塔里木裂腹魚尾鰭細胞系的建立及鹽堿度對其增殖的影響*

代金彩 聶竹蘭 趙年樺 任永麗 魏 杰

塔里木裂腹魚尾鰭細胞系的建立及鹽堿度對其增殖的影響*

代金彩 聶竹蘭①趙年樺 任永麗 魏 杰

(塔里木大學動物科學學院 新疆建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室 塔里木珍稀魚類研究中心 新疆 阿拉爾 843300)

為了建立塔里木裂腹魚()尾鰭細胞系，本研究采用組織塊法，分別用含胎牛血清(FBS)的DME/F12培養(yǎng)基體外培養(yǎng)塔里木裂腹魚尾鰭組織，初步建立了塔里木裂腹魚尾鰭細胞系(BICF1)。采用MTT法測定分析鹽度(NaCl)和堿度(NaHCO3)對其增殖的影響。結果顯示，BICF1懸浮培養(yǎng)傳至45代，最適培養(yǎng)液為DME/F12，最適FBS濃度為20%，最適溫度為25℃。第10代BICF1的群體倍增時間為28.11 h，呈“S”型生長。第6代BICF1液氮凍存180 d后復蘇，經臺盼藍染色計數(shù)，BICF1有(87.85±0.66)%的細胞具有活性，復蘇后可增殖并傳代。BICF1無細菌、真菌、支原體污染。第10代BICF1線粒體16S rRNA測序結果與GenBank基因序列進行一致性對比，結果顯示，BICF1與JQ844133.1的一致率為100%，表明BICF1來自于塔里木裂腹魚。BICF1增殖數(shù)量在鹽度為1、2、4、6時呈上升趨勢，在鹽度為6、8、10時呈下降趨勢；鹽度為6時，BICF1增殖數(shù)量最高。BICF1增殖數(shù)量在堿度為2、3、4、5、6 g/L時呈上升趨勢，在堿度為6、7、8、10 g/L時呈下降趨勢；堿度為6 g/L時，BICF1增殖數(shù)量最高。細胞增殖數(shù)量隨鹽堿度增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。本研究旨在為合理開發(fā)和利用塔里木裂腹魚遺傳資源以及建立和保護其種質資源提供一定的科學依據(jù)。

塔里木裂腹魚；尾鰭組織；細胞培養(yǎng)

國家二級保護動物塔里木裂腹魚()屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、裂腹魚亞科(Schizothpracinae)、裂腹魚屬()，俗稱“尖嘴魚”，是我國的特有物種(王德忠, 1998)。有關塔里木裂腹魚的報道主要集中在其地理分布(張人銘等, 2007)、形態(tài)特征(楊天燕等, 2018)、繁殖特性(魏杰等, 2011)、線粒體基因組DNA結構分析(楊天燕等, 2011)、遺傳標記開發(fā)(Luo, 2012)及遺傳多樣性(海薩等, 2016)等方面。

鹽堿度水平是影響硬骨魚類生存、繁殖、發(fā)育、生長和生理功能的最重要環(huán)境因素之一，會由于自然因素或人為因素而發(fā)生變化，從而對養(yǎng)殖魚類造成滲透調節(jié)脅迫，影響其正常生長(Resley, 2006)。水體中鹽堿度水平對魚類的存活有顯著影響，鹽堿度過高或過低都會使魚類的存活率顯著的降低(Yao, 2010)。魚類細胞系是進行病毒學、環(huán)境毒理學、分子遺傳學、基因功能分析、細胞遺傳學與種質保存等研究的材料和模型(周廣舟等, 2011)。草魚鰭細胞系可用于研究草魚源維氏氣單胞菌()對宿主細胞的毒性及致死機制(劉明珠等, 2019)；異育銀鯽()尾鰭細胞(GiCF)可用于辛硫磷對GiCF毒性研究 (趙燕楠等, 2020)；泥鰍()鰭細胞系用于研究銅、鋅對泥鰍鰭細胞DNA損傷及金屬硫蛋白表達的影響(姜姍等, 2020)。

本研究建立了塔里木裂腹魚尾鰭組織細胞系，測定了鹽度(NaCl)和堿度(NaHCO3)對其增殖的影響。本研究旨在為合理開發(fā)和利用塔里木裂腹魚遺傳資源以及建立和保護其種質資源提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用塔里木裂腹魚于2019年9月取自新疆克孜勒河，飼養(yǎng)在新疆建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室。取其中1條健康雌塔里木裂腹魚，體重為21.37g，全長為15.46 cm。

DME/F12、L-15、MEM、RPMI-1640、M199培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；磷酸緩沖液(PBS)、青霉素–鏈霉素雙抗、二甲基亞砜(DMSO)購自Solarbio公司；臺盼藍和0.25%胰酶購自Biotopped公司；MS-222購自漁夫寶公司；基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng) 取健康塔里木裂腹魚，加入0.1 μL/g的MS-222麻醉劑麻醉后，剪取上尾鰭。用75%的酒精對尾鰭進行消毒，置于超凈臺中。取4個培養(yǎng)皿，其中，1個加入75%的酒精，3個加入添加含500 IU/mL青霉素、500 μg/mL鏈霉素、12.5μg/mL兩性霉素B的PBS。尾鰭放入酒精中30 s，然后依次在另外3個培養(yǎng)皿中浸泡，之后將其放入2 mL無菌離心管中，并用無菌眼科剪將其剪成大約1～2 mm3的組織碎塊，向其中加入500 μL的DME/F12培養(yǎng)液，將組織碎塊移到25 mm2培養(yǎng)瓶中，正相放入25℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中，觀察細胞貼壁情況。4 h后反相放置，培養(yǎng)2 h后，向其中加入1 mL DME/F12培養(yǎng)液(含20% FBS、500 IU/mL青霉素、500 μg/mL鏈霉素、12.5 μg/mL兩性霉素B)，正相放入25℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，12 h后加入9 mL培養(yǎng)液，繼續(xù)正相放置培養(yǎng)。每天用倒置熒光顯微鏡(AMG EVOS F1)觀察組織塊遷移情況。

原代培養(yǎng)過程中，更換培養(yǎng)液的時間為2～4 d。當組織碎塊周圍遷出細胞，細胞濃度達106cells/mL時，按1∶2的比例進行傳代。直到第5代后，青霉素、鏈霉素的濃度降低到200 IU/mL和200 μg/mL，F(xiàn)BS濃度也降低到15%。到第8代后，使用含10% FBS和1% P/S的DME/F12培養(yǎng)液。

1.2.2 細胞生長曲線 將一定濃度的細胞接種到24孔細胞培養(yǎng)板，分成8組，每組6孔，連續(xù)7 d常規(guī)培養(yǎng)，用血球計數(shù)板進行計數(shù)，每天記1組，分析數(shù)據(jù)并繪制細胞生長曲線。細胞生長曲線的縱坐標為每天計數(shù)的細胞平均個數(shù)，時間為橫坐標。根據(jù)下面公式計算細胞的群體倍增時間：

=×lg/lg(N/0)

式中，N為時間后的細胞數(shù)，0接種細胞數(shù)(Nicholas, 1991)。

1.2.3 最佳培養(yǎng)基 檢測DME/F12、M199、L-15、MEM、RPMI-1640共5種不同培養(yǎng)基維持細胞生長的能力。每種培養(yǎng)基中均補充10% FBS和1% P/S。分別將一定濃度的細胞接種在不同的培養(yǎng)基中，在25℃、5%的CO2條件下培養(yǎng)96 h，在5個時間點，即0、24、48、72及96 h利用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)，繪制細胞的生長曲線。

1.2.4 最適培養(yǎng)溫度 檢測20℃、25℃、30℃和37℃不同溫度對細胞生長的影響。所用培養(yǎng)液為含10% FBS和1% P/S的DME/F12培養(yǎng)液。在25℃、5%的CO2條件下培養(yǎng)96 h，在5個時間點即0、24、48、72及96 h利用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)，繪制細胞的生長曲線。

1.2.5 最適血清濃度 確定最適合的培養(yǎng)液及溫度后，其他條件一致，設置不同F(xiàn)BS濃度(0、5%、10%和20%)，在25℃、5%的CO2條件下培養(yǎng)，在5個時間點，即0、24、48、72及96 h利用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)，繪制細胞生長曲線。

1.2.6 細胞凍存與復蘇 配制10% DMSO、20% FBS、70% DME/F-12的細胞凍存液，細胞濃度為2×106cells/mL，倒入冷凍管，液氮凍存。按細胞∶培養(yǎng)液=1∶5比例加入培養(yǎng)液使細胞懸浮，復蘇培養(yǎng)。

1.2.7 細胞污染鑒定 選用觀察法與PCR法檢測細胞是否被細菌、真菌、支原體污染。所用引物見表1。

1.2.8 細胞來源鑒定 利用動物組織基因組DNA提取試劑盒(DP304)提取塔里木裂腹魚尾鰭細胞的基因組DNA。通過PCR擴增提取DNA。根據(jù)塔里木裂腹魚16S rRNA設計引物，擴增引物為16SF和16SR (表1)。配制50 μL反應體系：25 μL 2×PCR MasterMix，引物各2.5 μL，5 μL模板DNA，15 μL的滅菌超純水。PCR反應條件：95℃預變性3 min；94℃變性30 s，56.8℃退火30 s，72℃延伸40 s，循環(huán)35次；72℃延伸10 min。擴增反應結束后，取1 μL PCR產物在核酸蛋白檢測儀上檢測DNA的濃度；取8 μL PCR產物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。PCR產物測序，比較獲得序列與已發(fā)表序列的一致率。

1.2.9 鹽堿度對塔里木裂腹魚細胞系增殖數(shù)量的影響 NaCl鹽度設置1、2、4、6、8、10共6個梯度。稱取NaCl加入DME/F12培養(yǎng)液溶解，溶解后再用0.22 μm過濾篩過濾。

NaHCO3堿度設置2、3、4、5、6、7、8、10 g/L共8個梯度。稱取NaHCO3加入DME/F12培養(yǎng)液溶解，溶解后再用0.22 μm過濾篩過濾。

細胞鋪板：將第10代對數(shù)生長期BICF1用含10%胎牛血清DME/F12培養(yǎng)液調整密度為1×104cells/mL的細胞懸液，鋪置于96孔細胞培養(yǎng)板上，每種材料鋪6孔。每孔加入100 μL細胞懸液，25℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，按分組分別加入不同濃度鹽和堿，各孔20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。之后將每個液體孔加入20 μL MTT后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸出各孔內液體，然后，每孔加入150 μL DMSO。搖床培養(yǎng)20 min，酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm波長下測定各孔的OD值。通過計算，得出細胞相對增殖率：

表1 通用引物序列

Tab.1 Universal primer sequence

相對增殖率=OD實驗組/OD空白對照組×100%。

使用SPSS 20軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以平均值±標準差(Mean±SD)表示，<0.05為差異具有顯著性。多組間比較用方差分析，兩組間比較采用檢驗。=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 塔里木裂腹魚尾鰭細胞原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)

觀察塔里木裂腹魚尾鰭細胞生長狀態(tài)。3 d后，細胞貼壁且組織塊周圍逐漸有細胞遷出；7 d后，細胞正常遷出；13 d后，細胞鋪滿細胞瓶70%；18 d后，細胞出現(xiàn)懸浮現(xiàn)象(圖1)；19 d后，進行原瓶傳代。細胞濃度到106cells/mL時，進行1∶2傳代，此后每隔2～4 d傳代1次。細胞懸浮生長，成功傳至45代。

2.2 塔里木裂腹魚尾鰭細胞生長曲線

塔里木裂腹魚尾鰭細胞系第10代細胞的生長曲線呈“S”型，0～1 d為潛伏期，1～4 d為指數(shù)生長期，4～5 d為平臺期，5 d之后為衰退期(圖2)。第10代塔里木裂腹魚尾鰭細胞的群體倍增時間為28.11 h，細胞分裂旺盛。

圖1 塔里木裂腹魚尾鰭細胞原代培養(yǎng)的不同階段

2.3 塔里木裂腹魚尾鰭細胞最佳培養(yǎng)基

塔里木裂腹魚尾鰭細胞在DME/F12、M199、L-15、MEM、RPMI-1640不同培養(yǎng)基中維持細胞生長的能力如圖3所示，在這些培養(yǎng)基中均能生長，但在DME/F12培養(yǎng)基中細胞生長最好。因此，DME/F12為最佳培養(yǎng)基(<0.05)。

2.4 塔里木裂腹魚尾鰭細胞最適培養(yǎng)溫度

塔里木裂腹魚尾鰭細胞在30℃生長最慢，25℃生長最快，20℃生長較快，在20℃～25℃范圍內，皆能良性生長(圖4)，生長的最適溫度為25℃(<0.05)。

2.5 塔里木裂腹魚尾鰭細胞最適血清濃度

塔里木裂腹魚尾鰭細胞在未加血清的培養(yǎng)基中生長明顯低于添加血清的細胞生長，隨著血清濃度5%、10%、20%依次增大，細胞生長依次加快，當FBS濃度為20%時，塔里木裂腹魚尾鰭細胞生長明顯最快(<0.05)(圖5)。

2.6 塔里木裂腹魚尾鰭細胞凍存與復蘇

對塔里木裂腹魚第6代尾鰭細胞系進行液氮冷凍，保存40、90及180 d后復蘇，經臺盼藍染色并計數(shù)統(tǒng)計，40 d存活率為(91.49±0.69)%，90 d存活率為(88.41±0.80)%，180 d存活率為(87.85±0.66)%，90和180 d存活率差異不顯著(>0.05)(表2)。細胞具有活性，且復蘇后增殖速度快(圖6)，可正常傳代(圖7)。

圖2 塔里木裂腹魚尾鰭細胞生長曲線

標有不同字母者表示組間差異顯著(<0.05)。下同。

Means with different letters are significantly different (<0.05). The same as below.

圖3 塔里木裂腹魚尾鰭細胞最佳培養(yǎng)基

小寫字母表示同一時間下BICF1多重比較。下同。

Indicated with lowercase letters for BICF1 multiple comparisons at the same time. The same as below.

圖4 塔里木裂腹魚尾鰭細胞最適培養(yǎng)溫度

圖5 塔里木裂腹魚尾鰭細胞最適血清濃度

表2 凍存后復蘇存活率

Tab.2 Survival rate of recovery after freezing

圖6 MTT法測定復蘇細胞增殖

2.7 塔里木裂腹魚尾鰭細胞污染與檢測鑒定

塔里木裂腹魚尾鰭細胞中提取細菌、真菌和支原體，經過PCR法鑒定細菌、真菌、支原體污染，樣品均無與陽性對照組一致的條帶，樣品中無細菌、真菌、支原體，塔里木裂腹魚尾鰭細胞未被污染。

2.8 塔里木裂腹魚尾鰭細胞來源鑒定

用基因組DNA試劑盒提取塔里木裂腹魚尾鰭細胞DNA，經PCR擴增，在瓊脂糖凝膠中電泳檢測，PCR產物目的條帶大小符合16S rRNA的大小。經測序后的序列片段與數(shù)據(jù)庫中的GenBank進行Blast比對。塔里木裂腹魚尾鰭細胞同源性與GenBank中發(fā)布的來源于塔里木裂腹魚線粒體基因(JQ844133.1)的序列達到100%；證明尾鰭細胞來自于塔里木裂腹魚。

圖7 塔里木裂腹魚尾鰭細胞復蘇培養(yǎng)

2.9 MTT法檢測各組鹽堿度的細胞增殖數(shù)量

2.9.1 鹽度對塔里木裂腹魚尾鰭細胞增殖數(shù)量的影響 在鹽度一定的情況下，BICF1的增殖數(shù)量隨時間延長而下降，鹽度對BICF1的相對增殖數(shù)量的抑制可隨時間延長而增強。BICF1增殖數(shù)量在鹽度為1、2、4、6時呈上升趨勢，在鹽度為6、8、10呈下降趨勢，鹽度為6時，BICF1增殖數(shù)量最高。BICF1增殖數(shù)量隨鹽度增加呈先升高后下降的趨勢(表3和圖8)。

2.9.2 堿度對塔里木裂腹魚尾鰭細胞增殖數(shù)量的影響 在堿度一定時，BICF1的增殖數(shù)量隨時間(24、48、72 h)延長而下降，堿度對BICF1的相對增殖數(shù)量的抑制隨時間延長而增強。在同一時間點上，BICF1增殖數(shù)量在堿度2、3、4、5、6 g/L時呈上升趨勢，在堿度為6、7、8、10 g/L時呈下降趨勢，堿度為6 g/L時，BICF1增殖數(shù)量最高。BICF1增殖數(shù)量隨NaHCO3堿度增加呈先升高后下降的趨勢(表4和圖8)。

3 討論

本研究以塔里木裂腹魚尾鰭組織為材料，采用組織塊移植法成功進行了塔里木裂腹魚尾鰭組織細胞原代培養(yǎng)，命名為BICFI。BICFI在10% FBS的DME/F12培養(yǎng)液中生長良好。細胞培養(yǎng)常用的培養(yǎng)液有L-15、MEM和M199，但不同的魚類對環(huán)境要求不盡相同，因此，不同魚類的最適培養(yǎng)基亦不同。青魚()尾鰭細胞系(BC-Fin)的最佳培養(yǎng)液為L-15(張雪萍等, 2016)；麥穗魚()鰭細胞系的最佳培養(yǎng)液為MEM(楊坤等, 2013)；匙吻鱘()鰭細胞系(PF-Fin)的最佳培養(yǎng)液為M199(肖藝等, 2010)；紅鰭東方鲀()鰭細胞系的最佳培養(yǎng)液為DMEM/F12(王縉云等, 2018)，本研究中篩選了DME/F12、L-15、MEM、RPMI-1640和M199培養(yǎng)基，得出DME/F12為最佳培養(yǎng)液。魚類組織細胞生長溫度范圍和哺乳類組織細胞比較，范圍比較廣。BICFI在20℃～25℃均能正常生長。研究表明，牙鲆()與鱸()鰭細胞系為廣溫性(童裳亮等, 1997)，本研究與已報道的魚類細胞的溫度適應范圍是一致的(Wang, 2010)，這與魚類是變溫動物有很大關系。在0、5%、10%、20%的FBS中生長時，未加FBS的生長速度明顯低于添加FBS的生長速度，在FBS為20%時生長最快，F(xiàn)BS濃度對細胞生長有明顯的影響，與已報道的研究相似(王縉云等, 2018)。本研究測定的第10代BICF1生長曲線呈“S”型生長曲線，1 d為指數(shù)生長期。紅鰭東方鲀鰭細胞系在2～4 d為指數(shù)生長期，4～5 d為平穩(wěn)期(王縉云等, 2018)，5 d之后為衰退期。與紅鰭東方鲀鰭細胞相比，BICF1進入指數(shù)生長期更快。

表3 鹽度對BICF1增殖的影響(Mean±SD)

Tab.3 Effects of salinity on BICF1 cell proliferation

注：標有不同字母表示組間有顯著差異(<0.05)，其中，大寫字母為不同鹽度同一時間下BICF1多重比較，小寫字母為同一鹽度不同時間下BICF1多重比較。下同。

Note: The means with different letters are significantly different (<0.05). The capital letters are BICF1 multiple comparisons at the same time with different salinity, and the small letters are BICF1 multiple comparisons at the same time with the same salinity. The same as below.

表4 NaHCO3堿度對BICF1增殖的影響

Tab.4 Effect of NaHCO3 alkalinity on BICF1 cell proliferation (Mean±SD)

圖8 不同濃度NaCl/NaHCO3對BICFI細胞增殖數(shù)量的影響

本研究塔里木裂腹魚BICF1呈懸浮生長。貼壁培養(yǎng)型的細胞，細胞膜表面含有大量黏附因子。這些黏附因子可激活不同的信號通路調節(jié)貼壁細胞的活性和增殖，如整合素(integrins)活化黏著斑激酶(focal adhesion kinase)激活信號通路抑制細胞內源性的凋亡(Zhong, 2012; Hofmann, 2007)。懸浮培養(yǎng)的細胞一般為淋巴細胞等血液系統(tǒng)來源的細胞，細胞體積小，缺乏粘附分子的表達(姬廣超等, 2020; 徐偉等, 2020)。在塔里木裂腹魚BICF1染色體的制備中發(fā)現(xiàn)，用0.075 mol/L的KCl低滲時間達90 min。有研究報道，棕點石斑魚(♀)×鞍帶石斑魚(♂) F1染色體制備中低滲時間為25 min (劉莉等, 2016)；鯉()染色體標本的制備中低滲的時間控制在35 min (耿波等, 2003)；黃顙魚()染色體標本的制備中低滲的時間控制在40 min (宋立民等, 2010)；灰海馬()染色體標本的制備中低滲的時間為50 min (劉鑫等, 2020)；報道的研究中低滲的時間在25～50 min。因此，推測塔里木裂腹魚BICF1細胞膜不易破裂，與BICF1細胞膜的堅韌程度有關。用物理方法進行貼壁型細胞的懸浮馴化時，使細胞發(fā)生失巢凋亡(anoikis)(王朋朋等, 2021)，無血清與生物反應器馴化使貼壁細胞產生失巢凋亡的拮抗。目前，MDCK(吳培培等, 2016)、BHK-21(趙彩紅等, 2019)、Hi5-SF(馬偉等, 2017)、PK15(劉天倫等, 2019)等被馴化。塔里木裂腹魚BICF1培養(yǎng)中可能產生類似于失巢凋亡的調節(jié)。塔里木裂腹魚腎細胞呈懸浮生長的狀態(tài)，可能與其體積和細胞膜表面粘附分子的表達及細胞膜堅韌程度有關，可能與類似于失巢凋亡的調節(jié)有關，具體原因有待于進一步研究。

細胞來源的鑒定通常采用16S rRNA、12S rRNA和Cytb等基因片段，本研究選擇16S rRNA進行鑒定，BICF1序列分析結果與塔里木裂腹魚基因序列一致性為100%，證明細胞系來自于塔里木裂腹魚。

塔里木裂腹魚曾是新疆博斯騰湖主要經濟魚類，由于開荒造田，農田鹽堿水大量排入湖水，鹽堿度逐年升高(劉立彭, 1983)。水體中鹽堿度水平對魚類存活有顯著影響，鹽堿度過高或過低都會顯著降低魚類的存活率(張雅芝等, 2009; 秦志清等, 2010)。在尼羅羅非魚()鹽堿度的耐受性研究中發(fā)現(xiàn)，鹽度為20時，僅少數(shù)個體能存活96 h；NaHCO3堿度為12 g/L時，96 h全部死亡(趙麗慧等, 2014)；對縊蟶()急性低鹽脅迫，并檢測當鹽度由2到0時，其存活率隨鹽度的下降而降低(李智等, 2020)；當碳酸鹽堿度為0～44.58 mmol/L、pH為9.0～10.0時，隨著碳酸鹽堿度濃度的上升，縊蟶的存活率明顯下降(葉博等, 2019)。本研究中，鹽度為1～6時，BICF1增殖數(shù)量上升；鹽度為6～10時，BICF1增殖數(shù)量下降；鹽度為6時，BICF1增殖數(shù)量最高。NaHCO3堿度為2～6 g/L時，BICF1增殖數(shù)量上升；堿度為6～10 g/L時，BICF1增殖數(shù)量下降；堿度為6 g/L時，BICF1增殖最高。本研究中，鹽堿度過高或過低都會使塔里木裂腹魚尾鰭細胞的存活率降低。紅鯽(red)鰭細胞系被建立被用于抗藥性和抗病性的研究，細胞系可用于毒性篩選和病毒分離的材料(Xiao, 2018)。草魚鰭細胞系用于研究草魚源維氏氣單胞菌對宿主細胞的毒性致死機制(劉明珠等, 2019)；異育銀鯽()尾鰭細胞(GiCF)用于辛硫磷對GiCF毒性研究，表明GiCF可作為農藥的細胞毒性研究材料(趙燕楠等, 2020)。本研究中，塔里木裂腹魚尾鰭細胞系可作為研究鹽堿度對塔里木裂腹魚的影響的材料，可為其選擇育種和功能基因研究提供良好的載體。

BABU V, NAMBI K, CHANDRA V,. Establishment and characterization of a fin cell line from Indian walking catfish,(L.). Journal of Fish Diseases, 2011, 34(5): 355–364

BEJAR J, BORREGO J J, ALVAREZ M C. A continuous cell line from the cultured marine fish gilt-head seabream (L.). Aquaculture, 1997, 150(1/2): 143–153

CLEW L W, MOEWUS L, SIGEL M M. Studies with cells from marine fish in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 1961, 108(3): 762–766

GENG B, LIANG L Q, SUN X W. The search for the blood lymphocytic cell cultivation of the common carp and the preparation of chromosomes. Chinese Journal of Fisheries, 2003(2): 32–34 [耿波, 梁利群, 孫效文. 鯉魚血淋巴細胞培養(yǎng)及染色體制備條件探索. 水產學雜志, 2003(2): 32–34]

GONG Q L, ZHENG L, ZHANG H L,. Testing lab animal dermatophytes using PCR method. Chinese Journal of Comparative Medicine, 2007, 17(3): 132–135 [龔巧玲, 鄭龍, 張換鈴, 等. PCR方法檢測實驗動物皮膚病原真菌. 中國比較醫(yī)學雜志, 2007, 17(3): 132–135]

GRAVELL M, MALSBERGER R. A permanent cell line from the fathead minnow (). Annals of the New York Academy of Sciences, 1965, 126(1): 555–565

HAYSA A, GUO Y, MENG W,. Genetic diversity and population differentiation ofbased on mtDNA control region sequences. Journal of Fishery Sciences of China, 2016, 23(4): 944–954 [海薩?艾也力汗, 郭焱, 孟瑋, 等. 基于線粒體控制區(qū)序列的塔里木裂腹魚遺傳多樣性及種群分化分析. 中國水產科學, 2016, 23(4): 944–954]

HOFMANN C, OBERMEIER F, ARTINGER M,. Cell-cell contacts prevent anoikis in primary human colonic epithelial cells. Gastroenterology, 2007, 132(2): 587–600

JI G C, WANG X M, SU M M,. Analysis of lymphocyte subsets to predict their killing activity. Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use, 2020, 13(27): 172–173 [姬廣超, 王曉明, 蘇苗苗, 等. 淋巴細胞的亞群分析預測其殺傷活性研究. 臨床合理用藥雜志, 2020, 13(27): 172–173]

JIANG S, LI X, LI Z Z,. Toxicity of copper sulfatde and zine chloride on DNA damage and metallothionein gene expression in loach cell lines. Fisheries Science, 2020, 39(3): 381–387 [姜姍, 李霞, 李狀狀, 等. 銅、鋅對泥鰍細胞DNA損傷及金屬硫蛋白表達的影響. 水產科學, 2020, 39(3): 381–387]

JIN M, HUANG A H, CHEN Z L,. Detection of common fungal pathogens by general primer PCR. Journal of Environment and Health, 2009, 26(11): 969–971 [金敏, 黃愛華, 陳照立, 等. 常見致病真菌通用引物PCR檢測技術研究. 環(huán)境與健康雜志, 2009, 26(11): 969–971]

KELLY R K, LOH P C. Some properties of an established fish cell line from(red swordtail). In Vitro, 1973, 9(2): 73–80

LI Z, PENG M X, YE B,. Effects of acute low salinity onsurvival rate, Na+/K+-ATPase activity and phagocytosis of hemocytes. Journal of Shanghai Ocean University, 2020, 29(4): 489–495 [李智, 彭茂瀟, 葉博, 等. 急性低鹽度對縊蟶存活率、Na+/K+-ATPase活性以及血淋巴細胞吞噬能力的影響. 上海海洋大學學報, 2020, 29(4): 489–495]

LIU L, ZHANG Y, CHEN C. Preparation of chromosomes and analysis of karyotypes of hybrid F1(♀×♂) groupers. Progress in Fishery Sciences, 2016, 37(2): 33–40 [劉莉, 張巖, 陳超, 等. 棕點石斑魚(♀)×鞍帶石斑魚(♂) F1染色體制備方法及核型分析. 漁業(yè)科學進展, 2016, 37(2): 33–40]

LIU L P. Comments on the Bosten Lake fishery and its resource multiplication. Freshwater Fisheries, 1983(3): 12–14 [劉立彭.博斯騰湖漁業(yè)及其資源增殖的意見. 淡水漁業(yè), 1983(3): 12–14]

LIU M Z, YU Q, XIAO H H,. Study on cytotoxicity and apoptosis ofto grass carp pectoral fin cell. Journal of Guangxi Academy of Sciences, 2019, 35(3): 213–218 [劉明珠, 余慶, 肖賀賀, 等. 維氏氣單胞菌對草魚背鰭細胞的毒性及凋亡研究. 廣西科學院學報, 2019, 35(3): 213–218]

LIU T L, LANG H B, KONG S. Domestication of a PK15 cell line to suspension culture by serum-free medium. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2019, 53(9): 12–18 [劉天倫, 郎洪彬, 孔颯. PK15細胞的無血清全懸浮馴化研究. 中國獸藥雜志, 2019, 53(9): 12–18]

LIU X, ZHANG D, LIN T T,. Chromosome preparation and karyotype of the lined seahorse (). Journal of Fisheries of China, 2020, 44(6): 907–914 [劉鑫, 張東, 林聽聽, 等. 灰海馬染色體制備及核型分析. 水產學報, 2020, 44(6): 907–914]

LUO W, NIE Z L, ZHAN F B,. Rapid development of microsatellite markers for the endangered fish(Günther) using next generation sequencing and cross-species amplification. International Journal of Molecular Sciences, 2012, 13(11): 14946–14955

MA W, WANG J M, MA G L,. Establishment and identification of Hi5-SF suspension cell line. Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica, 2017, 26(2): 173–178 [馬偉, 王家敏, 馬桂蘭, 等. Hi5-SF懸浮細胞系的建立及鑒定. 西北農業(yè)學報, 2017, 26(2): 173–178]

NICHOLAS H A, TERRY R, ALLEN W,. Evaluation of flow cytometric methods for determining population potential doubling times using cultured cells. Cytometry Part A, 1991, 12(3): 234–241

NICHOLSON B L, BYRNE C. An established cell line from the Atlantic salmon (). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 1973, 30(70): 913–916

QIN Z Q, ZHANG Y Z, LIN Y J,. Effects of salinity on growth and survival of young. Chinese Journal of Fisheries, 2010, 23(2): 1–5 [秦志清, 張雅芝, 林越赳, 等. 鹽度對漠斑牙鲆幼魚生長與存活的影響. 水產學雜志, 2010, 23(2): 1–5]

RESLEY M J, WEBB Jr. K A, HOLT G J. Growth and survival of juvenile cobia,, at different salinities in a recirculating aquaculture system. Aquaculture, 2006, 253(1/2/3/4): 398–407

SONG L M, WANG W M, WANG Y F. The tissue cultivation of fins and preparation of chromosomes in yellow catfishJournal of Dalian Ocean University, 2010, 25(6): 502–505 [宋立民, 王衛(wèi)民, 王玉芬. 黃顙魚鰭組織培養(yǎng)及染色體制備條件的研究. 大連海洋大學學報, 2010, 25(6): 502–505]

SWAMINATHAN T R, LAKRA W S, GOPALAKRISHNAN A,. Development and characterization of a new epithelial cell line PSF from tail fin of green chromide,(Bloch, 1790). In Vitro Cellular and Developmental Biology-Animal, 2010, 46(8): 647–656

TONG S L, LI H, MIAO H Z. Four continuous cell lines of three marine fish species were established. Progress in Biomedical Engineering, 1997, 17(3): 3–4 [童裳亮, 李宏, 苗宏志. 牙鲆、鱸魚和真鯛的四個永生性細胞系建立. 生物工程進展, 1997, 17(3): 3–4]

WAN Y J, ZHANG J L, AN J. Rapid detection of bacterial or microbial contamination in cell cultures. Journal of Regional Anatomy and Operative Surgery, 2005, 14(2): 88–90 [萬穎杰, 張俊磊, 安靜. 細胞培養(yǎng)中細菌類微生物污染的快速檢測. 同解手術學雜志, 2005, 14(2): 88–90]

WANG D Z. The Schiz. Othoracinae fish in Xinjing. Arid Zone Research, 1998, 15(4): 26–32 [王德忠. 新疆的裂腹魚亞科魚類研究. 干旱區(qū)研究, 1998, 15(4): 26–32]

WANG J Y, LI X, QIN Y J,. Establishment and characterization of fin cell lines from redfin puffer. Journal of Dalian Ocean University, 2018, 33(6): 703–708 [王縉云, 李霞, 秦艷杰, 等. 紅鰭東方鲀鰭細胞系的建立及生長特性研究. 大連海洋大學學報, 2018, 33(6): 703–708]

WANG P P, HUANG S L, ZHANG Y K,. Research progress on serum free suspension culture of mammalian cells. China Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2021, 48(3): 839–845 [王朋朋, 黃書林, 張云科, 等. 哺乳動物細胞無血清全懸浮培養(yǎng)技術研究進展. 中國畜牧獸醫(yī), 2021, 48(3): 839–845]

WANG X L, CHEN S L, SHA Z X,. Establishment and characterization of a new cell line from the kidney of spotted halibut. Periodical of Ocean University of China, 2010, 9(2): 162–168

WEI J, NIE Z L, LI J,. Morphological and histological observation of gonadal development of Tarim. Journal of Dalian Ocean University, 2011, 26(3): 227–231 [魏杰, 聶竹蘭, 李杰, 等. 塔里木裂腹魚性腺形態(tài)學與組織學的研究. 大連海洋大學學報, 2011, 26(3): 227–231]

WEI L, NIE Z L, ZHAN F B,. Rapid development of microsatellite markers for the endangered fish(Günther) using next generation sequencing and cross-species amplification. International Journal of Molecular Sciences, 2012, 13: 14946–14955

WEI Y Z, LU R H, BAI G D. Establishment of grass carp () caudal fin diploid cell line GCCF-2 and analysis of some of its biological characteristics. Journal of Fisheries of China, 1987, 11(4): 269–275 [魏彥章, 陸仁后, 白國棟. 草魚尾鰭組織二倍體細胞系GCCF-2的建立及其部分生物學特性分析. 水產學報, 1987, 11(4): 269–275]

WOLF K, QUIMBY M. Established eurythermic line of fish cells in vitro. Science, 1962, 135(3508): 1065–1066

WU P P, TANG Y H, CHU X,. Domestication of MDCK suspension cell lines for the H9 subtype of avian influenza virus proliferation and its biological characteristics evaluation. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences, 2016, 32(6): 1377–1383 [吳培培, 唐應華, 褚軒, 等. 適應H9亞型禽流感病毒增殖的MDCK懸浮細胞株的馴化及其生物學特性. 江蘇農業(yè)學報, 2016, 32(6): 1377–1383]

XIAO J, FU W M, ZHOU W,. Establishment of fin cell lines and their use to study the immune gene expression in cyprinid fishes with different ploidy in rhabdovirus infection. Developmental and Comparative Immunology, 2018, 88: 55–64

XIAO Y, ZENG L B, LI X L,. Establishment and characterization of a cell line derived from fin of paddlefish,. Chinese Journal of Cell Biology, 2010, 32(4): 533–540 [肖藝, 曾令兵, 李曉莉, 等. 匙吻鱘鰭條組織細胞系的建立及其生物學特性. 中國細胞生物學學報, 2010, 32(4): 533–540]

XU W, FANG S J, GUAN R,. Immunomodulatory effect ofKoidz polysaccharides on mouse lymphocytes. Chinese Journal of Immunology, 2020, 36(13): 1573–1577 [徐偉, 方思佳, 關然, 等. 白術多糖對小鼠淋巴細胞的免疫調節(jié)作用. 中國免疫學雜志, 2020, 36(13): 1573–1577]

YAN W, NIE P, LU Y. Establishment, characterization and viral susceptibility of a new cell line derived from goldfish,(L.) tail fin. Journal of Fish Diseases, 2011, 34(10): 757–768

YANG K, ZHU D M, WANG W M. Studies on fin tissue cultivation, Ag-NORS and C-banding patterns of. South China Fisheries Science, 2013, 9(3): 20–25 [楊坤, 祝東梅, 王衛(wèi)民. 麥穗魚鰭條組織培養(yǎng)及染色體Ag-NORs和C-帶研究. 南方水產科學, 2013, 9(3): 20–25]

YANG T Y, MENG W, GUO Y,. The multivariate morphometric analysis ofand. Journal of Zhejiang Ocean University (Natural Science), 2018, 37(3): 221–227 [楊天燕, 孟瑋, 郭焱, 等. 塔里木裂腹魚和厚唇裂腹魚多變量形態(tài)學分析. 浙江海洋大學學報(自然科學版), 2018, 37(3): 221–227]

YANG T Y, ZHANG R M, GUO Y,. Comparative study on partial mitochondrial COI gene ofand. Journal of Hydroecology, 2011, 32(1): 45–50 [楊天燕, 張人銘, 郭焱, 等. 扁吻魚和塔里木裂腹魚線粒體COI基因片段的比較研究. 水生態(tài)學雜志, 2011, 32(1): 45–50]

YAO Z L, LAI Q F, ZHOU K,. Developmental biology of medaka fish () exposed to alkalinity stress. Journal of Applied Ichthyology, 2010, 26(3): 397–402

YE B, CHENG Z Y, PENG M X,. Effects of pH and carbonate alkalinity on survival rate, Na+/K+-ATPase activity and phagocytic ability of the razor clam (). Journal of Fisheries of China, 2019, 43(8): 1723–1732 [葉博, 程之揚, 彭茂瀟, 等. 急性pH和碳酸鹽堿度對縊蟶存活率、Na+/K+-ATPase活性及血淋巴吞噬能力的影響. 水產學報, 2019, 43(8): 1723– 1732]

ZHANG N C, YANG G Z. The establishment of strain ZC-7901 and substrain ZC-7901S1, from the snout tissue cells of grass carp. Journal of Fisheries of China, 1981, 5(2): 111–118 [張念慈, 楊廣智. 草魚吻端組織細胞株ZC-7901及其亞株ZC-7901S1的建立和特性觀察. 水產學報, 1981, 5(2): 111–118]

ZHANG R M, GUO Y, MA Y W,. A Survey on the resource and distribution ofgunther. Freshwater Fisheries, 2007, 37(6): 76–78 [張人銘, 郭焱, 馬燕武, 等. 塔里木裂腹魚資源與分布的調查研究. 淡水漁業(yè), 2007, 37(6): 76–78]

ZHANG X P, ZENG L B, CHEN Q,. Establishment and characterization of a cell line derived from fin of. Freshwater Fisheries, 2016, 46(2): 3–9 [張雪萍, 曾令兵, 陳倩, 等. 青魚鰭條組織細胞系的建立及其生物學特性. 淡水漁業(yè), 2016, 46(2): 3–9]

ZHANG Y Z, LIU D E, FANG Q S,. Effects of temperature and salinity on growth and survival rate of young. Journal of Jimei University (Natural Science), 2009, 14(1): 8–13 [張雅芝, 劉冬娥, 方瓊珊, 等. 溫度和鹽度對斜帶石斑魚幼魚生長與存活的影響. 集美大學學報(自然科學版), 2009, 14(1): 8–13]

ZHAO C H, WANG M H, ZANG R X,. Growth characteristics and tumorigenic of suspension cultured BHK-21 cells. Journal of Northwest Minzu University (Natural Science), 2019, 40(4): 53–59 [趙彩紅, 王美皓, 臧榮鑫, 等. 懸浮培養(yǎng)型BHK-21細胞生長特性及成瘤性研究. 西北民族大學學報(自然科學版), 2019, 40(4): 53–59]

ZHAO L H, JIA J H, ZHANG Y H,. The tolerance and growth of three strains ofin salinity-alkalinity water. Progress in Fishery Sciences, 2014, 35(5): 26–32 [趙麗慧, 筴金華, 張艷紅, 等. 3種品系尼羅羅非魚()鹽堿耐受性和生長比較. 漁業(yè)科學進展, 2014, 35(5): 26–32]

ZHAO Y N, ZHOU H Z, LI W J,. Transcriptome analysis of the caudal fin cell line of silver crucian carp ()(GiCF) affected by the pesticide phoxim. Genomics and Applied Biology, 2020, 39(11): 4953–4963 [趙燕楠, 周宏正, 李婉娟, 等. 辛硫磷脅迫對異育銀鯽細胞基因表達的影響. 基因組學與應用生物學, 2020, 39(11): 4953–4963]

ZHONG X, RESCORLA F J. Cell surface adhesion molecules and adhesion-initiated signaling: Under- standing of anoikis resistance mechanisms and therapeutic opportunities. Cellular Signalling, 2012, 24(2): 393–401

ZHOU G, GUI L, LI Z,. Establishment of a Chinese sturgeontail-fin cell line and its susceptibility to frog iridovirus. Journal of Fish Biology, 2008, 73(8): 2058–2067

ZHOU G Z, JING H J. Application development of fish cell lines on virology research. Letters in Biotechnology, 2011, 3: 21–26 [周廣舟, 景紅娟. 魚類細胞系在病毒學研究中的應用進展. 生物技術通訊, 2011, 3: 21–26]

ZUO W G, QIAN H X, XU Y F,. Establishment of kidney cell lines CIK from grass carp. Freshwater Fisheries, 1984, 14(2): 38–39 [左文功, 錢華鑫, 許映芳, 等. 草魚腎臟組織細胞系CIK的建立. 淡水漁業(yè), 1984, 14(2): 38–39]

Establishment and the Effect of Salinity of Cell Lines Derived from Tail Fin of

DAI Jincai, NIE Zhulan①, ZHAO Nianhua, REN Yongli, WEI Jie

(College of Animal Science, Tarim University; Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology,Xinjiang Production and Construction, Alar, Xinjiang 843300, China)

To establish the caudal fin cell line of, this study employed the tissue block method with fetal bovine serum (FBS) DME/F12 medium forcultivation of the tail fin, using previously established tail-fin cell lines (BICF1) ofIn this study, the effect of NaCl salinity and NaHCO3alkalinity on the proliferation of tail fin cells was investigated using the MTT method. The main results are as follows: the BICF1 suspension culture was propagated to 45 generations. The optimum medium was DME/F12. The optimal FBS concentration was determined to be 20%. The optimum temperature was 25℃. The population doubling time of the 10th generation BICF1 was 28.11 h, showing an "S" type growth. The 6th generation BICF1 in liquid nitrogen was recovered after freezing for 180 days. Trypan blue staining showed that after recovery, (87.85±0.66)% of BICF1 cells were active, and the cells could proliferate and pass to next generation. The BICF1 cell line is free of contamination by bacteria, fungi, and mycoplasma. The sequencing results of mitochondrial 16S rRNA of the 10th generation BICF1 were consistent with the GenBank gene sequence, and the consistency rate of BICF1 and JQ844133.1 was 100%, proving that BICF1 was fromBICF1 cell proliferation increased with salinity of 1, 2, 4, and 6, but decreased with salinity of 6, 8, and 10; BICF1 cell proliferation was the highest at 6. The NaHCO3alkalinity of BICF1 increased at 2, 3, 4, 5, and 6 g/L, whereas the proliferation of BICF1 cells decreased at 6, 7, 8, and 10 g/L, respectively. BICF1 cell proliferation was the highest at 6 g/L. Cell proliferation first increased and then decreased with increasing salinity and alkalinity. This study aimed to provide a scientific basis for the rational development and utilization of genetic resources of,includingthe establishment and protection of the germplasm.

; Tail fin; Cell culture

NIE Zhulan, E-mail: niezhl2004@163.com

10.19663/j.issn2095-9869.20210412003

Q952

A

2095-9869(2022)04-0070-11

*國家自然科學基金(31560721; 31860729)、自治區(qū)研究生科研創(chuàng)新項目(TDGRI201918)、國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(202010757007)、中國海洋大學塔里木大學科研合作聯(lián)合基金項目(ZHYLH201902)和華中農業(yè)大學塔里木大學科研合作聯(lián)合基金項目(TDHNLH201702; 2662017PY118)共同資助 [This work was supported by National Natural Science Foundation of China (31560721; 31860729), Research and Innovation Program for Graduate Students of Autonomous Region (TDGRI201918), Undergraduate Innovation and Entrepreneurship Training Program (202010757007), Joint Research Fund between Ocean University of China and Tarim University (ZHYLH201902), and Huazhong Agricultural University and Tarim University Research Cooperation Joint Fund Project (TDHNLH201702; 2662017PY118)].

代金彩，E-mail: 1477496028@qq.com

聶竹蘭，教授，E-mail: niezhl2004@163.com

2021-04-12,

2021-05-22

http://www.yykxjz.cn/

代金彩, 聶竹蘭, 趙年樺, 任永麗, 魏杰. 塔里木裂腹魚尾鰭細胞系的建立及鹽堿度對其增殖的影響. 漁業(yè)科學進展, 2022, 43(4): 70–80

DAI J C, NIE Z L, ZHAO N H, REN Y L, WEI J. Establishment and the effect of salinity of cell lines derived from tail fin of. Progress in Fishery Sciences, 2022, 43(4): 70–80

(編輯 馮小花)