫，王一村，周莉莉，高靜靜，李 娜，才美佳，趙彤彤

（山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，國家加工食品質(zhì)量檢驗檢測中心(山東)，山東濟南 250102）

番茄醬是一種以成熟番茄為原料，經(jīng)清洗、打漿、去籽去皮后，濃縮制成的食品。番茄是番茄醬生產(chǎn)的主要原料，在世界范圍內(nèi)廣泛栽培，其所含營養(yǎng)物質(zhì)豐富，包括有機酸、蛋白質(zhì)、維生素A、維生素C 以及鈣、鐵等礦物鹽[1]。番茄醬具有番茄的獨特風味，常作為魚肉等食物的烹制輔料，具有為菜肴增添色彩和口味的重要作用[2]，也可作為熟制食品的蘸料直接入口，因此對其微生物指標的監(jiān)控尤為重要。番茄醬的加工過程主要包含原料選取、原料加工和滅菌灌裝等主要步驟，制作過程中原料的選取至關重要，使用腐爛的原料果不僅會使產(chǎn)品的色澤變差，還會在加工過程中帶來微生物污染，使產(chǎn)品中的微生物數(shù)目過多或產(chǎn)生毒素引起食品腐敗[3]。在番茄醬的加工過程中，既需要保證滅菌充分，又要充分考慮產(chǎn)品的質(zhì)量和滅菌過程的安全性，此外由于操作間人員環(huán)境衛(wèi)生條件不達標、加工過程消毒不充分、產(chǎn)品保存容器殺菌清洗不徹底等原因，可能會造成微生物的大量增殖[4-5]。我國現(xiàn)有標準對番茄醬微生物檢測方法僅包含對番茄醬罐頭的商業(yè)無菌和霉菌計數(shù)，以及對番茄醬主要腐敗微生物芽孢桿菌和葡萄球菌的檢測[6]，而對于可能造成番茄醬品質(zhì)受到嚴重影響的其他菌種缺乏有效的監(jiān)控。

由于番茄醬這一產(chǎn)品的重要地位，多年以來眾多研究者對不同條件下不同包裝種類番茄醬中的腐敗微生物進行了較多研究，其中早期以分離培養(yǎng)為主。如李慧等[7]從露天存放脹桶的大桶番茄醬中分離鑒定得到了4株芽孢桿菌和1 株酵母菌。黃玲等[8]在腐敗番茄醬中分離出季也蒙假絲酵母（Candida guiliermondii）和叢生絲孢酵母（Trichosporn pullulans）。黃忠梅等[6]對脹袋和正常灌裝番茄醬厭氧增菌培養(yǎng)得到20 株菌株，經(jīng)VITEK 鑒定其中7 株為葡萄桿菌屬，6 株為芽孢桿菌屬，此外還有埃希氏菌屬和棒狀桿菌屬。巴哈提古麗·馬那提拜等[9]從感官異常的濃縮番茄醬罐頭中分離培養(yǎng)得到了5 株菌，其中3 株為芽孢桿菌屬、1 株為葡萄球菌，1 為株腸球菌。曾獻春[10]從罐裝和袋裝番茄醬中分離得到了1 株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和1 株棲稻黃色單胞菌（Flavimonasory zihabitans）。楊紅紅等[2]在正常、疑似脹袋和脹袋的番茄醬中分離得到共51 株菌，其中芽孢桿菌31 株。由于微生物自身可培養(yǎng)性和培養(yǎng)條件的不同，用傳統(tǒng)方法分離鑒定番茄醬中的腐敗菌存在一定局限性，得到的菌株種類相對單一，無法全面反映微生物種群的結構組成[9-11]。張雙虹等[11]利用Illumina Miseq 高通量測序方法分別對脹袋番茄醬和正常番茄醬中微生物種群構成分析得到，乳桿菌是引起番茄醬腐敗的主要微生物。眾多研究表明，在番茄醬加工生產(chǎn)運輸儲存等諸多環(huán)節(jié)中都存在微生物污染的風險，且后期存放方式的不同也對番茄醬中的微生物種群結構有較大影響。

高通量測序技術具有通量高、速度快、能夠全面反映樣品中微生物種群結構的特點[12-13]。目前這一技術已日趨成熟，在食品微生物檢測、環(huán)境微生物多樣性以及農(nóng)業(yè)和醫(yī)學領域應用廣泛[14-17]。實時熒光PCR 技術作為一項成熟的分子生物學實驗方法，有特異性強、靈敏度高、檢測速度快等特點，在食品檢測領域發(fā)揮著巨大作用[18]。本研究通過高通量測序技術對不同番茄醬樣品中的菌群構成進行分析，篩選出關鍵致腐菌，并建立了基于實時熒光PCR 的快速定性檢測方法，旨在為番茄醬微生物風險控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料

袋裝番茄醬：于山東濟南地區(qū)的超市中購買，為同一品牌同一批次產(chǎn)品，包括正常的袋裝番茄醬I、II 和暴曬放置一個月已脹袋的番茄醬III、IV。

本研究共選取15 種標準菌株，包括乳桿菌屬5 種、非乳桿菌屬10 種，其中包括此前學者研究從腐敗番茄醬中分離得到的芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬[2,9]。全部供試菌株均為采購的標準菌株，具體名稱及編號見表1。

1.1.2 試劑

細菌基因組DNA 提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；無水乙醇，分析純，國藥集團化學試劑上海有限公司；2×TaqManMix 等熒光定量PCR 試劑，大連寶生物工程公司；引物探針，大連寶生物工程公司。

1.1.3 儀器與設備

7500FAST 實時熒光PCR 儀，美國應用生物系統(tǒng)公司；NU-543-400S 生物安全柜，美國Nuaire 公司；移液器，德國Eppendorf 公司；微型高速離心機，ABSON 公司；5424R 型冷凍高速離心機，德國Eppendorf 公司；紫外可見光分光光度計，美國Thermo Fisher 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品總DNA 提取與測序

無菌操作取適量番茄醬樣品I、II、III、IV 分別放入無菌EP 管中，委托山東解碼生物科技有限公司進行樣品基因組DNA 提取并測序。對正常和脹袋番茄醬樣本中微生物組成在門水平和屬水平進行分析。

1.2.2 標準菌株的培養(yǎng)及基因組提取

按照菌種說明書提供的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件對15 種標準菌株進行復活培養(yǎng)，分別挑取單菌落在裝有無菌水的2 mL 離心管中洗脫、離心，以未經(jīng)菌落洗脫的離心管作為提取空白對照，隨后按照細菌基因組DNA 提取試劑盒說明書提取。

1.2.3 實時熒光PCR 擴增反應

乳桿菌屬通用引物探針參照Delroisse 等[19]，上游引物：5’-GAGGCAGCAGTAGGGAATCTTC-3’，下游引物：5’-GGCCAGTTACTACCTCTATCCTTCTTC-3’，探針：5’-FAM-ATGGAGCAACGCCGC-MGB-3’。PCR 反應總體積為25 μL，2×TaqManMix 12.5 μL；上、下游引物各1 μL；探針1 μL；DNA 模板1 μL；用ddH2O 補足至25 μL。PCR擴增程序：50 ℃、2 min；95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，共40 個循環(huán)。

1.2.4 方法的特異性驗證

以提取到的15 種標準菌株基因組DNA 與1 組DNA 提取空白為模板，按1.2.3 中的條件進行實時熒光PCR 擴增，驗證快速定性檢測方法的特異性。

1.2.5 檢出限驗證

以嗜酸乳桿菌對該方法的檢出限進行驗證。將單菌落菌液依次梯度稀釋為 107、106、105、104、103、102CFU/mL，分別吸取1 mL 菌液進行細菌基因組DNA 提取，對不同濃度下提取到的DNA 按上述實時熒光PCR條件進行擴增，共進行3 次實驗，每次實驗設置5 個平行以及陽性、陰性、空白對照。

1.2.6 重復性驗證

以嗜酸乳桿菌對該方法的重復性進行驗證。提取單菌落菌液基因組DNA，測得DNA 濃度，并稀釋終濃度為102、10、1、10-1、10-2、10-3ng/μL，將這6 個濃度梯度的DNA分別進行實時熒光PCR 擴增，每個濃度設5 個重復。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗使用實時熒光PCR 儀自帶軟件7500 Fast System Software 進行Ct 值的分析，使用SPSS Statistics 24.0 進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學分析。

2 結果與分析

2.1 番茄醬樣品菌群結構分析和優(yōu)勢腐敗菌篩選

對正常番茄醬和脹袋番茄醬樣本的菌群結構在門水平上進行分析，結果見圖1、2。在正常樣品I 中，優(yōu)勢菌群為變形菌門（Proteobacteria），占比81.1%，此外還有厚壁菌門（Firmicutes，9.1%）、放線菌門（Actinobacteria，3.5%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，2.8%）和其他（3.5%）。正常樣品II 中，變形菌門（Proteobacteria，77.8%）為優(yōu)勢菌群，還包括厚壁菌門（Firmicutes，10.5%）、放線菌門（Actinobacteria，4.7%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，3.6%）和其他（3.4%）。正常番茄醬樣品I 和II 相比，兩個樣品為同一批次的正常樣品，在門水平上，其菌群結構組成及豐度差別較小。對于脹袋樣品III，優(yōu)勢菌群為厚壁菌門（Firmicutes，91.1%），而變形菌門（Proteobacteria）占比僅有6.5%，此外還有放線菌門（Actinobacteria，0.6%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，0.9%）和其他類（0.9%）。在脹袋樣品IV 中，優(yōu)勢物種也為厚壁菌門（Firmicutes），占比93.7%，此外還有變形菌門（Proteobacteria，4.5%）、放線菌門（Actinobacteria，0.4%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，0.6%）和其他（0.8%）。在門水平上，正常番茄醬和脹袋番茄醬的菌群構成種類類似但豐度差別較大，其中正常樣品的優(yōu)勢菌群為變形菌門，脹袋樣品的優(yōu)勢菌群為厚壁菌門，且平均占比達到了92.4%，說明在樣品腐敗過程中，其中的菌群結構組成發(fā)生了較大變化。

圖1 基于門水平正常番茄醬樣品中的菌群結構Fig.1 Community structure of normal tomato paste samples based on phylum level

進一步對脹袋番茄醬樣品在屬水平的菌群結構分析，發(fā)現(xiàn)脹袋番茄醬中菌群構成較為單一，其中乳桿菌屬（Lactobacillus）占到88.6%和89.7%。通常在食品的腐敗過程中，只有部分適應環(huán)境而占優(yōu)勢地位的細菌能夠大量增殖，產(chǎn)生腐敗的代謝產(chǎn)物，并最終導致食品的腐敗[20]。此類優(yōu)勢菌被稱為優(yōu)勢腐敗菌，根據(jù)腐敗番茄醬的菌群構成可以推斷，乳桿菌屬在番茄醬中是優(yōu)勢腐敗菌。在張雙虹等[11]的研究中，兩個異常脹袋番茄醬樣品的優(yōu)勢腐敗菌同樣也是乳桿菌屬，在屬水平占比分別達到了96.89%和97.38%。與此相比，本研究中乳桿菌屬在屬水平所占比例相對較低，猜測與樣品的腐敗程度有關，乳桿菌屬具有較強的耐酸性，可在低pH 的條件下不斷增殖產(chǎn)生乳酸，最終導致番茄醬脹袋腐敗。

除了在番茄醬中，乳桿菌屬也曾在其他食物中被認定為優(yōu)勢致腐菌。崔躍慧[21]通過對細菌腐敗能力的定量分析發(fā)現(xiàn)L.Sakei strain在5 種菌中腐敗能力最強，是調(diào)理肉餅在冰溫貯藏條件下的優(yōu)勢致腐菌。真空包裝哈爾濱紅腸貯藏過程中的特定腐敗菌是清酒乳桿菌[22]。此外，部分溫和加工水產(chǎn)品的優(yōu)勢腐敗菌也是Lactobacillus[23]。乳桿菌L.sakei在真空包裝的水晶肴肉中可以快速生長，是導致肴肉變質(zhì)的特定腐敗菌。肖香[24]將大蒜提取物和茶多酚按1∶1 比例配制成生物抑菌劑，該抑菌劑能有效抑制大蒜生長。

圖2 基于門水平脹袋番茄醬樣品中的菌群結構Fig.2 Community structure of bulge bagged tomato paste samples based on phylum level

2.2 實時熒光PCR 方法特異性驗證

15 種標準菌株和1 組提取空白對照的實時熒光PCR 擴增結果如圖3 所示（見下頁）。其中對于乳桿菌屬的嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）、卷曲乳桿菌（L.crispatus）、瑞士乳桿菌（L.helveticus）、德氏乳桿菌保加利亞亞種（L.delbrueckiisubsp.bulgaricus）和植物乳桿菌（L.plantarum）都有明顯的熒光信號，且Ct 值處于16～20 之間，對于其他菌種和陰性對照并無明顯起帶，表明該引物和探針的特異性良好。

圖3 實時熒光PCR 對15 種細菌的擴增Fig.3 Amplification of 15 species of bacteria by real-time fluorescence quantitative PCR

2.3 實時熒光PCR 檢出限驗證

選擇嗜酸乳桿菌對該方法的檢出限進行驗證，將單菌落菌液依次梯度稀釋為102～107CFU/mL，隨后取1 mL菌液提取DNA 進行擴增，分別對不同濃度下的Ct 值進行記錄，Ct 值＞40 的視為未檢出，結果見表2。

表2 實時熒光PCR 的檢出限Table 2 Detection limit of real-time fluorescencequantitative PCR

其中在菌液為103CFU/mL 的初始濃度下，3 次實驗的15 次平行Ct 值均≤40，說明在此初始濃度下，乳桿菌屬可被穩(wěn)定檢出。當初始濃度稀釋到102CFU/mL 時，3次重復實驗中僅有1 個平行Ct 值＜40，可得出實時熒光PCR 反應穩(wěn)定的檢出限為103CFU/mL。

2.4 實時熒光PCR 重復性驗證

選擇嗜酸乳桿菌對該方法的重復性進行驗證，以不同濃度DNA 為模板的實時熒光PCR 擴增結果見表3。對每個濃度下的5 個平行的Ct 值進行分析，多個平行間Ct值相對穩(wěn)定，標準偏差（standard deviation，SD）介于0.12～0.32 之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）介于0.61%～1.91%之間，均處于較低水平，證明此方法檢測乳桿菌屬重復性較好。

表3 實時熒光PCR 重復性驗證Table 3 Repeatability of real-time fluorescence quantitative PCR

3 討論與結論

本實驗通過高通量測序方法對正常番茄醬和脹袋番茄醬樣品中的菌群組成進行了分析，發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬在腐敗番茄醬屬水平的菌群構成中占比高達88.6%和89.7%，推測乳桿菌屬是在番茄醬腐敗過程中的優(yōu)勢腐敗菌。乳桿菌屬一般耐熱性較差，發(fā)生乳桿菌屬的污染可能發(fā)生在殺菌后的灌裝和密封階段，因此生產(chǎn)企業(yè)除了原料的選取處理外，還應更注重加工環(huán)節(jié)的環(huán)境衛(wèi)生，避免二次污染。應用高通量測序技術，有助于更全面地了解腐敗番茄醬中的菌群結構，篩選出優(yōu)勢腐敗菌，對改良生產(chǎn)工藝和儲存條件、針對性添加抑菌劑、減少腐敗菌的污染和增殖有重要作用，也有助于提高番茄醬產(chǎn)品品質(zhì)。

本研究針對篩選到的番茄醬優(yōu)勢腐敗菌乳桿菌屬建立了基于實時熒光PCR 的快速定性檢測方法，相對于傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法節(jié)約了大量時間，經(jīng)過驗證最低穩(wěn)定檢出限為103CFU/mL，且具有良好的特異性和重復性，可以用于番茄醬中乳桿菌屬的快速檢測。測序結果表明在番茄醬腐敗過程中乳桿菌屬大量增殖，但細菌變化趨勢與產(chǎn)品腐敗程度的關系還不明確，隨著番茄醬腐敗的加重，關鍵致腐菌的變化趨勢還有待進一步研究。相較于傳統(tǒng)方法，本研究采用高通量測序可以對腐敗番茄醬中的菌群結構有更完整的認知，并利用實時熒光PCR 方法可以對番茄醬樣品的腐敗程度進行推斷。