石榴ZF-HD 基因家族鑒定與分析

付鴻博，李 杰，楊永超，袁盛勇

（紅河學院 生物科學與農(nóng)學學院，云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點實驗室，云南 蒙自 661199）

植物經(jīng)常遭受干旱、鹽堿、極端溫度、機械損傷、昆蟲和病原菌等各種非生物和生物脅迫，嚴重影響其生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。鋅指同源異形盒ZF-HD 基因在植物生長發(fā)育過程中的重要調(diào)控作用以及對多種生物和非生物脅迫的反應(yīng)，受到人們的廣泛關(guān)注。ZF-HD 基因家族首次在C4 植物洋甘菊中被發(fā)現(xiàn)[3]，許多研究表明，植物ZF-HD基因在葉片、種子和果實等組織的生長發(fā)育及脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。在擬南芥和水稻的研究中發(fā)現(xiàn)，多個AtZF-HD基因參與了花、種子和芽的發(fā)育[4-6]，過表達OsZHD1會影響水稻葉片的發(fā)育[7]。在有關(guān)脅迫響應(yīng)研究中發(fā)現(xiàn)，大麥HvZFHD1的表達受到干旱、鹽和高溫脅迫后上調(diào)[8]。番茄SlZHD13的表達在干旱和鹽脅迫后上調(diào)[9]，同時沉默該基因后番茄植株的耐旱和耐鹽性降低[10-11]。黃瓜ZF-HD基因?qū)Ω珊得{迫有響應(yīng)[12]。

石榴（Punica granatum）是一種集生態(tài)、觀賞和保健價值于一體的優(yōu)良果樹，深受世界各國人民喜愛。石榴為石榴科石榴屬小喬木，在熱帶地區(qū)為常綠果樹樹種，是已知的最早的可食用水果之一[13]。石榴一般被認為起源于伊朗，在地中海及中東地區(qū)已有幾千年的栽培歷史，現(xiàn)廣泛種植在地中海、熱帶和亞熱帶地區(qū)。石榴喜光，耐瘠薄，耐旱，易成活，有一定的耐寒能力，能在干燥地區(qū)生長[13]。石榴樹和石榴花優(yōu)雅美麗，是營造純林和觀賞混林的理想選擇。目前，對石榴的研究重視程度較低，總體水平較為落后，尤其是有關(guān)石榴分子生物學的研究更少，石榴全基因組的公布[14]為石榴分子層面的研究提供了重要的保障。ZF-HD 基因在應(yīng)對脅迫和生長發(fā)育過程中發(fā)揮了重要的作用，但目前有關(guān)石榴ZF-HD 基因家族的研究還未見報道。本研究通過石榴基因組數(shù)據(jù)鑒定ZF-HD基因家族成員，并對其進行生物信息學分析，為進一步研究石榴ZF-HD基因的生物學功能提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 石榴ZF-HD基因家族成員鑒定

石榴基因組數(shù)據(jù)下載于NCBI 數(shù)據(jù)庫，ZF-HD結(jié)構(gòu)域序列（PF04770）下載于Pfam 數(shù)據(jù)庫（https://pfam.xfam.org/），并用來查詢序列以識別蛋白質(zhì)，hmmer 3.0 軟件用于鑒定石榴ZF-HD 基因。對候選ZF-HD 基因的結(jié)構(gòu)域利用NCBI 數(shù)據(jù)庫進行驗證，最終確定石榴ZF-HD基因家族成員。

1.2 石榴ZF-HD基因的生物信息學分析

石榴ZF-HD 基因家族成員的理化性質(zhì)及二級結(jié)構(gòu)利用在線數(shù)據(jù)庫ProtParam、PSORT ⅡPrediction 和SOMPA 進行分析。擬南芥ZF-HD 蛋白序列從擬南芥TAIR 數(shù)據(jù)庫下載，利用PgZF-HD和AtZF-HD 蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。根據(jù)石榴基因組注釋信息，利用TBtools 工具分析基因結(jié)構(gòu)，將所鑒定到的PgZF-HD 家族成員定位到染色體上，利用MCScanX 分析基因復制事件，蛋白質(zhì)保守基序和啟動子元件利用在線數(shù)據(jù)庫MEME 和PlantCARE進行分析，利用TBtools工具實現(xiàn)可視化繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴ZF-HD基因家族成員的理化性質(zhì)分析

對所有鑒定的石榴ZF-HD 基因家族成員進行理化性質(zhì)和二級結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn)（表1），在15 個PgZF-HD 蛋白中，PgZF-HD15 為最小的蛋白質(zhì)，由98個氨基酸組成，分子質(zhì)量為10.81 ku，PgZF-HD10為最大的蛋白質(zhì)，由365個氨基酸組成，分子質(zhì)量為40.82 ku。等電點在6.49（PgZF-HD04）～9.33（PgZFHD10），其中只有PgZF-HD03 和PgZF-HD04 的等電點小于7，為酸性蛋白質(zhì)，其余的家族成員均為堿性蛋白質(zhì)。不穩(wěn)定系數(shù)范圍在53.13（PgZF-HD05和PgZF-HD06）～83.72（PgZF-HD09），親水性范圍在-1.035（PgZF-HD07 和PgZF-HD08）～ -0.655（PgZF-HD10），表明所有家族成員均為不穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)亞細胞定位表明，11 個PgZFHD蛋白位于細胞核上，2個位于細胞質(zhì)，2個位于線粒體，表明不同的PgZF-HD 家族成員可能在不同的環(huán)境中發(fā)揮不同的作用。對二級結(jié)構(gòu)預測后發(fā)現(xiàn)，全部家族成員均有α-螺旋、延伸鏈、β-折疊和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，其中β-折疊的比例最低，所有家族成員均低于10%，最低的只有2.82%（PgZF-HD05 和PgZF-HD06），無規(guī)則卷曲的比例最高，均超過40%，最高的達到70.90%（PgZF-HD05 和PgZFHD06），表明無規(guī)則卷曲可能行使主要功能。

表1 石榴ZF-HD基因家族成員的理化性質(zhì)及二級結(jié)構(gòu)Tab.1 The physicochemical properties and secondary structure of ZF-HD gene family members of Punica granatum

2.2 石榴ZF-HD基因家族成員進化樹分析

根據(jù)所有石榴和擬南芥ZF-HD 家族成員蛋白質(zhì)序列的比較結(jié)果構(gòu)建進化樹（圖1），將15 個石榴ZF-HD 基因分成了5 個類別，ZF-HDⅠ、ZF-HDⅡ、ZF-HDⅢ、ZF-HDⅤ和MIF，分別包括了2、2、7、3、1個家族成員。在ZF-HDⅣ類別中只有擬南芥ZFHD基因，沒有石榴ZF-HD基因被歸類到此別中。

圖1 石榴和擬南芥ZF-HD基因家族成員的系統(tǒng)進化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of ZF-HD family members from Punica granatum and Arabidopsis thaliana

2.3 石榴ZF-HD基因結(jié)構(gòu)與保守基序分析

根據(jù)石榴ZF-HD 蛋白序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2A），共分成了5 類，分別為MIF、ZF-HDⅠ、ZFHDⅡ、ZF-HDⅢ和ZF-HDⅤ。為了進一步研究蛋白質(zhì)的特征區(qū)域，通過MEME 在線數(shù)據(jù)庫，對15 個PgZF-HD 蛋白的氨基酸序列進行分析后將其可視化（圖2B），以10 個保守基序（motif）為標準進行鑒定，分析發(fā)現(xiàn)，PgZF-HD 家族成員的motif2 和motif4高度保守，在15 個PgZF-HD 家族成員中均被鑒定到，其次為motif1 和motif3，這2 個保守基序只在MIF 類別下的PgZF-HD15 中沒被鑒定到。ZF-HDⅡ類別中鑒定到的motif 數(shù)量最多，共有9 個motif，只有motif8 沒有被鑒定到，ZF-HDⅠ類別中的所有基 因 均 鑒 定 到6 個motif（motif1、motif2、motif3、motif4、motif5和motif8），同時也發(fā)現(xiàn)motif8只在ZFHDⅠ類別的基因中被鑒定到。每一個類別下的保守基序有所差別，這些保守基序可能行使各自的功能而導致不同類別下的PgZF-HD基因的功能不同。根據(jù)石榴基因組注釋信息，比較15 個PgZFHD基因的外顯子-內(nèi)含子組成結(jié)構(gòu)并將其可視化（圖2C），結(jié)果表明，PgZF-HD基因結(jié)構(gòu)較為簡單，含有1～3 個外顯子，其中只有PgZF-HD06含有3個外顯子，1/2 以上的PgZF-HD基因均只有1 個外顯子，同一類別的基因具有相似的保守基序和基因結(jié)構(gòu)。將高度保守的基序組成進行圖譜繪制（圖2D），結(jié)果表明，motif1、motif2 和motif3 均由29 個氨基酸組成，motif4 由25 個氨基酸組成，這些motif 均含有多個保守的氨基酸位點，可能是行使功能的活性區(qū)域。

圖2 石榴ZF-HD基因家族的進化樹（A）、保守基序（B）、基因結(jié)構(gòu)（C）、基序組成（D）分析Fig.2 Analysis of phylogenetic relationships（A），conserved motif structure（B），gene structure（C），and motif composition（D）in PgZF-HD genes

2.4 石榴ZF-HD基因的染色體分布及基因復制事件分析

為了從染色體水平對石榴ZF-HD 基因進行分析，通過MCScanX 對石榴ZF-HD 基因復制事件進行研究。從圖3 可以看出，石榴ZF-HD 存在一些基因復制事件，共有3 對基因（PgZF-HD02/PgZFHD08、PgZF-HD02/PgZF-HD14、PgZF-HD09/PgZFHD12）可能是由染色體的大片段復制而形成的。為了進一步了解石榴ZF-HD 基因在染色體上的分布情況，根據(jù)石榴基因注釋信息，將全部鑒定到的15個PgZF-HD基因定位到石榴的染色體上（圖3），發(fā)現(xiàn)石榴ZF-HD 基因不均勻地分布在8 條染色體上，4號染色體（Chr4）、6號染色體（Chr6）和7號染色體（Chr7）含有最多的PgZF-HD基因，均為4 個，2號染色體（Chr2）、3 號染色體（Chr3）和8 號染色體（Chr8）均只含有1 個PgZF-HD基因，PgZF-HD基因在1 號染色體（Chr1）和5 號染色體（Chr5）上沒有分布。一般情況下，在同一條染色體上的基因復制事件為串聯(lián)重復事件，分析后發(fā)現(xiàn)，石榴ZF-HD 不存在基因重復事件。

圖3 石榴ZF-HD基因在染色體上的分布Fig.3 Chromosome location of PgZF-HD genes

2.5 石榴ZF-HD基因啟動子順式作用元件分析

通過在線網(wǎng)站PlantCARE 預測15 個PgZF-HD基因上游2 000 bp 序列的順式作用元件位點（圖4），除了TATA-box 和CAAT-box 2 個負責轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子以及光響應(yīng)的必要順式作用元件外，共發(fā)現(xiàn)有149 個關(guān)鍵的順式作用元件，其中包含生長素、赤霉素、脫落酸、茉莉酸甲酯、水楊酸等激素相關(guān)作用元件，以及生長發(fā)育相關(guān)和逆境脅迫相關(guān)的元件。其中，15 個PgZF-HD基因含有茉莉酸甲酯和脫落酸響應(yīng)元件數(shù)量最多，分別有32個茉莉酸甲酯響應(yīng)元件分布在7 個PgZF-HD基因中和26 個脫落酸響應(yīng)元件分布在11個PgZF-HD基因中。除了2 個水楊酸響應(yīng)元件只分布在PgZF-HD01和PgZF-HD02中外，大部分PgZF-HD基因均含有生長素和赤霉素響應(yīng)元件，且5 種激素響應(yīng)元件占關(guān)鍵順式作用元件總量的53%，表明PgZF-HD基因在響應(yīng)激素應(yīng)激方面可能具有重要作用。除此之外，PgZF-HD基因還含有響應(yīng)無氧、干旱和低溫等逆境相關(guān)作用元件共37個，占總數(shù)的24%。生長發(fā)育相關(guān)順式作用元件主要包括RY-element、GCN4-motif 和晝夜節(jié)律控制元件等，在15 個PgZF-HD基因中也均有不同數(shù)量的分布。每個PgZF-HD基因的啟動子區(qū)域均包含多個順式作用元件，表明PgZF-HD基因在植物激素響應(yīng)、生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)等方面均發(fā)揮重要作用。

圖4 石榴ZF-HD基因的啟動子分析Fig.4 Promoter analysis of PgZF-HD genes

3 結(jié)論與討論

目前由于植物基因組序列的可用性，對ZF-HD基因在許多植物物種中進行了全基因組研究。在黃瓜[12]、葡萄[15]、水稻[16]、番茄[9]、白菜[17]和蘋果[18]均已鑒定得到ZF-HD 基因家族成員，基因數(shù)量在黃瓜、葡萄和水稻中均為13 個，在番茄中有22 個，在白菜和蘋果中均有31 個。本研究共鑒定得到15 個石榴ZF-HD 基因，基因數(shù)量與前人研究的其他物種中ZF-HD 基因數(shù)量相比處于較少的水平。這可能與其基因復制事件較少有關(guān)，石榴ZF-HD基因家族只存在3 對大片段復制事件，不存在串聯(lián)重復事件?；驈椭剖录腔蚣易宄蓡T擴張的主要因素。

ZF-HD 蛋白可以根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分為ZHD 和MIF 2 個亞家族，ZHD 可分成ZF-HDⅠ—Ⅴ5 個類別[16]。本研究根據(jù)這一分類標準，將15 個石榴ZFHD 基因分成ZHD 和MIF 2 個亞家族，但ZHD 亞家族中分成了4 類，ZF-HDⅣ中沒有石榴ZF-HD 基因。ZF-HD 蛋白具有保守的ZF-HD 結(jié)構(gòu)域（pf04770），由2 個高度保守的結(jié)構(gòu)域組成，包括C末端同源結(jié)構(gòu)域（HD）和N 末端C2H2 型ZF 結(jié)構(gòu)域[15]。本研究中鑒定了15 個石榴ZF-HD 基因的保守基序，發(fā)現(xiàn)motif2 和motif4 高度保守，構(gòu)成了ZFHD_dimer 結(jié)構(gòu)域，motif1 和motif3 在除PgZF-HD15基因外的基因中均存在，構(gòu)成了homeo_ZF_HD 結(jié)構(gòu)域，PgZF-HD15也正是由于缺失了homeo_ZF_HD結(jié)構(gòu)域被歸類于MIF 亞家族中。HD 結(jié)構(gòu)域包含一段高度保守的DNA 序列，編碼近60 個氨基酸，以及3 個α-螺旋，其中第一螺旋和第二螺旋形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)過折疊和加工形成同源雜合盒結(jié)構(gòu)域[19]；ZF結(jié)構(gòu)域包含2 對保守的半胱氨酸或組氨酸殘基，它們結(jié)合在一個Zn2+上形成穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，半胱氨酸促進了鋅結(jié)構(gòu)域中均相或異相二聚體的形成[20]。通過分析保守基序的組成發(fā)現(xiàn)，構(gòu)成HD 結(jié)構(gòu)域的2個motif 所包括的氨基酸數(shù)量將近60 個，同時發(fā)現(xiàn)高度保守的4 個motif 均包含多個保守活性位點，這與前人的結(jié)果[15，17]一致。啟動子分析結(jié)果也表明，在PgZF-HD啟動子區(qū)域包含多個與激素、生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，ZF-HD 基因在擬南芥[6]、水稻[7]和番茄[9]等物種中的相關(guān)功能均已被驗證，本研究結(jié)果結(jié)合前人的研究成果可為石榴ZF-HD基因的克隆及功能研究提供良好的保障。