基于高通量測序的雪茄煙葉細(xì)菌多樣性與功能預(yù)測

閆鐵軍，鄭霖霖，李秀妮，劉利平，潘勇，王劍，龍飛，周平，時向東*

基于高通量測序的雪茄煙葉細(xì)菌多樣性與功能預(yù)測

閆鐵軍1，鄭霖霖2，李秀妮3，劉利平1，潘勇1，王劍1，龍飛1，周平1，時向東2*

1湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，湖北 武漢 430048；2河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草行業(yè)煙草栽培重點實驗室，河南 鄭州 450000；3四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川 成都 610000

【背景和目的】環(huán)境條件與煙葉理化性質(zhì)的改變直接影響煙葉的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能。為探究海南不同產(chǎn)區(qū)茄衣、茄套和茄芯細(xì)菌群落組成，研究雪茄煙葉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及代謝功能。【方法】以海南光村、昌江、白沙和五指山4個產(chǎn)區(qū)茄衣、茄套和茄芯為試驗材料，基于16S rRNA測序技術(shù)分析細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，PICRUSt預(yù)測分析細(xì)菌群落的代謝功能。【結(jié)果】12個樣本中共聚類2317個OTU，屬于10個科。五指山產(chǎn)區(qū)茄套的細(xì)菌群落豐富度及多樣性最高，其Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)分別為344.00、344.00和6.54。光村和五指山產(chǎn)區(qū)細(xì)菌群落豐富度及多樣性均表現(xiàn)為茄衣<茄套、茄芯。昌江產(chǎn)區(qū)則表現(xiàn)為茄衣>茄芯、茄套。茄衣的主要優(yōu)勢菌科為葡萄球菌科，相對豐度明顯高于茄套、茄芯，不同產(chǎn)區(qū)之間無明顯差異。茄套和茄芯的主要優(yōu)勢菌科為腸桿菌科，明顯高于茄衣，且昌江、五指山>光村、白沙。KEGG代謝通路分析結(jié)果表明，不同產(chǎn)區(qū)茄衣、茄套和茄芯細(xì)菌預(yù)測功能種類差異較小，豐度差異較大?！窘Y(jié)論】在科分類水平上，不同產(chǎn)區(qū)不同用途雪茄煙葉細(xì)菌群落多樣性豐富，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成相似，相對豐度有所差異，葡萄球菌科、腸桿菌科是造成煙葉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的關(guān)鍵菌科。細(xì)菌群落代謝途徑豐富，主要富集在碳水化合物代謝、氨基酸代謝和能量代謝通路中，除此之外，也較多的富集在輔助因子以及維生素代謝等通路。

雪茄煙葉；高通量測序；細(xì)菌群落組成；功能預(yù)測

傳統(tǒng)雪茄主要由茄衣、茄套和茄芯3部分煙葉組成，其中茄衣是判斷雪茄外觀品質(zhì)和風(fēng)味特征的主要依據(jù)[1]；茄套具有固定茄芯、協(xié)調(diào)茄衣與茄芯品質(zhì)的作用；茄芯作為雪茄的主體部分，決定吸食的主流風(fēng)味特征[2]。海南煙區(qū)與古巴煙區(qū)相比，有相近的緯度、類似的氣候條件和肥沃深厚的紅色砂壤土，是國內(nèi)最適宜種植生產(chǎn)雪茄煙原料的地區(qū)之一[3]。

煙葉表面微生物數(shù)量繁多，每克煙葉約含有5～8萬個微生物[4]，大致可分為細(xì)菌、霉菌、放線菌和酵母菌4大類，其中細(xì)菌數(shù)量要遠(yuǎn)高于霉菌、放線菌和酵母菌[5]。Reid等[6]研究發(fā)現(xiàn)雪茄煙葉表面存在大量以巨大芽孢桿菌（）為主的細(xì)菌和以青霉、曲霉為主的霉菌。細(xì)菌可以將煙葉中的有機(jī)成分如淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，通過某些代謝途徑轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)[7-10]。張鴿等[11]研究結(jié)果表明，國內(nèi)外不同地區(qū)茄衣表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異，以芽孢桿菌屬（）為優(yōu)勢細(xì)菌，其次是葡萄球菌屬（）。張曉娟等[12]研究發(fā)現(xiàn)，對人工發(fā)酵的茄衣煙葉葉面進(jìn)行分離，可以得到蠟狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌等8種菌株，其中巨大芽孢桿菌為煙葉表面優(yōu)勢菌群。16S rRNA高通量測序作為微生物多樣性研究的新型技術(shù)手段，如今已經(jīng)廣泛應(yīng)用于煙葉生產(chǎn)技術(shù)研究中，張磊等[13]基于Illumina Hiseq對雪茄煙葉不同發(fā)酵階段細(xì)菌的16S rRNA V3和V4可變區(qū)和真菌ITS1區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增測序，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵階段煙葉微生物菌群呈動態(tài)變化。周家喜等[14]利用高通量測序平臺對陳化過程中煙葉表面細(xì)菌的16S rRNA V4區(qū)進(jìn)行研究，分析煙葉陳化過程中細(xì)菌群落演替規(guī)律以及與煙葉化學(xué)成分間的作用關(guān)系。

研究表明，雪茄煙葉細(xì)菌種類組成與雪茄煙葉用途、發(fā)酵工藝、生產(chǎn)環(huán)境等因素有關(guān)，不同地區(qū)生產(chǎn)的雪茄煙葉細(xì)菌群落組成可能存在較大差異[15]。目前研究主要集中在煙葉發(fā)酵、陳化過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化等方面，而對不同產(chǎn)區(qū)茄衣、茄套和茄芯煙葉細(xì)菌群落區(qū)系及功能差異的研究較少。本研究以海南昌江、白沙、光村、五指山4個產(chǎn)區(qū)茄衣、茄套和茄芯煙葉為試驗材料，利用16S rRNA高通量測序技術(shù)比較分析自然狀態(tài)下煙葉的細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)特征，并對菌群功能進(jìn)行預(yù)測。為探究海南不同產(chǎn)區(qū)茄衣、茄套和茄芯煙葉的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成差異及功能，提升雪茄煙葉品質(zhì)，篩選優(yōu)勢功能細(xì)菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為海南建恒哈瓦那雪茄有限公司和五指山勇毅雪茄莊園有限公司提供的海南光村、昌江、白沙和五指山4個產(chǎn)區(qū)2018年產(chǎn)中部葉一級茄衣、茄套和茄芯，統(tǒng)一于海南光村雪茄煙生產(chǎn)基地進(jìn)行初次發(fā)酵，茄衣采用裝箱發(fā)酵，茄套、茄芯采用堆積發(fā)酵。發(fā)酵完成后統(tǒng)一在煙葉醇化倉庫（常年平均溫度18℃，濕度63%）醇化3年后取樣，每個產(chǎn)區(qū)每類煙葉取樣1份，每個煙葉樣品采集1 kg，總共12份煙葉樣品。

1.2 試驗方法

1.2.1 葉際微生物DNA提取

使用無菌剪刀分別取100 g雪茄煙葉放入錐形瓶中，加入PBS緩沖液并使緩沖液完全浸泡煙葉，置于搖床中37℃，200 r/min，振蕩1 h。振蕩完成后，將含有微生物的PBS緩沖液置于離心機(jī)中，8000 r/min離心5 min，收集沉淀。樣品基因組DNA的提取采用E.Z.N.A.?soil試劑盒（美國OMEGA公司，貨號：D5625-01），每個樣品重復(fù)4次。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及高通量測序

對12個樣本的16S rRNA的V4-V5區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGG- TAA-3’）和907R（5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT- 3’）。PCR的反應(yīng)參數(shù)：98℃預(yù)變性5 min，98℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，25個循環(huán)，最終72℃延伸5 min。

擴(kuò)增完成后使用Axygen凝膠回收試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增片段回收，回收的DNA片段使用Tru Seq Nano DNA LT Library Prep Kit試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，并使用Illumina MiSeq測序儀進(jìn)行基因測序（上海派森諾生物科技有限公司）。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

將有效數(shù)據(jù)在97%水平上聚類成操作分類單元（Operational Taxonomic Unit，OTU），基于OTUs聚類結(jié)果，通過Alpha多樣性指數(shù)、在科分類水平上細(xì)菌群落相對豐度以及細(xì)菌功能預(yù)測等分析對樣品中物種進(jìn)行注釋與評估。

所用數(shù)據(jù)采用Origin2021和Excel2013進(jìn)行處理分析。PICRUS（http://huttenhower.sph.harvard.edu/ galaxy/tool_runner?tool_id=PICRUSt_normalizn）對細(xì)菌功能進(jìn)行預(yù)測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)區(qū)、用途雪茄煙葉細(xì)菌群落測序數(shù)據(jù)分析

不同產(chǎn)區(qū)不同用途煙葉中細(xì)菌的有效序列及OTU數(shù)見表1。由表1可知，不同產(chǎn)區(qū)不同用途煙葉中細(xì)菌共獲得1096008條reads，平均每個樣品含有91334條序列。去除宿主DNA，按照97%的相似性進(jìn)行OTU聚類后，共得到2317個OTU，各樣品OTU數(shù)在41～342之間，樣本間OTU數(shù)存在差異。對不同產(chǎn)區(qū)煙葉進(jìn)行比較，OTU數(shù)呈現(xiàn)為五指山>昌江>白沙>光村，其中，昌江、白沙產(chǎn)區(qū)不同用途煙葉間OTU數(shù)之間無明顯差異，光村、五指山產(chǎn)區(qū)煙葉OTU數(shù)呈現(xiàn)出一致的規(guī)律，表現(xiàn)為茄套>茄芯>茄衣，且三者之間存在明顯差異，表明不同用途煙葉對光村、白沙產(chǎn)區(qū)OTU數(shù)有一定的影響。

表1 不同雪茄煙葉樣品中細(xì)菌的有效序列及OTUs數(shù)目

Tab.1 Effective sequences and OTUs numbers of bacteria in different cigar tobacco leaves

2.2 不同產(chǎn)區(qū)、用途雪茄煙葉樣品細(xì)菌群落Alpha多樣性分析

Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)用于衡量樣品中細(xì)菌群落的豐富度，Shannon指數(shù)用于衡量細(xì)菌群落的多樣性。不同產(chǎn)區(qū)不同用途雪茄煙葉中細(xì)菌Alpha多樣性分析結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，同一產(chǎn)區(qū)不同用途煙葉中Chao1、ACE和Shannon指數(shù)值有所差異（白沙產(chǎn)區(qū)除外），五指山、光村產(chǎn)區(qū)茄套、茄芯煙葉Chao1、ACE和Shannon指數(shù)值均顯著高于茄衣煙葉。昌江產(chǎn)區(qū)則與之相反，各項指數(shù)值以茄衣煙葉最高，其中Chao1和ACE指數(shù)值顯著高于茄套、茄芯煙葉。同一用途不同產(chǎn)區(qū)煙葉中的Chao1、ACE和Shannon指數(shù)值有所差異。由圖1（a、b）可知，茄衣煙葉中，昌江產(chǎn)區(qū)的Chao1、ACE數(shù)值顯著高于其他產(chǎn)區(qū)，分別為252.61、273.15，圖c中可知Shannon指數(shù)以白沙產(chǎn)區(qū)最高，與其他產(chǎn)區(qū)有顯著差異，為4.79。茄套煙葉中，各項指數(shù)均以五指山產(chǎn)區(qū)最高，且高于其余十一個樣本，分別為344.00、344.00和6.54，與其他3個產(chǎn)區(qū)差異顯著，表明五指山茄套煙葉具有較高的細(xì)菌群落豐富度和多樣性。茄芯煙葉中Chao1和ACE指數(shù)值與茄套煙葉趨勢一致，均以五指山產(chǎn)區(qū)最高，光村產(chǎn)區(qū)最低，且差異顯著，Shannon數(shù)值則表現(xiàn)為白沙產(chǎn)區(qū)最高，昌江產(chǎn)區(qū)最低，分別為5.27、3.64，存在顯著差異。表明五指山茄芯煙葉細(xì)菌群落豐富度較高而多樣性較低，光村產(chǎn)區(qū)則與之相反，細(xì)菌豐富度較低，多樣性較高。

注：圖中a，b，c分別代表Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)。大寫字母表示同一產(chǎn)區(qū)不同用途之間的顯著性差異，小寫字母表示同一用途不同產(chǎn)區(qū)煙葉之間的顯著性差異（P<0.05）；箱線圖上下橫線分別表示95%和5%置信區(qū)間，其中箱體中橫線代表中位數(shù)。

2.3 不同產(chǎn)區(qū)、用途雪茄煙葉樣品細(xì)菌群落科水平差異物種分析

不同產(chǎn)區(qū)及用途雪茄煙葉樣品細(xì)菌群落在科水平上分析結(jié)果如圖2所示，在科分類水平上，煙葉中細(xì)菌主要包括葡萄球菌科（Staphylococcaceae）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、腸桿菌科（Enterobacteria- ceae）、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）和甲基桿菌科（Methylobacteriaceae）等。其中腸桿菌科和伯克氏菌科為所有樣品共有菌科，平均相對豐度分別為43.5%，1.2%。從樣品產(chǎn)區(qū)來源看，不同產(chǎn)區(qū)煙葉樣品在科水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成均以葡萄球菌科和腸桿菌科為主要優(yōu)勢菌科，相對豐度無明顯差異。

從煙葉用途來看，不同用途煙葉中的主要優(yōu)勢菌科不一致。茄衣煙葉中的主要優(yōu)勢菌科為葡萄球菌科，相對豐度在90.0%以上，明顯高于茄套、茄芯，但產(chǎn)區(qū)之間無明顯差異。光村產(chǎn)區(qū)茄衣煙葉中腸桿菌科的相對豐度為2.5%，是其他產(chǎn)區(qū)茄衣煙葉的2倍以上。除此之外，茄衣煙葉中含有鞘脂單胞菌科（Sphingomo- nadaceae）、橙單胞菌科（Aurantimonadacea）和布魯氏菌科（Brucellaceae），且僅存在于白沙和五指山產(chǎn)區(qū)中，在兩個產(chǎn)區(qū)之間的相對豐度無明顯差異。

腸桿菌科和假單胞菌科在茄套煙葉細(xì)菌科中占主導(dǎo)地位。其中，腸桿菌科的相對豐度在42.7%～50.5%之間，無明顯差異；假單胞菌科在不同用途煙葉之間的相對豐度表現(xiàn)為茄套>茄衣、茄芯，在產(chǎn)區(qū)之間表現(xiàn)為光村最高，白沙最低，分別為44.1%，25.0%。此外，在科分類水平上，茄套煙葉的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在不同產(chǎn)區(qū)之間有明顯差異，如甲基桿菌科、莫拉氏菌科（Moraxellaceae）、叢毛單菌科（Comaminadaceae）分別僅存在于白沙、昌江、五指山產(chǎn)區(qū)中，相對豐度分別為22.8%，3.3%、2.3%，且明顯高于其他樣本。

茄芯煙葉中相對豐度最高的為腸桿菌科，且明顯高于茄衣、茄套煙葉，分別為96.8%（昌江）、84.4%（五指山）、77.0%（光村）和73.1%（白沙）。假單胞菌科為茄芯煙葉的第二主要菌科，主要分布在光村、白沙產(chǎn)區(qū)，相對豐度分別為20.0%、19.5%。

圖2 基于科水平的不同雪茄煙葉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

2.4 不同產(chǎn)區(qū)、用途雪茄煙葉樣品細(xì)菌群落功能預(yù)測

KEGG是分析生物代謝通路的數(shù)據(jù)庫，主要是將基因、基因組信息以及更高層次的功能信息結(jié)合起來，對基因的功能進(jìn)行系統(tǒng)化分析[16]。KEGG代謝通路分析結(jié)果表明，二級通路豐度分析共有41種代謝通路，圖3展示12個樣品代謝通路豐度值前12的結(jié)果。主要代謝通路有異生物素的生物降解和代謝（Xenobiotics biodegration and metabolism）、核酸代謝（Nucleotide metabolism）、輔助因子和維生素的代謝（Metabolism of cofactors and vitamins）、脂質(zhì)代謝（Lipid metabolism）、糖的生物合成與代謝（Glycan biosynthesis and metabolisim）等通路。由圖3可知，不同產(chǎn)區(qū)茄衣、茄套和茄芯煙葉樣本主要富集在碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）、氨基酸代謝（Amino acid metabolism）、能量代謝（Energy metabolism）這3個通路上，同時富集到維生素和輔助因子代謝通路也較多。碳水化合物代謝和氨基酸代謝通路主要富集昌江、光村和五指山產(chǎn)區(qū)茄衣煙葉，在茄套和茄芯煙葉中功能豐度較低。能量代謝通路主要富集在昌江和白沙產(chǎn)區(qū)茄芯煙葉。光村與五指山產(chǎn)區(qū)則以茄套煙葉中能量代謝功能豐度更高。

3 討論

本研究對海南昌江、光村、白沙和五指山4個雪茄煙葉產(chǎn)區(qū)的茄衣、茄套和茄芯煙葉表面細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA高通量測序，通過Alpha多樣性分析、PICRUSt功能預(yù)測等揭示了海南不同產(chǎn)區(qū)不同用途煙葉表面菌群結(jié)構(gòu)及功能的變化。

菌群結(jié)構(gòu)分析表明，在科分類水平上，不同產(chǎn)區(qū)煙葉的主要優(yōu)勢菌科一致，均為腸桿菌科和葡萄球菌科，相對豐度無明顯差異。同一產(chǎn)區(qū)不同用途煙葉中優(yōu)勢菌科不同，茄衣煙葉以葡萄球菌科為主，這與張鴿等[11]對不同國家雪茄外包皮煙葉表面細(xì)菌差異的研究結(jié)果一致，且光村茄衣的相對豐度最高。茄套和茄芯煙葉的主要優(yōu)勢菌科為腸桿菌科和假單胞菌科，這與伍雪瑩等[17]對不同陳化期煙葉表面細(xì)菌種類的研究結(jié)果基本相同。本研究發(fā)現(xiàn)，腸桿菌科和假單胞菌科的相對豐度在產(chǎn)區(qū)之間無明顯差異，而腸桿菌科在茄芯中顯著高于茄套和茄衣，假單胞菌科在茄套中的相對豐度最高，甲基桿菌科大量存在于白沙茄套煙葉中，這說明煙葉中的細(xì)菌在不同來源、不同用途煙葉上有所差異，與包可翔[18]、蘇加坤[19]等對不同地區(qū)及不同部位的煙葉表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究結(jié)果一致。分析差異存在的原因可能有兩方面，一方面是煙葉的發(fā)酵方式以及自身素質(zhì)不同所致[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)，茄衣主要采用裝箱發(fā)酵，茄芯為堆垛發(fā)酵[2]，且茄衣中積累的有機(jī)物質(zhì)、含氮化合物等較茄芯較少，使得煙葉中細(xì)菌生長所需要的溫濕度以及營養(yǎng)物質(zhì)有所差異[22-23]。另一方面可能是當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境不同，環(huán)境中的細(xì)菌區(qū)系不同，煙葉可能選擇性地富集一些土壤細(xì)菌，進(jìn)而造成煙葉中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有所差異。研究發(fā)現(xiàn)，腸桿菌可以作為生物農(nóng)藥、固氮微生物等，對有害生物防害、植物生長、植物代謝等有著積極作用[24-25]。葡萄球菌可以參與脂肪代謝，產(chǎn)生大量的脂肪酸，產(chǎn)生的脂肪酸可以進(jìn)一步降解形成醛類、甲基酮等芳香類物質(zhì)，是煙葉香氣物質(zhì)的重要來源[26]。假單胞菌可以降解煙堿，影響雪茄煙葉吸食勁頭[27]。甲基桿菌可以利用單碳化合物產(chǎn)生各種氨基酸以及酶類[28]。

利用PICRUSt對不同產(chǎn)區(qū)及用途煙葉表面細(xì)菌進(jìn)行功能預(yù)測，基于KEGG第2層級的功能基因分析，顯示不同產(chǎn)區(qū)及用途煙葉細(xì)菌功能以碳水化合物代謝、氨基酸代謝和能量代謝三種功能豐度最高，表明煙葉表面的細(xì)菌群落積極參與了基本的代謝過程。這與張鴿[27]等研究結(jié)果類似，在發(fā)酵過程中，雪茄煙葉中細(xì)菌功能以氨基酸代謝和碳水化合物代謝兩種功能豐度最高。一方面，碳水化合物代謝途徑的中間產(chǎn)物可以為許多物質(zhì)的合成提供原料，如芳香族氨基酸的合成等[29-30]。另一方面，氨基酸可以與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，是煙草中一類重要的致香反應(yīng)，與煙葉感官品質(zhì)密切相關(guān)[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，能量代謝在茄芯和茄套煙葉中相對豐度較高，茄芯、茄套煙葉中的細(xì)菌群落能夠為下一步煙葉發(fā)酵提供能量。同一產(chǎn)區(qū)茄衣、茄套和茄芯煙葉品質(zhì)有所差異，可能是因為不同用途煙葉中的細(xì)菌組成與豐度有所差異，形成的功能基因有所差異，進(jìn)而影響著煙葉碳水化合物以及氨基酸等物質(zhì)的代謝途徑。由于PICRUSt功能預(yù)測存在局限性，因此后續(xù)需要結(jié)合宏基因組測序等技術(shù)進(jìn)一步分析。

本文對不同產(chǎn)區(qū)及用途煙葉的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)的描述，并且預(yù)測了煙葉細(xì)菌群落代謝功能的變化，為下一步探究煙葉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異與煙葉理化性質(zhì)之間的關(guān)系，篩選功能菌株用于雪茄煙葉發(fā)酵過程中以提高雪茄煙葉品質(zhì)提供理論依據(jù)。本文對細(xì)菌的分類僅限于科的水平，在煙葉中同一科的不同細(xì)菌屬可能會行使不同的功能，而不同科的細(xì)菌也可能會行使同樣的功能[32]，因此研究結(jié)果存在偏差，今后仍需要進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

本研究采用高通量測序技術(shù)對海南不同產(chǎn)區(qū)及用途煙葉中細(xì)菌群落進(jìn)行分析，通過分析比較不同產(chǎn)區(qū)、不同用途煙葉的優(yōu)勢菌科、相對豐度以及功能基因代謝途徑，為提升煙葉品質(zhì)及后續(xù)發(fā)酵提供相關(guān)細(xì)菌信息。結(jié)果顯示，不同產(chǎn)區(qū)的主要優(yōu)勢菌科為葡萄球菌科和腸桿菌科，相對豐度沒有明顯差異。葡萄球菌科、腸桿菌科和假單胞菌科是造成不同用途煙葉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的關(guān)鍵菌科。在功能預(yù)測分析中，同一產(chǎn)區(qū)不同用途煙葉表面細(xì)菌主要功能預(yù)測為碳水化合物的代謝、氨基酸代謝、能量代謝，除此之外，也較多的富集在維生素代謝等通路。該結(jié)論為篩選功能菌，改善煙葉品質(zhì)提供理論依據(jù)。

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Diversity analysis and function prediction of bacterial communities in cigar leaves based on high-throughput sequencing technology

YAN Tiejun1, ZHENG Linlin2, LI Xiuni3, LIU Liping1, PAN Yong1, WANG Jian1, LONG Fei1, ZHOU Ping1, SHI Xiangdong2*

1 China Tobacco Hubei Industrial Co., Ltd., Wuhan 430048, China;2 Tobacco College of Henan Agricultural University, Zhengzhou 45000, China;3 Sichuan Agricultural University, Chengdu 610000, China

The change of environmental conditions and the physical and chemical properties of tobacco leaves directly affects the structure and function of tobacco leaf bacterial communities. The purpose of this study was to explore the composition of bacterial communities in cigar wrapper leaves, case leaves and core leaves in different producing areas of Hainan, and to study the bacterial community structure and metabolic function of cigar tobacco.16S rRNA sequencing technology was adopted to analyze the bacterial community structure, and PICRUSt was employed to predict the metabolic profiles of the bacterial community.(1) Alpha diversity analysis results show that 12 samples clustered a total of 2317 OTUs, belonging to 10 sections. The diversity and richness of bacterial communities in the aubergine tobacco leaves in the five-fingered mountain production area were the highest, with the values of Chao1, ACE and Shannon indexing 344.00, 344.00 and 6.54, respectively. (2) The analysis of the structure of the flora shows that the main dominant bacteria on the surface of the cigar wrapper leaves are Staphylococcaceae, the main dominant bacteria on the surface of the cigar case and cigar core leaves are Enterobacteriaceaeand Pseudomonadaceae, respectively; (3) The results of KEGG metabolic pathway analysis show that the main enrichment pathways of microorganisms on the surface of tobacco leaves in different producing regions are consistent, mainly in carbohydrate metabolism, amino acid metabolism, energy metabolism and metabolism of cofactors and vitamins.At the level of family classification, the bacterial community diversity is abundant in different cigar tobacco leaves from different producing areas with different uses, and the bacterial community structure composition is similar, but the relative abundance is different., wherestaphylococcaceae and enterobacteriaceae are the key bacteria causing differences in the structure of tobacco leaf bacterial community. Bacterial community is rich in metabolic pathways, mainly enriched in carbohydrate metabolism, amino acid metabolism and energy metabolism pathways, in addition, also enriched in cofactor and vitamin metabolism pathways.

cigar leave; high-throughput sequencing; bacterial community structure; function prediction

Corresponding author. Email：yancaoshixd@163.com

黃鶴樓葉束式手卷雪茄原料生產(chǎn)技術(shù)研究（No.2019420000340640）

閆鐵軍（1980—），碩士，高級農(nóng)藝師，主要研究方向：卷煙產(chǎn)品研發(fā)與原料應(yīng)用技術(shù)研究，Email：114461411@qq.com

時向東（1966—），Email：yancaoshixd@163.com

2021-11-02；

2022-02-22

閆鐵軍，鄭霖霖，李秀妮，等. 基于高通量測序的雪茄煙葉細(xì)菌多樣性與功能預(yù)測[J]. 中國煙草學(xué)報，2022，28（4）.YAN Tiejun，ZHENG Linlin，LI Xiuni, et al. Diversity analysis and function prediction of bacterial communities in cigar leaves based on high-throughput sequencing technology[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022, 28(4). doi:10.16472/j.chinatobacco. 2021.T0197