新型阿卡斑病毒SYBR Green I熒光定量RT-PCR建立及廣西邊境地區(qū)蚊攜帶新型阿卡斑病毒調(diào)查

馬 玲，孟 菲，陸晨陽，陳赫威，蔡 暢，秦樹英，覃紹敏，劉金鳳，陳鳳蓮，吳健敏

（廣西獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001）

0 引言

【研究意義】阿卡斑病毒（Akabane vrius，AKAV）是一種以吸血昆蟲為傳播媒介的蟲媒病毒，主要感染牛和羊等動(dòng)物，造成母畜流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎及胎兒畸形，且可通過垂直傳播侵害胎兒中樞神經(jīng)，導(dǎo)致積水性無腦綜合癥和新生胎兒關(guān)節(jié)彎曲（謝佳芮等，2019）。AKAV引起的赤羽病目前主要流行于熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)，在我國廣泛流行；除牛、羊外，AKAV還可感染馬、水牛和駱駝，曾在豬、兔、牦牛、河馬、長頸鹿、大象，甚至靈長類動(dòng)物中檢出AKAV抗體，嚴(yán)重威脅著草食動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展及野生動(dòng)物安全，已被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病和國際動(dòng)物貿(mào)易的重點(diǎn)檢疫對(duì)象，也是我國進(jìn)口牛、羊必檢的疫病之一（Murakami et al.，2017；原愷，2019）。2016年，本課題組在廣西竹鼠中分離獲得新型AKAV，首次證實(shí)AKAV可感染嚙齒動(dòng)物（Tang et al.，2017）；與傳統(tǒng)毒株相比，新型AKAV毒力增強(qiáng)、臨床癥狀有明顯變化，說明在宿主范圍和致病性上已發(fā)生改變。隨后，云南、廣東、四川、湖南、海南等周邊省份相繼在牛、蠓蟲、三帶喙庫蚊、中華按蚊及致倦庫蚊等物種中發(fā)現(xiàn)與新型AKAV高度同源的毒株，推測新型AKAV已在一定范圍內(nèi)流行（宋頌，2018；范娜，2019；孟錦昕等，2019；吳德等，2019；Cao et al.，2019）。因此，亟待建立更靈敏、更準(zhǔn)確的檢測方法，加強(qiáng)對(duì)新型AKAV的監(jiān)控及科學(xué)評(píng)估其傳播的潛在風(fēng)險(xiǎn)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】AKAV隸屬于布尼亞病毒目（Bunyavirales）周布尼亞病毒科（Peribunyaviridae）正布尼亞病毒屬（），為分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組全長12 kb，由S、M、L共3個(gè)基因節(jié)段構(gòu)成（Wang et al，2017，2019；Chen et al.，2021）。S基因編碼核衣殼蛋白（N）和非結(jié)構(gòu)蛋白（NSs），高度保守。其中，N蛋白存在3個(gè)抗原表位，具有群特異性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體；而NSs蛋白可干擾細(xì)胞蛋白合成并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。M基因高度變異，編碼病毒囊膜糖蛋白（Gn和Gc），具有型特異性，分別誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體和血凝抑制抗體（Wernike et al，2017；Yanase et al，2017）。Tang等（2017）通過分析新型AKAV基因序列，發(fā)現(xiàn)該毒株S基因具有我國牛源AKAV毒株的遺傳特征，而M基因與日本、韓國強(qiáng)致病性AKAV毒株的同源性更高。目前，普遍認(rèn)為AKAV只存在1個(gè)血清型，但通過S基因和M基因進(jìn)化分析可將全球的AKAV毒株分為4個(gè)基因型（亞洲型、澳洲型、其他型和第四型），其中基因I型（亞洲型）又可分為Ia和Ib亞型，包括新型AKAV在內(nèi)的我國分離毒株多屬于Ia亞型（Kobayashi et al.，2007）。因此，很多研究以S基因、M基因作為AKAV核酸檢測靶基因，如RT-PCR（唐海波等，2018）、套式RT-PCR、熒光定量RT-PCR（Golender etal.，2018；孟錦昕等，2020）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（張吉紅等，2013），以及針對(duì)新型AKAV的RT-PCR檢測方法（唐海波等，2018）。RT-PCR操作簡便，但敏感性略低；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增等方法具有獨(dú)特的擴(kuò)增模式，但引物設(shè)計(jì)較復(fù)雜；而熒光定量RT-PCR具有操作簡便、特異、敏感、準(zhǔn)確性高、高通量等優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于病原微生物檢測?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由于蚊蟲中病毒載量較低，傳統(tǒng)的PCR難以檢出，因此亟需更靈敏、更準(zhǔn)確的檢測方法以開展新型AKAV監(jiān)測，為有效防控新型AKAV提供科學(xué)依據(jù)，但目前尚無針對(duì)新型AKAV的熒光定量RT-PCR檢測方法，也鮮見我國邊境地區(qū)新型AKAV流行情況的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分別針對(duì)新型AKAV的S基因和M基因主要變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，建立靈敏、準(zhǔn)確的SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測方法，并結(jié)合序列測定開展廣西邊境地區(qū)蚊攜帶新型AKAV調(diào)查，旨在了解其流行趨勢及遺傳進(jìn)化特征，為建立重要蚊媒病毒病預(yù)警機(jī)制提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

核酸抽提試劑盒MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 9767、PrimeScriptRT Master Mix（RR036Q）、Premix（RR003Q）、pMD18-T 載體（6011）和SYBR Premix ExII（RR820A）購自寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP209）及質(zhì)粒抽提試劑盒（CW0500A）購自天根生物科技（北京）有限公司；病毒RNA提取試劑盒（CW0586）購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DMEM（12800-017）和胎牛血清（10099-141）購自賽默飛世爾公司；Vero細(xì)胞、竹鼠圓環(huán)病毒、藍(lán)舌病病毒、鹿流行性出血熱病毒、布魯氏桿菌由廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。熒光定量PCR儀（Accurate 96型）購自大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank已公布新型AKAV毒株GXLCH16-70的S基因（KY381274）和M基因（KY381280）序列設(shè)計(jì)特異性引物（表1），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 SYBR Green I熒光定量RT-PCR建立

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備 以感染新型AKAV的Vero細(xì)胞基因組提取物為模板，采用引物AKAVSF/SAKAVSR、AKAVMF/AKAVMR分別擴(kuò)增S基因和M基因片段，然后按經(jīng)典分子克隆方法連接至pMD18-T載體上。抽提陽性克隆質(zhì)粒pMD-AKAVS和pMDAKAVM，利用分光光度計(jì)測定質(zhì)粒濃度并計(jì)算其拷貝數(shù)，分別制備1.0×10copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)10倍梯度稀釋后作為SYBR Green I熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)品（馬玲等，2017）。

1.3.2 SYBR Green I熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件優(yōu)化 在不同引物濃度（2、4、5、6和10 μmol/L）、退火溫度（58、60、62、64、66和68 ℃）、Mg濃度（0、0.5和1.0 μmol/L）、兩步法或三步法等條件下進(jìn)行SYBR Green I熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，通過值、標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率、相關(guān)系數(shù)、擴(kuò)增效率及擴(kuò)增準(zhǔn)確性等指標(biāo)確定最佳反應(yīng)條件。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立及結(jié)果判定 在10～10copies/μL的濃度范圍內(nèi)，以10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品pMDAKAVS和pMD-AKAVM為模板進(jìn)行SYBR Green I熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，并繪制熔解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 SYBR Green I熒光定量RT-PCR評(píng)價(jià)

1.4.1 特異性試驗(yàn) 應(yīng)用針對(duì)新型AKAV建立的SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測藍(lán)舌病病毒、鹿流行性出血熱病毒、竹鼠圓環(huán)病毒和布魯氏桿菌，測定各樣品值；同時(shí)檢測轉(zhuǎn)染新型AKAV的Vero細(xì)胞，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.4.2 靈敏性和檢測范圍 分別以濃度為1.0×10～1.0×10copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品pMD-AKAVS、1.0×10～1.0×10copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品pMD-AKAVM為模板，應(yīng)用建立的SYBR Green I熒光定量RT-PCR進(jìn)行檢測。

1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 分別以濃度為1.0×10～1.0×10copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品pMD-AKAVS、1.0×10～1.0×10copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品pMD-AKAVM為模板，進(jìn)行3次批內(nèi)和3次批間的SYBR Green I熒光定量RT-PCR重復(fù)試驗(yàn)，即每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。計(jì)算每個(gè)稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV），以評(píng)價(jià)SYBR Green I熒光定量RT-PCR的可重復(fù)性（馬玲等，2014）。

1.5 蚊樣品采集及分類

2019年6—10 月，在廣西邊境地區(qū)、口岸城市的防城港市、東興市、北海市、寧明縣、龍州縣、大新縣、靖西縣及那坡縣等8個(gè)市（縣）采集阿蚊（760只）、伊蚊（41只）、按蚊（48只）和庫蚊（3038只）共3887只，根據(jù)采樣地和蚊種合并為139份，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 新型AKAV檢測及變異分析

將139份蚊樣品置于無菌EP管中，每份加入500～800 μL PBS，用組織研磨儀研磨蚊樣品；12000 r/min離心20 min，取上清液；按照病毒RNA提取試劑盒說明提取病毒RNA，分別采用RT-PCR和SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測新型AKAV。同時(shí)，采用熒光定量RT-PCR引物AKAVSF/AKAVSR通過RTPCR擴(kuò)增新型AKAV，回收陽性樣品目的基因片段進(jìn)行測序，采用ClustalW構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 SYBR Green I熒光定量RT-PCR的建立

2.1.1 反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序優(yōu)化 根據(jù)t值、標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增效率及準(zhǔn)確性等指標(biāo)，確定新型AKAV的S基因和M基因SYBR Green I熒光定量RT-PCR最佳反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序。其中，2對(duì)引物的最佳使用濃度均為4 μmol/L（圖1），退火溫度分別64和66 ℃（圖2）；由于添加Mg對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響不明顯，故不再額外添加。即SYBR Green I熒光定量RTPCR最佳反應(yīng)體系：SYBR Premix ExII 10.0 μL，上、下游引物（4 μmol/L）各1.0 μL，標(biāo)準(zhǔn)品或反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.0 μL，雙蒸水補(bǔ)齊至20.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃30 s，64 ℃（S基因）/66 ℃（M基因）30 s，72 ℃30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 采用優(yōu)化的SYBR Green I熒光定量RT-PCR擴(kuò)增梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)樣品，每濃度標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)3個(gè)平行。以標(biāo)準(zhǔn)樣品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)、值為縱坐標(biāo)，采用Excel 2013繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算相關(guān)系數(shù)。結(jié)果（表2）顯示，新型AKAV的S基因、M基因分別在1.0×10～1.0×10copies/μL和1.0×10～1.0×10copies/μL間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增效率分別為98.61%和105.81%。優(yōu)化的SYBR Green I熒光定量RT-PCR敏感性好、檢測范圍寬，且無引物二聚體和非特異性擴(kuò)增，適合臨床檢測。根據(jù)SYBR Green I熒光定量RT-PCR收集的熒光信號(hào)，若待測樣品熒光信號(hào)超過閾值且≤35，同時(shí)擴(kuò)增曲線為平滑的S形，則可判定待測樣品中含有新型AKAV。

2.2 SYBR Green I熒光定量RT-PCR評(píng)價(jià)結(jié)果

2.2.1 檢測特異性 選取牛、羊、竹鼠病原進(jìn)行新型AKAV的S基因和M基因檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藍(lán)舌病病毒、鹿流行性出血熱病毒、竹鼠圓環(huán)病毒和布魯氏桿菌均不能有效擴(kuò)增，僅新型AKAV擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。說明針對(duì)新型AKAV S基因和M基因設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物可與新型AKAV特異性結(jié)合，但不能結(jié)合其他牛、羊、竹鼠病原，即建立的SYBR Green I熒光定量RT-PCR特異性強(qiáng)。

2.2.2 檢測靈敏性及其范圍 由圖1可確定，SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測新型AKAV S基因和M基因的拷貝數(shù)范圍分別為1.0×10～1.0×10copies/μL和1.0×10～1.0×10copies/μL，對(duì)應(yīng)的檢測限為1.0×10copies/μL和1.0×10copies/μL。

2.2.3 檢測重復(fù)性 SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測新型AKAV S基因的批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)CV為0.15%～2.88%，批間重復(fù)試驗(yàn)CV為0.49%～3.56%（表3）；SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測新型AKAV M基因的批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)CV為0.16%～1.09%，批間重復(fù)試驗(yàn)CV為0.20%～4.35%（表4）?？梢?，建立的SYBR Green I熒光定量RT-PCR均具有較好的重復(fù)性。

2.3 廣西邊境地區(qū)蚊樣品新型AKAV檢測結(jié)果

采用建立的SYBR Green I熒光定量RT-PCR對(duì)139份廣西邊境地區(qū)蚊樣品進(jìn)行新型AKAV檢測，結(jié)果表明，在采自防城港市（阿蚊和庫蚊）、東興市（庫蚊）、北海市（阿蚊和庫蚊）、寧明縣（庫蚊）和大新縣（阿蚊）的蚊樣品中檢出新型AKAV S基因和M基因的熒光信號(hào)均超過閾值且≤35，同時(shí)擴(kuò)增曲線（圖4）呈平滑的S形，故判定這些蚊樣品中含有新型AKAV。同時(shí)使用RT-PCR進(jìn)行檢測，結(jié)果也均呈陰性。

2.4 新型AKAV S基因變異分析結(jié)果

以來自防城港市、東興市、北海市、寧明縣及大新縣的新型AKAV陽性樣品為模板，采用RT-PCR擴(kuò)增新型AKAV的S基因，分別命名為GX2019-FC、GX2019-Dox、GX2019-BH、GX2019-NM和GX2019-DX，并與近年來周邊省份的AKAV毒株及國內(nèi)外的AKAV代表毒株進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這5株毒株均屬于基因Ia型（圖5），且與廣西竹鼠源新型AKAV的相似性高達(dá)95.6%～100.0%，均為新型AKAV；與近年來云南、湖南、廣東從迷糊蚊子、中華按蚊、三帶喙庫蚊和蠓蟲分離毒株的相似性為87.4%～98.5%，尤其與廣東和湖南的AKAV分離毒株相似性較高。

3 討論

蚊子是蚊媒病毒的重要傳播媒介，目前已知蚊子可傳播包括乙型腦炎、登革熱和寨卡等在內(nèi)的300余種人獸共患傳染病。其中，AKAV于1961年在日本首次被發(fā)現(xiàn)，之后相繼在澳大利亞、韓國、美國、東南亞及非洲部分國家出現(xiàn)，1972—1975年曾在日本暴發(fā)而造成約42000頭小牛出生缺陷（任鵬飛，2019）。AKAV于1994年首次在我國被報(bào)道，1996年在上海暴發(fā)導(dǎo)致大量胎牛死亡；目前已證實(shí)我國有24個(gè)?。ㄊ小^(qū)）暴發(fā)流行，其中廣西的牛羊抗體陽性率高達(dá)54.11%（林俊等，2014）。廣西擁有約800 km的邊境線，邊境地區(qū)主要位于北回歸線以南，氣候溫暖、降雨豐沛，非常適合蚊蟲孳生。隨著“一帶一路”倡議的提出，我國與東盟國家的貿(mào)易、人口流動(dòng)越來越頻繁，廣西也成為多種新發(fā)和再發(fā)傳染病的高危地區(qū)，不僅威脅著居民的公共衛(wèi)生安全，還給動(dòng)物疫病防控帶來一定壓力。

本課題組于2016年首次在廣西竹鼠中分離獲得新型AKAV，隨后周邊省份云南、四川、湖南、廣東及海南也相繼在蚊蠓中檢出與新型AKAV高度同源的AKAV，但尚未證實(shí)廣西蚊子攜帶有新型AKAV（Tang et al.，2017；宋頌，2018；范娜，2019；吳德等，2019；Cao et al.，2019）。唐海波等（2018）針對(duì)新型AKAV的M基因建立了RT-PCR檢測方法，其最低檢測限為1.0×10copies/μL。在此基礎(chǔ)上，本研究針對(duì)新型AKAV的S基因和M基因建立SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測方法，最低檢測限分別為1.0×10copies/μL和1.0×10copies/μL，更適用于檢測病毒拷貝數(shù)低的樣品，同時(shí)具有較好的特異性和重復(fù)性。采用建立的SYBR Green I熒光定量RT-PCR成功從廣西邊境地區(qū)防城港市、東興市、寧明縣、大新縣及北海市的阿蚊和庫蚊中檢出新型AKAV。與周邊省份不同，本研究在阿蚊中檢出新型AKAV，但未在按蚊中檢出，證實(shí)阿蚊也是新型AKAV的傳播媒介。

此外，與云南分離株DHL10M110（GenBank登錄號(hào)KY284023）相比，新型AKAV毒株GXLCH16-70在NSs蛋白氨基酸序列中存在2處氨基酸位點(diǎn)差異，即S22N和F70S。為此，設(shè)計(jì)S基因擴(kuò)增引物（AKAVSF/AKAVSR），使擴(kuò)增片段涵蓋這2處氨基酸差異位點(diǎn)而用于毒株鑒別。除了可用于SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測外，AKAVSF/AKAVSR還能用于S基因片段克隆。本研究結(jié)果表明，從廣西邊境地區(qū)蚊樣品中檢出的AKAV毒株為新型AKAV，S基因變異分析結(jié)果顯示這些毒株均屬于基因Ia型，與廣東和湖南蠓蟲、中華按蚊、致倦庫蚊分離毒株具有較高的相似性，推測新型AKAV已在廣西周邊省份流行，但是否能感染牛羊尚有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

針對(duì)新型AKAV S基因和M基因建立的SYBR Green I熒光定量RT-PCR具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，更適用于檢測病毒拷貝數(shù)低的樣品。此外，從廣西邊境地區(qū)蚊樣品中檢出的AKAV毒株均為新型AKAV，屬于基因Ia型，與廣東和湖南蠓蟲、中華按蚊、致倦庫蚊分離毒株具有較高的相似性，推測新型AKAV已在廣西周邊省份流行。