長(zhǎng)鏈非編碼RNA HAGLROS在胃癌中的生物信息學(xué)分析

吳 鵬, 馮 鋒, 胡道卿, 江家星, 王志寧

(南京明基醫(yī)院/南京醫(yī)科大學(xué)附屬明基醫(yī)院 腫瘤科, 江蘇 南京, 210019)

2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，胃癌的發(fā)病率和病死率在全球范圍內(nèi)分別排第5位和第4位[1]。中國(guó)是胃癌高發(fā)國(guó)家，2020年胃癌的發(fā)病率和病死率均居惡性腫瘤的第3位[2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類(lèi)大小在200核苷酸以上、缺少開(kāi)放閱讀框、無(wú)蛋白質(zhì)編碼功能的RNA。研究[3]發(fā)現(xiàn), LncRNA在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，可參與腫瘤的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、代謝、免疫、耐藥等過(guò)程。一些LncRNA被證實(shí)在胃癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程中起著重要的作用，可作為胃癌診斷和預(yù)后的潛在標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)LncRNA HAGLROS在胃癌中高表達(dá)，能通過(guò)激活mTOR通路和抑制自噬促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。研究[5]發(fā)現(xiàn), HAGLROS不僅能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地吸附微小RNA-100-5p(miR-100-5p)使mTOR表達(dá)上調(diào)，而且能通過(guò)綁定mTORC1復(fù)合物激活mTORC1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制自噬，從而維持胃癌細(xì)胞的惡性表型。

近年來(lái)研究[6]證實(shí)HAGLROS可參與胃癌、肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等多種腫瘤的惡性發(fā)展過(guò)程。WEI H M等[7]發(fā)現(xiàn), HAGLROS能通過(guò)調(diào)控miR-5095/ATG12軸和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，抑制凋亡及增強(qiáng)自噬。因此, HAGLROS在腫瘤的診斷、治療中有廣闊的應(yīng)用前景，但目前的研究仍不夠深入，文獻(xiàn)檢索HAGLROS在腫瘤中的研究目前僅有24篇，在胃癌中的研究極少，有待進(jìn)一步的挖掘和探索。本研究采用生物信息學(xué)的方法結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫(kù)研究HAGLROS在胃癌中的潛在功能和機(jī)制，為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床研究提供一定的理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 應(yīng)用公共數(shù)據(jù)庫(kù)分析HAGLROS在胃腺癌中的表達(dá)

應(yīng)用UCSC Xena數(shù)據(jù)庫(kù)(https://xenabrowser.net/)分析LncRNA HAGLROS在胃癌和正常胃黏膜組織中的表達(dá)水平。采用四分位數(shù)法將HAGLROS分為高表達(dá)組(>75%)和低表達(dá)組(<25%), 采用Log-rank檢驗(yàn)和Kaplan-Meier檢驗(yàn)對(duì)HAGLROS進(jìn)行生存分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 應(yīng)用腫瘤與癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)分析HAGLROS的共表達(dá)基因

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載胃癌基因表達(dá)譜。采用R語(yǔ)言分析HAGLROS的共表達(dá)基因(選取的是蛋白質(zhì)編碼基因)，篩選標(biāo)準(zhǔn)為Pearson相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值>0.3且P<0.01。采用R軟件的clusterProfiler包對(duì)共表達(dá)基因進(jìn)行京都基因和基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析并繪圖,P<0.05表示富集結(jié)果顯著。應(yīng)用Metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)和WebGestalt(http://www.webgestalt.org/)在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)共表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析。

1.3 HAGLROS共表達(dá)基因的網(wǎng)絡(luò)互作分析及關(guān)鍵基因的篩選

應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cn.string-db.org/)進(jìn)行HAGLROS共表達(dá)基因的蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析，再導(dǎo)入Cytoscape軟件中進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)可視化處理，然后使用cytoHubba插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的基因進(jìn)行節(jié)點(diǎn)得分計(jì)算，并依據(jù)排名篩選關(guān)鍵基因。運(yùn)用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu/)分析目的基因在胃腺癌及正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況以篩選差異表達(dá)(P<0.01)的基因。

1.4 預(yù)測(cè)與HAGLROS相互作用的微小核糖核酸(miRNA)

應(yīng)用miRDB(http://mirdb.org/)、LncBase(http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.phpr=lncbasev2%2Findex)、RNAhybrid(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)這3個(gè)在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)可能與HAGLROS結(jié)合的miRNA, 并取交集。利用UALCAN在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)分析各miRNA在胃腺癌中的表達(dá)水平。

1.5 預(yù)測(cè)miRNA的下游靶基因

運(yùn)用R軟件在miRDB、miRTarBase、TargetScan這3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)預(yù)測(cè)及篩選得到的miRNA進(jìn)行下游靶基因的預(yù)測(cè)，并取交集，選擇3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)均能預(yù)測(cè)得到的靶基因進(jìn)行下一步的研究。采用Cytoscape軟件對(duì)內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA(ceRNA)關(guān)系進(jìn)行繪圖。

1.6 miRNA下游靶基因的功能富集分析

采用Metascap(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miRNA的下游靶基因進(jìn)行功能富集分析。

1.7 對(duì)miRNA下游靶基因和共表達(dá)基因取交集

將1.5步驟中預(yù)測(cè)得到的miRNA下游靶基因與1.2步驟中得到的HAGLROS共表達(dá)基因取交集，并建立LncRNA-miRNA-mRNA軸。

2 結(jié) 果

2.1 HAGLROS 在胃腺癌中的表達(dá)水平及生存分析

通過(guò)UCSC Xena數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn), HAGLROS在胃腺癌中的表達(dá)水平高于正常胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。對(duì)HAGLROS進(jìn)行的生存預(yù)后分析結(jié)果顯示，隨著HAGLROS表達(dá)量的升高，胃癌患者的總生存期(OS)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見(jiàn)圖1。

2.2 HAGLROS的共表達(dá)基因及其GO分析和KEGG通路分析

采用R語(yǔ)言分析HAGLROS的共表達(dá)基因(選取的是蛋白質(zhì)編碼基因)，共獲得301個(gè)。采用R語(yǔ)言對(duì)這301個(gè)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，其主要與乳腺癌、黑色素瘤、Rap1信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、干細(xì)胞多能性調(diào)控信號(hào)通路、鞘脂類(lèi)信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、胃癌、MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等相關(guān)，見(jiàn)圖2。采用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步行共表達(dá)基因的功能富集分析，發(fā)現(xiàn)其主要參與胚胎和器官的生長(zhǎng)發(fā)育、神經(jīng)和突觸生長(zhǎng)、細(xì)胞組分形態(tài)發(fā)生等生物學(xué)過(guò)程以及Wnt信號(hào)通路、神經(jīng)系統(tǒng)等相關(guān)通路，見(jiàn)圖3。為進(jìn)一步分析HAGLROS共表達(dá)基因的生物學(xué)過(guò)程，采用WebGestalt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)其主要與神經(jīng)前體細(xì)胞增殖、感覺(jué)器官形態(tài)發(fā)生、突觸囊泡循環(huán)及介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元分化、Notch信號(hào)通路、胚胎器官發(fā)育、跨膜受體蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、突觸前等有關(guān)，與Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果基本一致，見(jiàn)圖4。

圖2 HAGLROS共表達(dá)基因的KEGG富集分析

圖3 HAGLROS共表達(dá)基因的功能富集分析(Metascape)

圖4 HAGLROS共表達(dá)基因的GO分析(WebGestalt)

2.3 HAGLROS共表達(dá)基因的網(wǎng)絡(luò)互作分析及其關(guān)鍵基因的篩選

采用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建HAGLROS共表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，將置信度設(shè)置為大于0.4, 得出由300個(gè)蛋白節(jié)點(diǎn)和294對(duì)互作關(guān)系組成的網(wǎng)絡(luò)。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，利用cytoHubba插件進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，共有12種方法，其中Degree和MCC是最常用的方法，將2種方法排名前30位的基因取交集，得出23個(gè)基因，輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，見(jiàn)圖5。通過(guò)蛋白注釋發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)基因與胚胎生長(zhǎng)發(fā)育及神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)，其中FGF8、FGF3、FGF17、FGF19、SALL4、GBX2、TBX2、SNAI1可參與胚胎生長(zhǎng)發(fā)育;NES、FGF8、FGF3、FGF17、FGF19、ZIC1、SYN1、SYN2、DLX1、DLX2、DLX5、TUBB3、CAMK2B、PCLO、GBX2、DRD2、SALL4可參與神經(jīng)發(fā)育生長(zhǎng)、軸突突觸形成或神經(jīng)遞質(zhì)的釋放與傳遞。

圖5 23個(gè)關(guān)鍵基因的網(wǎng)絡(luò)圖

為進(jìn)一步縮小關(guān)鍵基因范圍，本研究將Degree和MCC排名前10位的基因取交集，得到FGF8、NES、FGF3、SYN1、SYN2、DLX1、DLX2、DLX5。在UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中分析這8個(gè)基因在胃腺癌中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)NES、FGF8、FGF3在胃腺癌中表達(dá)高于正常胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見(jiàn)圖6, 而且他們?cè)赾ytoHubba插件的12種算法中的得分排名基本也是最靠前的。共表達(dá)分析結(jié)果顯示,NES、FGF8、FGF3在胃癌中與HAGLROS的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.37、0.447、0.354, 見(jiàn)圖7。由此可見(jiàn),NES、FGF8、FGF3可能與HAGLROS的關(guān)系最為密切，并以一定的方式與 HAGLROS聯(lián)系并通過(guò)調(diào)控相關(guān)通路促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

A: NES基因的表達(dá)情況; B: "FGF8基因的表達(dá)情況; C: FGF3基因的表達(dá)情況。圖6 關(guān)鍵基因在胃癌及正常組織中的表達(dá)

A: NES基因與HAGLROS的共表達(dá)情況(相關(guān)系數(shù)=0.37, P=1.222e-14); B: FGF8基因與HAGLROS的共表達(dá)情況(相關(guān)系數(shù)=0.447, P=2.078e-21); C: FGF3基因與HAGLROS的共表達(dá)情況(相關(guān)系數(shù)=0.354, P=1.959e-13)。圖7 關(guān)鍵基因與HAGLROS的共表達(dá)關(guān)系

2.4 分析HAGLROS結(jié)合的miRNA并預(yù)測(cè)miRNA下游靶基因

應(yīng)用miRDB、LncBase、RNAhybrid這3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)能與HAGLROS結(jié)合的miRNA，并取交集，得出3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)均能預(yù)測(cè)出的miRNA共16個(gè): hsa-miR-1297、hsa-miR-4750-3p、hsa-miR-6749-3p、hsa-miR-548f-5p、hsa-miR-1976、hsa-miR-548g-5p、hsa-miR-548aj-5p、hsa-miR-548x-5p、hsa-miR-6727-3p、hsa-miR-5197-5p、hsa-miR-5691、hsa-miR-4257、hsa-miR-6776-5p、hsa-miR-6805-3p、hsa-miR-6892-3p、hsa-miR-548aw。通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析上述16個(gè)miRNA在胃腺癌中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其中4個(gè)miRNA在胃腺癌中表達(dá)，即hsa-miR-1976、hsa-miR-6805、hsa-miR-6892、hsa-miR-548aw。應(yīng)用miRDB、miRTarBase、TargetScan這3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)這4個(gè)miRNA的靶基因，并取交集，發(fā)現(xiàn)共有124個(gè)靶基因可以通過(guò)這3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)同時(shí)預(yù)測(cè)得出，其中hsa-miR-1976的靶基因有27個(gè), hsa-miR-6892-3p有11個(gè), hsa-miR-548aw有86個(gè)。hsa-miR-6805-3p的靶基因在這3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中未取得交集。采用Cytoscape軟件繪制ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖8。

圖8 ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.5 miRNA下游靶基因的功能富集分析

利用Metascape在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述得到的miRNA的124個(gè)靶基因進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)主要與Kaiso-NCOR蛋白復(fù)合物、神經(jīng)前體細(xì)胞增殖、脂質(zhì)生物合成過(guò)程的正向調(diào)控、肌動(dòng)蛋白纖維組織、蛋白質(zhì)分解代謝過(guò)程、管形態(tài)發(fā)生、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育調(diào)節(jié)、磷脂生物合成過(guò)程、細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程及SMAD2/3和SMAD4轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)、Wnt信號(hào)通路與多能性、mTOR信號(hào)通路、Fcγ受體介導(dǎo)的吞噬作用、冠狀病毒感染中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、T17細(xì)胞分化、甲狀腺激素信號(hào)通路等信號(hào)通路有關(guān)。見(jiàn)圖9。

圖9 miRNA下游靶基因的功能富集分析(Metascape)

2.6 miRNA下游靶基因與HAGLROS共表達(dá)基因取交集

采用R軟件將124個(gè)靶基因與HAGLROS的301個(gè)共表達(dá)基因取交集，繪制韋恩圖，得出1個(gè)基因ORAI2,ORAI2是上述預(yù)測(cè)得到的3個(gè)miRNA中miR-1976的靶基因，見(jiàn)圖10。運(yùn)用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)ORAI2進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ORAI2在胃腺癌中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01); 在共表達(dá)關(guān)系中, HAGLROS與ORAI2的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.321, 見(jiàn)圖11。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)ORAI2基因編碼的蛋白質(zhì)是細(xì)胞膜上鈣通道ORAI蛋白的一個(gè)亞基，在鈣離子內(nèi)流過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，而鈣離子通道的功能異常與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成、免疫抑制、耐藥等過(guò)程密切相關(guān)[8]。由此推斷, HAGLROS-miR-1976-ORAI2軸可能參與調(diào)控胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步論證。

圖10 miRNA下游靶基因與HAGLROS共表達(dá)基因取交集

A: ORAI2在胃癌中高表達(dá); B: ORAI2與HAGLROS的共表達(dá)關(guān)系。圖11 ORAI2在胃癌中高表達(dá)及與HAGLROS的共表達(dá)關(guān)系

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)HAGLROS在胃腺癌中的表達(dá)較正常胃黏膜組織顯著升高，生存分析顯示HAGLROS低表達(dá)患者的OS較高表達(dá)患者顯著延長(zhǎng)。在下載胃腺癌的TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)后，利用R語(yǔ)言分析得出HAGLROS的共表達(dá)基因共301個(gè); KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，共表達(dá)基因主要涉及Rap1、Wnt、干細(xì)胞多能性調(diào)控、MAPK、PI3K-Akt等信號(hào)通路及胃癌、乳腺癌、黑色素瘤等癌癥; 進(jìn)一步采用Metascape、WebGestalt數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，共表達(dá)基因主要參與胚胎和器官的生長(zhǎng)發(fā)育、神經(jīng)和突觸生長(zhǎng)等生物學(xué)過(guò)程以及Wnt、Notch等相關(guān)通路; 對(duì)共表達(dá)基因進(jìn)行PPI分析及關(guān)鍵基因篩選，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因與胚胎生長(zhǎng)發(fā)育及神經(jīng)生長(zhǎng)密切相關(guān)，并得出與HAGLROS關(guān)系最為密切的3個(gè)基因，即NES、FGF8、FGF3。綜合上述結(jié)果，本研究推斷HAGLROS在胃癌中可能與胚胎和器官的生長(zhǎng)發(fā)育、神經(jīng)和突觸生長(zhǎng)等生物學(xué)過(guò)程以及Wnt、Notch、干細(xì)胞多能性調(diào)控等通路相關(guān)，而NES、FGF8、FGF3可能是HAGLROS調(diào)控胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的最關(guān)鍵的3個(gè)基因，并需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究和實(shí)驗(yàn)論證。

本研究分析得出HAGLROS在胃癌中可能與胚胎和器官的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。早期研究[9]顯示，腫瘤的生物學(xué)行為與早期胚胎發(fā)育存在相似性，包括腫瘤的侵襲性與胚胎植入、兩者的基因和蛋白質(zhì)水平以及免疫逃避途徑等方面。腫瘤細(xì)胞在胚胎微環(huán)境中可失去惡性表型而參與正常組織分化，而胚胎離開(kāi)其發(fā)育的微環(huán)境則可產(chǎn)生惡性腫瘤[10]。鐘艷平等[11]提出了腫瘤發(fā)生的“二元論”，一個(gè)途徑為正常胚胎和個(gè)體發(fā)育過(guò)程中因分化受阻而產(chǎn)生相應(yīng)的分化型腫瘤，另一個(gè)途徑為成熟體細(xì)胞在壓力因素下通過(guò)啟動(dòng)“逆向分化”形成多倍體腫瘤巨細(xì)胞(PGCCs)而獲得多能干性，啟動(dòng)內(nèi)周期和內(nèi)分裂，這一階段類(lèi)似于胚胎發(fā)育最早期的卵裂階段，但因未經(jīng)歷正常有性生殖過(guò)程中種植的程序，最終產(chǎn)生各種高核級(jí)腫瘤。

本研究還得出一個(gè)重要的結(jié)論，即HAGLROS可能與胃癌中神經(jīng)生長(zhǎng)有關(guān)。既往研究[12]認(rèn)為腫瘤中存在周?chē)窠?jīng)浸潤(rùn)，即腫瘤細(xì)胞在現(xiàn)有神經(jīng)周?chē)纳L(zhǎng)和浸潤(rùn)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤中還存在新生的神經(jīng)和軸突[13]。2017年, MAUFFREY P等[14]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腦室下區(qū)的神經(jīng)祖細(xì)胞可透過(guò)血腦屏障遷移至腫瘤和轉(zhuǎn)移灶，分化為腎上腺素能神經(jīng)，而腫瘤干細(xì)胞推動(dòng)了神經(jīng)的再生。2020年, AMIT M等[15]研究發(fā)現(xiàn)，p53敲除或突變的口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞外囊泡內(nèi)miR-34a水平的降低促進(jìn)了腫瘤內(nèi)感覺(jué)神經(jīng)的生成，并誘導(dǎo)這些神經(jīng)分化為腎上腺素能神經(jīng)。腫瘤還可分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、軸突導(dǎo)向分子及細(xì)胞外囊泡而誘導(dǎo)神經(jīng)軸突的發(fā)生。研究[13]表明，腫瘤中新生神經(jīng)可能受交感和副交感神經(jīng)的支配調(diào)節(jié)以促進(jìn)腫瘤內(nèi)新生血管的形成、腫瘤細(xì)胞的化療耐藥及免疫逃逸等，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。研究[15]發(fā)現(xiàn)miRNA可參與腫瘤內(nèi)新生神經(jīng)的生長(zhǎng)，但LncRNA還需要進(jìn)一步的挖掘和研究。本研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路可能是HAGLROS促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展的重要通路。Wnt信號(hào)通路在胚胎器官發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、干細(xì)胞的更新分化等過(guò)程中起關(guān)鍵的作用[16]。另外, Notch、干細(xì)胞多能性調(diào)控信號(hào)通路也在胚胎發(fā)育、干細(xì)胞分化過(guò)程中起著重要的作用。

NES、FGF3、FGF8是本研究分析得出的與HAGLROS關(guān)系最密切的3個(gè)基因。NES又稱(chēng)Nestin, 是一種細(xì)胞骨架相關(guān)的Ⅵ類(lèi)中間絲蛋白，是神經(jīng)干細(xì)胞的特征性標(biāo)志物[17]。NES與腫瘤增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后較差有關(guān)，且特異性地表達(dá)于腫瘤新生血管中[18]。FGF3、FGF8是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)家族的成員, FGFs通過(guò)結(jié)合其受體FGFRs, 激活下游多種信號(hào)通路，在胚胎發(fā)育、血管生成及腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、復(fù)發(fā)、耐藥等過(guò)程中起著重要的作用[19]。研究[20]表明, FGF8、FGF3在前腦神經(jīng)嵴、中腦后腦屏障等表達(dá), FGF8在胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的分化和發(fā)育、神經(jīng)活動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。此外，上述23個(gè)關(guān)鍵基因中, SALL4也是一種腫瘤干細(xì)胞基因，在維持胚胎早期發(fā)育、器官形成、胚胎干細(xì)胞自我更新和多能性方面起著重要的作用[21]。綜合上述分析，本研究推斷HAGLROS在胃癌中可能與胚胎器官生長(zhǎng)發(fā)育、神經(jīng)生長(zhǎng)等生物學(xué)過(guò)程有關(guān)，而這些過(guò)程可能由腫瘤干細(xì)胞基因、神經(jīng)干細(xì)胞基因等介導(dǎo)，進(jìn)而通過(guò)調(diào)控Wnt、Notch、干細(xì)胞多能性調(diào)控等信號(hào)通路，影響胃癌的發(fā)生發(fā)展。

本研究采用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)與HAGLROS相結(jié)合的miRNA及其下游靶基因，并對(duì)靶基因進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)參與的生物學(xué)過(guò)程包括神經(jīng)生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化，相關(guān)通路包括Wnt信號(hào)通路與多能性、mTOR信號(hào)通路，這與HAGLROS共表達(dá)基因的富集分析中神經(jīng)生長(zhǎng)生物學(xué)過(guò)程及Wnt、干細(xì)胞多能性調(diào)控通路有一定的重合。為增加下游靶基因的準(zhǔn)確性，本研究將其與HAGLROS的共表達(dá)基因取交集，得到ORAI2, 構(gòu)成了HAGLROS-miR-1976-ORAI2軸。ORAI2是ORAI家族的一個(gè)亞型, ORAI蛋白位于細(xì)胞膜，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的基質(zhì)反應(yīng)蛋白(STIM)形成鈣釋放激活鈣通道(CRAC), 促進(jìn)鈣池操縱性鈣內(nèi)流(SOCE), 調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣的穩(wěn)態(tài)[22]。研究[23]發(fā)現(xiàn), ORAI的異常表達(dá)可導(dǎo)致鈣內(nèi)流的失調(diào)，參與腫瘤的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程。WU S Y等[24]研究發(fā)現(xiàn), ORAI2在胃癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中高表達(dá)，與腫瘤的低分化、侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較差的預(yù)后有關(guān)，其能通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路和MAPK依賴(lài)的黏著斑解離途徑促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究運(yùn)用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)并篩選HAGLROS在胃癌中的關(guān)鍵靶基因，分析HAGLROS參與胃癌的生物學(xué)過(guò)程及調(diào)控通路，并建立HAGLROS-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，為HAGLROS在胃癌中的進(jìn)一步研究提供新的思路和方向。