脫落酸處理對油菜幼苗鎘積累和毒害作用的影響

余燕，張藝舜，李瑞，賀原，趙雪，汪華志，張付貴，朱宗河，周可金

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，安徽合肥，230036）

鎘（cadmium，Cd）是生物毒性最強的重金屬元素之一，具有致病、致癌和致突變的作用。隨著工業(yè)、城市和農(nóng)村的快速發(fā)展，我國農(nóng)田土壤Cd 污染形勢日益嚴峻。據(jù)統(tǒng)計，我國Cd污染土壤面積已達20 萬公頃，約占耕地面積的20%[1,2]。《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示，我國耕地Cd 污染點位超標率最高（7.0%），為首要污染物。除了具有一般重金屬污染的共性外，Cd 還具有移動性強、毒性高和降解難等特點[3,4]。土壤Cd 污染不僅會引起土壤功能退化和作物生長受阻導(dǎo)致減產(chǎn)，還容易被農(nóng)作物吸收，在食物鏈富集，危害動物和人體健康[3,5,6]。油菜（Brassica napusL.）是我國廣泛種植的油料作物，是植物油脂和蛋白的重要來源。此外，油菜還具有蔬用、飼用、肥用、蜜用和花用等多種功能，其多功能開發(fā)利用近年來得到了大量的探索，并集成了一批高效的開發(fā)模式[7,8]。但是油菜具有較強的Cd 吸收積累能力，而油蔬兩用的油菜常種植在城鄉(xiāng)結(jié)合部中輕度污染農(nóng)田土壤中，其生產(chǎn)面臨著較大的Cd污染風(fēng)險[9]。因此，亟需開展緩解油菜Cd 毒害及減少可食部位Cd積累的調(diào)控方法及其機理研究。

應(yīng)用化學(xué)調(diào)控物質(zhì)是緩解作物Cd 毒害以及植株Cd 積累的一種經(jīng)濟有效的栽培管理措施[10～13]。脫落酸（abscisic acid，ABA）是植物體內(nèi)一種重要的激素物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)其不僅對植物的生長發(fā)育過程有調(diào)節(jié)作用，也參與了植物對逆境脅迫，包括Cd 脅迫的響應(yīng)過程[12]。例如，在水稻葉片[14]、西紅柿塊莖[15]、柑橘[16]和香蒲[17]等植物中研究發(fā)現(xiàn)，Cd 處理能夠增加植物內(nèi)源ABA 的含量。在水稻中進一步的研究發(fā)現(xiàn)，Cd 調(diào)節(jié)的ABA 含量變化與稻秧的耐Cd性呈正相關(guān)關(guān)系[14]。外源應(yīng)用ABA 可顯著緩解Cd對擬南芥[10]、綠豆[18]、水稻[19]、小麥[20]等的毒害，促進植株的生長，提高生物量，降低植株新葉的萎黃程度。然而，ABA 處理對于Cd 脅迫下油菜耐Cd 性的影響及其調(diào)控機理尚不清楚。

因此，本研究以南方主栽的甘藍型油菜灃油737 為材料，通過水培試驗，探究外源ABA 處理對Cd 脅迫下油菜幼苗的干鮮重、根系形態(tài)等農(nóng)藝性狀，根系活力、丙二醛以及活性氧等損傷生理指標，以及抗氧化酶活性和Cd 含量等的影響，以期闡明ABA處理對油菜Cd毒害作用的影響及其作用機理，為實現(xiàn)增強作物耐Cd 性和可食部位安全性的生產(chǎn)調(diào)控措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

甘藍型油菜品種灃油737，購買于陜西榮華農(nóng)業(yè)科技有限公司。脫落酸（ABA，分析純）購買于阿拉丁試劑公司。選取飽滿均勻的油菜種子用1%的NaClO 消毒、浸種12 h 后移至鋪有六層紗布的發(fā)芽盒中催芽12 h，待種子露白后播于盛有1/4 Hoagland營養(yǎng)液（pH 5.5）的方形塑料盆中。出苗后，選擇大小一致的幼苗移植到盛有1/2 Hoagland 營養(yǎng)液（pH 5.5）的黑色塑料燒杯中繼續(xù)培養(yǎng)一周，之后將營養(yǎng)液更換為完全Hoagland 營養(yǎng)液（pH 5.5）培養(yǎng)一周，然后選取長勢一致的幼苗添加不同的試劑處理一周后取樣待測。營養(yǎng)液每四天更換一次。完全營養(yǎng) 液 主 要 由1 mmol/L CaCl2，3 mmol/L KNO3，1 mmol/L NaH2PO4，0.5 mmol/L MgSO4，50 μmol/L Fe-EDTA， 0.5μmol/L ZnSO4， 0.1μmol/L（NH4）6Mo7O24，0.1 μmol/L CuSO4，0.5 μmol/L MnSO4和10 μmol/L H3BO3。人工氣候箱的環(huán)境相對濕度75%，溫度24℃/18℃（晝/夜），光周期為晝/夜16 h/8 h，光強度14 400 lx。

試驗于氣候箱中采用水培方式進行，采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，每個處理設(shè)置3組生物學(xué)重復(fù)，每組6棵幼苗。鎘（Cd）處理濃度分別為：5、10、20、30、40μmol/L，采用CdCl2配置母液加入營養(yǎng)液中，隨后用HCl 和NaOH 調(diào) 節(jié)pH 至5.5±0.1。ABA 濃 度 分 別為：5、10、15、20、30μmol/L，具體試驗處理設(shè)置見表1。處理1 周后，取樣進行農(nóng)藝性狀的測定，篩選出適宜的Cd 處理濃度和ABA 處理濃度。然后，設(shè)置對照（CK）、鎘處理（20 μmol/L Cd）、ABA+Cd（15μmol/L ABA+20 μmol/L Cd）三 個 處 理 繼 續(xù) 后 續(xù)試驗。

表1 試驗處理Table 1 Abbreviation and name of treatments

1.2 測定指標與方法

1.2.1 農(nóng)藝性狀 處理一周后，將油菜植株按照地上部、根系分開取樣，洗凈擦干后稱取鮮重，隨后放入烘箱中105℃殺青30 min，并在80℃條件下烘干至恒重，稱取干重。同時，采用SPAD 型便攜式葉綠素測定儀（SPAD-502 Plus）進行測定SPAD 值。根系生長及形態(tài)采用根系掃描儀進行掃描，并用Win-RHIZO根系分析系統(tǒng)進行分析。

1.2.2 損傷生理指標 處理一周后，取幼苗的根系，參照陳瑛等[21]采用TTC 法測定根系活力。根系膜脂過氧化程度參照Yu 等[22]采用硫代巴比妥酸反應(yīng)法測定MDA含量。

1.2.3 活性氧含量 取處理一周后的油菜幼苗根系洗凈測定過氧化氫（H2O2）和超氧陰離子（O2·-）含量，分別參照Yu等[22]通過硫酸鈦反應(yīng)法和羥胺氧化法進行。

1.2.4 抗氧化酶活性 根系抗氧化酶活性的測定參照Yu等[23]的方法進行。幼苗處理一周后，取根系洗凈擦干稱鮮重，液氮研磨后加入50 mmol/L pH 7.0 的PBS 提取液（內(nèi)含1 mmol/L EDTA 和1%的PVP），于12 000g 4℃下離心20 min 后保留上清液用于SOD、CAT 和POD 的測定。其中，超氧化物歧化酶（SOD，EC 1.15.1.1）的測定采用氮藍四唑（nitro blue tetrazolium）光化還原法進行，以NBT 抑制50%光化還原為一個活性單位（U）計算SOD 酶活。過氧化氫酶（CAT，EC 1.11.1.6）活性通過測定反應(yīng)液中H2O2的降解速率獲得，ε=39.4 (mol/L)-1cm-1。過氧化物酶（POD，EC 1.11.1.7）活性通過愈創(chuàng)木酚法進行測定，ε=26.6(mol/L)-1cm-1。

1.2.5 鎘含量 植株不同部位的Cd 含量參照Yu等[22]采用硝酸法硝化，通過電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）測定。同時計算Cd 轉(zhuǎn)運系數(shù)，公式如下：Cd轉(zhuǎn)運系數(shù)=Cd葉片/Cd根系。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DPS 18.10 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行方差分析（ANOVA），處理間采用最小顯著差異法（LSD 法）比較差異顯著性（P＜0.05），采用Origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的Cd處理對油菜幼苗生長的影響

由表2 可見，Cd 處理會抑制油菜幼苗的生長，且抑制程度隨Cd 處理濃度的增加而加重。除低濃度（5μmol/L）下油菜幼苗根系的鮮重、干重與CK 相比差異不顯著外，油菜幼苗的地上部鮮重、干重以及根系活力均隨Cd處理濃度的增加而顯著下降（表2）。SPAD值則呈現(xiàn)隨Cd濃度的增加先降低后增加的趨勢，在20μmol/L Cd處理時下降最為厲害，僅為對照的55.04%，因此我們后續(xù)試驗選擇這一濃度進行處理。此時，油菜的地上部鮮重、根系鮮重、地上部干重、根系干重以及根系活力分別較對照下降了50.98%、38.88%、44.35%、20.64%、44.96% 和68.51%。

表2 不同濃度鎘處理對油菜幼苗生長的影響Table 2 Effects of different concentrations of Cd treatments on growth of rapeseed seedlings

2.2 不同濃度ABA 處理對Cd 脅迫下油菜幼苗生長的影響

由表3可見，5～20μmol/L ABA 處理不同程度地緩解了Cd對油菜幼苗生長的抑制，且緩解作用隨著濃度的增加呈現(xiàn)先增強后減弱的趨勢，在高濃度（30 μmol/L）時出現(xiàn)了加劇毒害的效果。當(dāng)ABA 的濃度為15μmol/L 時，緩解作用最佳，油菜幼苗的地上部鮮重、根系鮮重、地上部干重、根系干重、SPAD值以及根系活力分別較單獨Cd 處理增加了36.41%、99.22%、44.01%、44.17%、27.60% 和92.26%（表3）。因此選擇15μmol/L 作為后續(xù)ABA的處理濃度。

表3 不同濃度的ABA預(yù)處理后對鎘脅迫下油菜幼苗生長的影響Table 3 Effects of different concentrations of ABA treatments on rapeseed growth

2.3 外源ABA對Cd脅迫下油菜根系形態(tài)的影響

由表4 可見，Cd 處理顯著抑制了油菜根系的生長發(fā)育，總根長、總根表面積、總根投影面積、總根尖數(shù)、分枝數(shù)和交叉數(shù)均顯著下降，與CK 相比分別降低57.78%、45.87%、50.51%、59.23%、29.58%和72.22%。相反，根平均直徑較對照顯著增加了17.65%。從根系形態(tài)的掃描圖片也可直觀看出20μmol/L Cd 處理后油菜幼苗根系生長嚴重受抑，與CK 相比，根系明顯瘦小（圖1）。表明，Cd 毒害會抑制根系伸長和側(cè)根發(fā)育，同時導(dǎo)致根系膨大變粗。外源添加ABA處理后，Cd引起的根系伸長和側(cè)根發(fā)育受抑程度顯著減輕，總根長、總根尖數(shù)、分枝數(shù)和交叉數(shù)顯著增加，與Cd 處理相比分別增加了73.22%、157.63%、74%和106.32%（表4，圖1），表明ABA可以緩解Cd對油菜根系形態(tài)的損害。

表4 ABA預(yù)處理對鎘脅迫下油菜根系生長的影響Table 4 Effects of ABA pretreatment on root morphology of rapeseed under cadmium stress

圖1 不同處理條件下油菜根系生長情況表型Fig.1 Root phenotype of rapeseed under different treatments

2.4 外源ABA處理對油菜體內(nèi)Cd含量的影響

由圖2 可見，ABA+Cd 處理可顯著降低Cd 在油菜地上部和根系中的積累。與單獨Cd處理相比，添加ABA 后油菜地上部和根系中的Cd 含量分別下降了31.17%（圖2A）和34.89%（圖2B）。Cd 轉(zhuǎn)運系數(shù)在處理間差異不顯著（圖2C）。

圖2 ABA預(yù)處理對Cd脅迫下油菜體內(nèi)Cd含量的影響Fig.2 Effects of ABA on Cd concentrations in rapeseed seedlings under Cd stress

2.5 外源ABA 處理對Cd 脅迫引起的油菜氧化損傷的影響

從圖3A 可見，Cd 處理后油菜根系MDA 與對照相比顯著增加，ABA+Cd 處理可顯著降低MDA的積累，與Cd 處理相比下降了20.87%。H2O2和等活性氧的過量產(chǎn)生是Cd 脅迫導(dǎo)致氧化損傷的重要原因。Cd 處理下H2O2含量與CK 相比無顯著變化（圖3B），而O2·-含量顯著增加，約是對照的131.37%，ABA 處理顯著抑制了油菜根系中O2·-的過量積累，比單獨Cd 處理下降了38.89%（圖3C）。

圖3 ABA處理對Cd脅迫下油菜根系活性氧含量的影響Fig.3 Effects of ABA on ROS contents in Cd-stresses rapeseed seedlings

2.6 外源ABA 處理對Cd 脅迫下油菜抗氧化酶活性的影響

由圖4 可見，Cd 處理下，SOD 活性顯著下降，CAT 活性顯著增加，POD 活性無顯著變化。外源添加ABA 后，SOD、CAT 和POD 活性分別比Cd 處理下分別增加了158.05%，28.59%和34.62%（圖4），表明，Cd 處理干擾了抗氧化酶體系的運行，而ABA 可通過增強抗氧化酶的活性抑制活性氧的過量積累。

圖4 ABA預(yù)處理對Cd脅迫下油菜根系抗氧化酶活性的影響Fig.4 Effects of ABA on the activities of antioxidant enzymes in rapeseed seedlings under Cd stress

3 討論與分析

鎘（Cd）脅迫會影響作物的生長和發(fā)育，導(dǎo)致作物的產(chǎn)量和品質(zhì)下降，進而影響糧食和食品安全[3,19,24]。大量的研究表明，植物遭受Cd 毒害時首先表現(xiàn)為生長受抑和葉片萎黃，因而生物量和葉綠素含量常被用作評價植物遭受Cd 脅迫程度的重要指標[24～26]。本試驗結(jié)果表明，油菜在低濃度（5 μmol/L）Cd 處理下生長影響不大，隨著Cd 濃度的增加，便會顯著抑制油菜幼苗的生長，主要表現(xiàn)為油菜幼苗的地上部和根系干鮮重、SPAD 值、根系活力等顯著下降。這一結(jié)果與張大為等[27]的研究結(jié)果相似。脫落酸（ABA）是一種植物脅迫激素，也參與了植物對Cd脅迫的耐性響應(yīng)[10,12,28～30]。例如，Cd脅迫處理能顯著提高西紅柿[14]、水稻[15]、柑橘[16]等植物內(nèi)源ABA 的含量。同時，外源ABA 應(yīng)用顯著緩解了水稻[19]、小麥[20]、綠豆[18]、擬南芥[10]等植物的Cd 毒害癥狀，但是ABA 最佳的處理濃度因植物種類、栽培方式以及處理時間而異。本研究結(jié)果顯示，5～20 μmol/L ABA處理不同程度緩解了Cd 對油菜幼苗生長的毒害作用，改善了葉片黃化和根系形態(tài)受抑程度，且濃度為15μmol/L時，油菜幼苗的地上部鮮重、根系鮮重、地上部干重、根系干重、SPAD 值以及根系活力等各項指標較單獨Cd處理差異最為顯著。因此，我們選擇15 μmol/L 的ABA 處理進行后續(xù)試驗，并且發(fā)現(xiàn)其作用可能是通過降低Cd 吸收積累和增強抗氧化酶活性，進而緩解Cd積累引起的氧化脅迫。

根系是植物最先與污染土壤接觸的器官，也是植物遭受Cd 毒害的首要部位[3,31]。研究顯示，植物根系可通過調(diào)整自身的形態(tài)來應(yīng)對Cd毒脅迫，主要表現(xiàn)為主根伸長受抑，側(cè)根和根毛發(fā)育不良等[32,33]。本試驗結(jié)果顯示，Cd處理后油菜幼苗的根系明顯受損，總根長、總根表面積、根尖數(shù)、分枝數(shù)以及交叉數(shù)均顯著下降，而根平均直徑顯著增加（表4 和圖1）。根系生長和形態(tài)的損傷會阻礙其對水分和養(yǎng)分的吸收，進而導(dǎo)致地上部的生長受抑[32]。外源ABA 處理后，顯著緩解了Cd 對油菜幼苗根系的損傷，總根長、根尖數(shù)、分枝數(shù)和交叉數(shù)顯著增加（表4和圖1），根系活力顯著增加（表3）。在綠豆中的研究也發(fā)現(xiàn)，ABA處理可顯著緩解Cd對根系生長的抑制作用，增加根系生物量和不定根的數(shù)量[18]。表明，ABA 處理有利于維持Cd 脅迫下油菜幼苗根系的生長和形態(tài)，進而改善地上部的生長，增強其對Cd 的耐性。

植物遭受Cd 脅迫程度常與植物體內(nèi)Cd 積累量密切相關(guān)，在生產(chǎn)上采取措施降低Cd在植物體內(nèi)的積累或轉(zhuǎn)運則可以緩解Cd 對植物的毒害[33～36]。研究顯示，ABA對植物體內(nèi)Cd的吸收和轉(zhuǎn)運具有調(diào)控作用[10,12]。例如，F(xiàn)an 等[10]在擬南芥中的研究發(fā)現(xiàn)低濃度的ABA 應(yīng)用可通過抑制二價鐵轉(zhuǎn)運體IRT1表達，減少根系對Cd 的吸收。在水稻中研究顯示，外源ABA 處理可顯著降低Cd 在水稻植株中的積累，這可能是通過降低蒸騰速率進而減弱Cd 轉(zhuǎn)運實現(xiàn)的[19]。我們的研究結(jié)果顯示，外源ABA 處理顯著降低了Cd在油菜幼苗地上部和根系中的積累，但對于Cd 轉(zhuǎn)運系數(shù)并沒有顯著影響（圖2），表明ABA 很有可能是通過直接抑制油菜Cd 吸收降低其在植株體內(nèi)的積累。但是，在油菜中ABA 具體是通過何種途徑降低Cd吸收的尚不清楚，值得進一步探究。

鎘在植物體內(nèi)積累會引發(fā)一系列生理生化過程紊亂，其中活性氧（包括H2O2、O2·-和OH-等）的過量積累被認為是Cd 毒害的重要原因[11,37～38]。研究顯示，ROS 過量積累會引起氧化脅迫，導(dǎo)致膜脂過氧化，細胞膜完整性破壞等，從而干擾細胞功能的正常行使[39]。本試驗結(jié)果顯示，Cd 處理后油菜幼苗根系MDA 含量較對照顯著增加，而ABA 處理后則可顯著降低由Cd 引起的MDA 含量增加（圖3A），表明ABA 可以緩解油菜幼苗根系中由于Cd 引起的膜脂過氧化損傷。進一步測定ROS的含量顯示，Cd處理下氧化損傷的產(chǎn)生主要是由于O2·-的大量產(chǎn)生引起，外源ABA 處理顯著抑制了O2·-含量的增加（圖4）。由此表明，外源ABA 處理緩解油菜幼苗Cd 毒害是由于其維持ROS穩(wěn)態(tài)進而減輕氧化脅迫程度。

研究顯示，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶直接參與了逆境條件下植物體內(nèi)ROS 的產(chǎn)生和清除過程，在植物抵御逆境脅迫中具有重要的作用[38～40]。其中，SOD主要催化氧化活性較強的O2·-歧化成無毒的O2釋放掉和毒性相對較弱的H2O2，而H2O2則進一步可在CAT 和POD 的作用下，分解為無毒的H2O 和O2，從而避免ROS 過量積累[22,39]。我們的試驗結(jié)果顯示，Cd 處理顯著抑制了油菜根系SOD 酶的活性（圖4A），這可能是O2·-過量積累的重要原因。而Cd 脅迫條件下H2O2沒有顯著積累的原因則可能是因為CAT 活性的增加（圖4B）。外源ABA 處理顯著提高了SOD 的活性，促進了O2·-歧化分解，與此同時，同步增加了CAT 和POD 活性，增強H2O2清除能力，避免了H2O2過量積累（圖3 和4）。由此表明，外源ABA 應(yīng)用可通過增強抗氧化酶系統(tǒng)中SOD、CAT 和POD 的活性提高油菜體內(nèi)ROS 清除能力，緩解由ROS過量積累導(dǎo)致的氧化脅迫。

4 結(jié)論

綜上所述，外源ABA 處理可顯著緩解Cd 對油菜幼苗生長和根系形態(tài)的毒害作用，其主要機制是通過抑制Cd吸收和增強抗氧化酶活性，進而減少由Cd 積累引發(fā)的ROS 過量積累，減輕Cd 引起的氧化損傷和對植株的毒害作用。但是關(guān)于ABA 是如何影響Cd吸收的尚不清楚。此外，ABA是否與其他參與植物Cd 脅迫響應(yīng)的植物激素或信號分子協(xié)同作用調(diào)控植物Cd 脅迫耐性？這些問題都有待進一步探討，從而為用于Cd污染土壤安全利用的作物品種培育和栽培調(diào)控技術(shù)研發(fā)提供理論依據(jù)。