草莓脫毒苗繼代和生根培養(yǎng)基優(yōu)化

常 寧，侯艷霞，盧愛英

（山西林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西太原 030009）

草莓無性繁殖過程中，易受病毒感染，導(dǎo)致大幅減產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)效益銳減。因此利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行莖尖脫毒培養(yǎng)至關(guān)重要。在草莓莖尖脫毒培養(yǎng)研究過程中，除了初代培養(yǎng)需要完善莖尖脫毒技術(shù)外，還需優(yōu)化繼代培養(yǎng)基，利于脫毒苗的快速繁殖，優(yōu)化生根培養(yǎng)基，培育出健壯的根系，提高后續(xù)移栽馴化的成活率。

草莓屬于叢生芽增殖型，在適宜的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)，不斷發(fā)生腋芽，從而形成叢生芽，大量叢生芽的發(fā)生即可實(shí)現(xiàn)大量繁殖的目的[1]。草莓脫毒苗增殖過程中，適當(dāng)添加植物激素和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可以增加株高、展葉數(shù)和增殖系數(shù)。研究表明，吲哚乙酸（IBA）濃度對(duì)草莓脫毒苗增殖有較大影響，一般情況下增殖系數(shù)隨IBA 濃度增加而增大，但較大濃度的IBA 也會(huì)導(dǎo)致脫毒苗玻璃體化或增加愈傷組織分化[2-3]。當(dāng)IBA 濃度低于0.5 mg/L 時(shí)，增殖系數(shù)隨6-BA 濃度增加而增大，但當(dāng)6-BA 的濃度超過1.0 mg/L 時(shí)，草莓苗不定芽會(huì)產(chǎn)生畸變或嚴(yán)重的玻璃化[3-4]。因此，嘗試不同6-BA 和IBA 的濃度配比，找出最有利于草莓叢生芽增殖的培養(yǎng)基，能為草莓脫毒苗的研究奠定基礎(chǔ)。天然有機(jī)附加物常含有氨基酸、激素和酶等成分復(fù)雜的天然營(yíng)養(yǎng)成分和生理活性物質(zhì)，因此可以促進(jìn)細(xì)胞增殖和組織分化[5-8]。有研究提出，在文心蘭、蝴蝶蘭、鐵皮石斛和馬鈴薯等植物組培中應(yīng)用有機(jī)附加物能不同程度地促進(jìn)試管苗的生長(zhǎng)[8]。常用的有機(jī)附加物有馬鈴薯汁、胡蘿卜汁、番茄汁、香蕉汁、玉米汁、西瓜汁以及小麥面粉等，其中馬鈴薯汁的促進(jìn)效果較好[7-8]，而草莓脫毒繼代培養(yǎng)中添加馬鈴薯汁的研究鮮見報(bào)道。

繼代脫毒苗生根過程中，植株需要從異養(yǎng)狀態(tài)轉(zhuǎn)化為自養(yǎng)狀態(tài)，而培養(yǎng)基中豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如N、P、K 鹽等易使瓶苗產(chǎn)生依賴性，造成生根困難。所以，生根培養(yǎng)基采用MS 培養(yǎng)基時(shí)，常適當(dāng)降低其中N、P、K 鹽的濃度，因此選用1/2 MS 培養(yǎng)基生根有較好的效果[9-10]。此外，不同類型的生長(zhǎng)素也會(huì)對(duì)生根的數(shù)量和質(zhì)量產(chǎn)生影響，一般來說NAA 容易誘導(dǎo)產(chǎn)生粗短的根[11]，但也要嚴(yán)格控制生長(zhǎng)素的用量，超過一定限度，則會(huì)加速形成愈傷組織，影響根的形成和生長(zhǎng)，一般NAA 濃度為0.1～1 mg/L為宜[12]。本研究主要探討了草莓脫毒苗繼代和生根培養(yǎng)基的優(yōu)化措施，以期篩選出有利于草莓脫毒苗繼代和生根的處理，為實(shí)現(xiàn)草莓脫毒苗工廠化、規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘紅顏’草莓，購(gòu)于山西太谷巨鑫偉業(yè)農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司。

六芐基腺嘌呤（6-BA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、MS 培養(yǎng)基（不含瓊脂和蔗糖）、瓊脂粉、蔗糖等，均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

奧科破壁料理機(jī)，WMS-PB108，深圳市萬(wàn)清智能電器有限公司；電磁爐，C21N，中山市雅樂思實(shí)業(yè)有限公司；立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器，GI80DS，致微（廈門）儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

將通過莖尖和熱處理相結(jié)合的脫毒方法獲得的初代脫毒苗，用于繼代培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)[13]。繼代培養(yǎng)的瓶苗，用于生根培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗(yàn)。

1.3.1 不同濃度6-BA 和IBA 的處理

繼代培養(yǎng)過程中，MS 培養(yǎng)基中添加了6-BA 和IBA，共6 種處理。其中，T1 處理為0.5 mg/L 6-BA；T2 處理為0.5 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IBA；T3 處理為0.8 mg/L 6-BA；T4 處理為0.8 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IBA；T5 處理為1.0 mg/L 6-BA；T6 處理為1.0 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IBA。每瓶接種3 株，每個(gè)處理接種10 瓶，接種總數(shù)為30株。培養(yǎng)20 d 后觀察并統(tǒng)計(jì)繼代苗生長(zhǎng)情況。

1.3.2 不同濃度馬鈴薯汁的處理

馬鈴薯汁的制作方法：帶芽馬鈴薯去皮切碎放入破壁機(jī)中，加適量蒸餾水榨成汁液[6]。根據(jù)加水比例不同，制成100 g/L 和200 g/L 備用。

馬鈴薯汁的濃度梯度設(shè)置兩個(gè)處理和一個(gè)對(duì)照，其中，T4 處理為0.8 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IBA；T7 處理為0.8 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IBA＋100 g/L 馬鈴薯汁；T8 處理為0.8 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA＋200 g/L 馬鈴薯汁。每瓶接種3 株，每個(gè)處理接種10 瓶，接種總數(shù)為30 株。培養(yǎng)20 d 后觀察并統(tǒng)計(jì)繼代苗生長(zhǎng)情況。

1.3.3 不同培養(yǎng)基和不同濃度NAA 的處理

生根培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基類型包括在MS 和1/2 MS兩種處理，NAA 的濃度梯度包括0 mg/L 和0.1 mg/L，共4種處理。其中，T9 處理為MS 培養(yǎng)基；T10 處理為MS 培養(yǎng)基＋0.1 mg/L NAA；T11 處理為1/2MS 培養(yǎng)基；T12 處理為1/2 MS 培養(yǎng)基＋0.1 mg/L NAA。每瓶接種1 株，每個(gè)處理接種30 瓶，接種總數(shù)為30 株。培養(yǎng)20 d 后觀察并統(tǒng)計(jì)生根苗生長(zhǎng)情況。

配制繼代和生根培養(yǎng)基時(shí)，1 L 培養(yǎng)基需要添加7 g瓊脂粉和30 g 蔗糖。調(diào)整電磁爐120 W 煮沸后，滴加1 mol/L 鹽酸或1 mol/L 氫氧化鈉將pH 值調(diào)至5.8。分裝后在高壓滅菌鍋中121 ℃下滅菌20 min，冷卻后待用。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

平均生根數(shù)和增殖系數(shù)計(jì)算公式見式（1）（2）[13]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010 和SPSS 26.0 軟件進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 繼代培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 不同濃度組合6-BA 和IBA 對(duì)草莓脫毒苗增殖系數(shù)的影響

由表1 可知，當(dāng)只添加6-BA 時(shí)，其濃度為0.5 mg/L和0.8 mg/L 時(shí)，繼代苗增殖系數(shù)分別為2.17 和2.23，但當(dāng)其濃度達(dá)到1 mg/L 時(shí)，增殖系數(shù)下降到1.83。這與袁倩等[4]的研究一致，可見當(dāng)6-BA 濃度過高時(shí)，不僅不利于叢生芽增殖，還會(huì)對(duì)其產(chǎn)生抑制作用。因此，要選擇合適濃度的6-BA，如0.5 mg/L 或0.8 mg/L。

表1 6-BA 和IBA 對(duì)草莓脫毒苗增殖系數(shù)的影響Table 1 Effects of 6-BA and IBA on multiplication coefficient of virus-free strawberry seedlings

為了探究IBA 對(duì)草莓脫毒苗叢生芽增殖的促進(jìn)作用，在6-BA 濃度為0.5 mg/L 的培養(yǎng)基中加入0.2 mg/L的IBA，增殖系數(shù)為2.57，與單獨(dú)使用0.5 mg/L 的6-BA培養(yǎng)基無顯著差異；在6-BA 濃度為0.8 mg/L 的培養(yǎng)基中加入0.2 mg/L 的IBA，增殖系數(shù)為3.20，與單獨(dú)使用0.8 mg/L 的6-BA 培養(yǎng)基有顯著差異。因此，培養(yǎng)基中添加0.8 mg/L 的6-BA+0.2 mg/L 的IBA 的處理更有利于草莓脫毒苗叢生芽增殖。

2.1.2 不同濃度馬鈴薯汁對(duì)草莓脫毒增殖系數(shù)的影響

在篩選出的MS＋0.8 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IBA 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加不同濃度馬鈴薯汁，結(jié)果見表2。由表可知，添加的馬鈴薯汁濃度為100 g/L 時(shí)，增殖系數(shù)由3.20 增加到4.17，差異顯著；當(dāng)添加的馬鈴薯汁濃度為200 g/L 時(shí)，增殖系數(shù)由3.20 增加到4.00，差異顯著。總體而言，考慮到成本問題，在MS＋0.8 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IBA 培養(yǎng)基中添加100 g/L 馬鈴薯汁的培養(yǎng)基為草莓苗繼代脫毒苗的最佳培養(yǎng)基。

表2 馬鈴薯汁對(duì)草莓脫毒苗增殖系數(shù)的影響Table 2 Effects of potato juice on multiplication coefficient of virus-free strawberry seedlings

2.2 生根培養(yǎng)基優(yōu)化

由表3 可知，相比于MS 培養(yǎng)基，1/2 MS 培養(yǎng)基平均生根數(shù)由2.47 增加到5.53，有顯著差異，根系也要繁茂。培養(yǎng)基在1/2 MS 基礎(chǔ)上，加入0.1 mg/L 的NAA 后，平均生根數(shù)由5.53 增加到6.80，有顯著差異，并且根更粗壯。另一方面，在MS 培養(yǎng)基中加入0.1 mg/L 的NAA 時(shí)，雖然平均生根數(shù)由2.47 增加到2.87，差異不顯著，但根相對(duì)粗壯。因此，一定濃度的NAA 可以改善草莓脫毒苗根系狀態(tài)繁茂度，提高移栽的成活率。綜上所述，生根培養(yǎng)基為1/2 MS＋0.1 mg/L NAA 時(shí)不論是平均生根數(shù)，還是從根系的生長(zhǎng)狀況來評(píng)估，均為最佳。

3 結(jié)論

本研究通過試驗(yàn)篩選出草莓脫毒苗繼代和生根培養(yǎng)基的優(yōu)化方案。結(jié)果表明，草莓脫毒苗繼代培養(yǎng)基選擇MS＋0.8 mg/L 6-BA＋0.2 mg/LIBA＋100 g/L 馬鈴薯汁，在相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)增殖系數(shù)最高，為4.17，相同生長(zhǎng)周期內(nèi)產(chǎn)生的叢生芽數(shù)量最多，能有效提高脫毒苗增殖效率。生根培養(yǎng)基選擇1/2 MS＋0.1 mg/L NAA，在相同培養(yǎng)條件下，平均生根數(shù)最多，為6.80，而且根系繁茂、粗壯，能提高后續(xù)移栽馴化的成活率。