根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的尖孢鐮刀菌遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建

李娟，邱睿，張盈盈，李小杰，李成軍，李淑君

研究簡(jiǎn)報(bào)

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的尖孢鐮刀菌遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建

李娟1,2，邱睿1*，張盈盈1，李小杰1，李成軍1，李淑君1

1 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南省許昌市永昌大道與青梅路交叉口 461000；2 定西市植保植檢站，甘肅省定西市安定區(qū)公園路22號(hào) 743000

【背景和目的】尖孢鐮刀菌（）可引起煙草鐮刀菌根腐?。‵usarium root rot of tobacco），為明確病原菌致病相關(guān)基因?！痉椒ā恳詿煵輳?qiáng)致病性尖孢鐮刀菌菌株B-9-1的分生孢子為受體，利用攜帶潮霉素B（hygromycin B，）質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌（）介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的尖孢鐮刀菌轉(zhuǎn)化菌株，構(gòu)建煙草尖孢鐮刀菌遺傳轉(zhuǎn)化體系?！窘Y(jié)果】（1）尖孢鐮刀菌的最優(yōu)轉(zhuǎn)化體系為：潮霉素B最適質(zhì)量濃度50mg/mL，在25℃條件下，以1 cm寬的條形硝酸纖維膜為載體，將攜帶有pCAM--質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌搖菌培養(yǎng)至OD600=0.7，與震蕩培養(yǎng)24 h獲得的濃度為106個(gè)/mL的尖孢鐮刀菌分生孢子懸浮液在含有200mmol/L乙酰丁香酮的共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)48 h。（2）轉(zhuǎn)化子繼代培養(yǎng)、PCR檢測(cè)和熒光顯微觀察結(jié)果表明外源基因成功整合到煙草尖孢鐮刀菌基因組中并可以進(jìn)行穩(wěn)定遺傳表達(dá)。（3）Sourthern blot分析結(jié)果進(jìn)一步證明T-DNA成功整合到尖孢鐮刀菌基因組中，且60%以上為單拷貝插入?！窘Y(jié)論】本研究成功構(gòu)建了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草尖孢鐮刀菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，為煙草尖孢鐮刀菌基因功能及病原菌的致病機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

煙草尖孢鐮刀菌；遺傳轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化子

煙草鐮刀菌根腐病是由鐮刀菌屬病原菌（spp.）引起的一種真菌性病害，尖孢鐮刀菌（）是優(yōu)勢(shì)致病菌，主要從煙株根部入侵，導(dǎo)致根部變黑、葉片變黃萎靡、維管束腐爛，最終植物整株死亡，嚴(yán)重危害煙葉生產(chǎn)[1]。近年來，該病害在我國(guó)煙區(qū)發(fā)生面積逐年增加，造成的損失逐年加大，特別是河南、云南、福建、湖南等各大煙區(qū)發(fā)生流行性增強(qiáng)，已成為我國(guó)煙區(qū)重大病害之一[2-5]。明確病原菌致病基因、病原菌與宿主互作機(jī)制等，可為病害精準(zhǔn)防控提供新靶標(biāo)。

遺傳轉(zhuǎn)化是分離基因、研究基因功能的重要手段，與原生質(zhì)體介導(dǎo)的傳統(tǒng)遺傳轉(zhuǎn)化方法相比，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化具有操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)化效率高、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[6-8]，被廣泛應(yīng)用于真菌基因資源開發(fā)等相關(guān)研究中[8]。綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）基因在動(dòng)植物和微生物中都能表達(dá)，植物病原菌的綠色熒光標(biāo)記，可實(shí)現(xiàn)其定殖、侵染過程等的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，已成為研究病原菌與植物互作的有效方法[9-10]。目前基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的病原菌綠色熒光蛋白遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多種絲狀真菌的轉(zhuǎn)化，如假禾谷鐮刀菌（）[11]、禾谷鐮刀菌（）[12]、稻瘟病菌（）[13]、黑曲霉（）[14]等。迄今，關(guān)于煙草尖孢鐮刀菌遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的研究未見報(bào)道。本研究利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化煙草強(qiáng)致病尖孢鐮刀菌B-9-1菌株，旨在建立煙草尖孢鐮刀菌最優(yōu)遺傳轉(zhuǎn)化體系，為煙草尖孢鐮刀菌致病基因的篩選及其致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

煙草尖孢鐮刀菌（）B-9-1分離自河南省許昌市襄城縣煙草病株根部，經(jīng)單孢分離及致病性測(cè)定后保存在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所菌源庫(kù)。攜帶含有綠色熒光蛋白（）基因和潮霉素B（hygromycin B,）抗性基因pCAM質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌（），由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)李洪連老師課題組惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）、LB液體培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基（IM）及共培養(yǎng)培養(yǎng)基（Co-IM）參照高慧敏的方法配置[15]。使用時(shí)，1 L Co-IM中加入0.2 mol/L AS 1 mL，1 mol/L MES 40 mL，0.01% FeSO4（w/v）10 mL。

1.1.3 供試引物、抗生素及生化試劑

供試引物見表1。

抗生素、生化試劑及硝酸纖維膜：潮霉素B（CAS#31282-04-9）、硫酸卡那霉素(CAS#25389-94-0)等抗生素及硝酸纖維膜（Lot#R0HB80049）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；地高辛標(biāo)記試劑盒（Lot#47754321）購(gòu)自德國(guó)Roche公司，I限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（Lot#E301KA7837）及其他常規(guī)分子生物學(xué)試劑購(gòu)自生工生物工程股份有限公司。

表1 檢測(cè)引物信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 潮霉素B敏感性測(cè)定

從斜面保存的煙草尖孢鐮刀菌B-9-1上挑取少許菌絲接種于PDA培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)5 d，采用菌餅接種法，用打孔器在菌落邊緣取直徑5 mm的菌餅接種于含有潮霉素濃度為0、20、30、40、50、60mg/mL的PDA培養(yǎng)基上，25℃黑暗培養(yǎng)7 d，觀察鐮刀菌生長(zhǎng)狀態(tài)，篩選能完全抑制尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)的潮霉素B的濃度，每個(gè)梯度做3次重復(fù)。

1.2.2 根癌農(nóng)桿菌菌液以及尖孢鐮刀菌孢子懸浮液制備

根癌農(nóng)桿菌菌液的制備：將含有pCAM--質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株在含有卡那霉素（50mg/mL）的LB平板上劃線活化，28℃培養(yǎng)48 h，用無菌牙簽蘸取單菌落進(jìn)行菌落PCR，將擴(kuò)增出和基因的單菌落接種于含有卡那霉素（50mg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5，用IM培養(yǎng)基將其稀釋至OD600=0.2后，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至OD600為0.3、0.5、0.7、0.9，備用。

尖孢鐮刀菌分生孢子懸浮液制備：將在PDA培養(yǎng)基上活化的尖孢鐮刀菌B-9-1用打孔器取菌落邊緣3塊直徑5 mm的菌餅分別接種于3瓶100 mL的PDB培養(yǎng)基中，25℃、180 r/min分別震蕩培養(yǎng)24、48、72 h。雙層無菌紗布濾除菌絲，將濾液8000 r/min 離心5 min，棄上清，將管底殘留的孢子沉淀用無菌水重新懸浮，繼續(xù)8000 r/min 離心5 min，棄上清，重復(fù)3次，備用。

1.2.3 尖孢鐮刀菌轉(zhuǎn)化及體系建立

用1.2.2中準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌菌液將1.2.2中制備的鐮刀菌孢子懸浮并稀釋至106個(gè)/mL，取200mL混合液均勻涂布于預(yù)先鋪有不同形狀（1 cm寬條形和直徑8.0 cm圓形）無菌硝酸纖維膜的Co-IM培養(yǎng)基上（培養(yǎng)基中乙酰丁香酮濃度分別為200、300和400mmol/mL），25℃分別黑暗培養(yǎng)24、48、72 h后，將硝酸纖維膜翻面轉(zhuǎn)至含有50mg/mL潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上，直至菌落長(zhǎng)出，挑取單菌落于常規(guī)PDA平板上，為初選轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性分析

從1.2.3獲得的轉(zhuǎn)化子中隨機(jī)挑取30個(gè)，在常規(guī)PDA平板上連續(xù)培養(yǎng)5代后，再轉(zhuǎn)接到含有50mg/mL潮霉素B的PDA平板上，以不加潮霉素的PDA平板為對(duì)照，觀察菌落生長(zhǎng)情況，確定轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.5 轉(zhuǎn)化子PCR檢測(cè)

將獲得的轉(zhuǎn)化子接種于PDA平板上，25℃培養(yǎng)7 d，收集菌絲，按照真菌DNA提取試劑盒說明提取基因組總DNA，用和的特異性引物，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR檢測(cè)，以野生型菌株基因組總DNA為對(duì)照。PCR反應(yīng)體系為：基因組DNA（100 ng/mL）1mL，上下游引物（10mmol/L）各1mL，2×Taq PCR Master Mix 12.5mL，用ddH2O 補(bǔ)足到25mL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃30 s，表1中Tm退火30 s，72℃ 60 s，34個(gè)循環(huán)；72℃10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.6 轉(zhuǎn)化子熒光顯微觀察

將獲得的轉(zhuǎn)化子接種于PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2～3 d，挑取新鮮的菌絲及孢子制成臨時(shí)玻片，以野生型菌株為對(duì)照，在熒光顯微鏡下觀察菌絲及孢子，判斷綠色熒光蛋白基因是否整合到尖孢鐮刀菌基因組中及其是否正常表達(dá)。

1.2.7 Southern印跡雜交（Southern blot）分析

按照地高辛標(biāo)記試劑盒說明制備DIG標(biāo)記探針，待測(cè)轉(zhuǎn)化子基因組DNA經(jīng)I單酶切后按照說明書操作程序進(jìn)行雜交，檢測(cè)轉(zhuǎn)化子基因組中T-DNA的插入拷貝數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用DPS 7.05統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Duncan氏新復(fù)極差法（Duncan’s multiple range test）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 潮霉素B敏感性測(cè)試

潮霉素B敏感性測(cè)試結(jié)果表明（圖1），培養(yǎng)7 d后，潮霉素B濃度為0mg/mL時(shí)尖孢鐮刀菌可正常生長(zhǎng)，潮霉素B濃度≥20mg/mL時(shí)B-9-1的生長(zhǎng)受到明顯抑制，且隨著潮霉素B的濃度逐漸加大，抑制作用明顯加強(qiáng)。當(dāng)潮霉素B的濃度≥40mg/mL時(shí)完全抑制了尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)。因?yàn)槌泵顾谺見光易分解，為減少假陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)頻率，后續(xù)研究均采用潮霉素B濃度為50mg/mL開展。

注：潮霉素B的濃度分別是A：0 mg/mL；B：20 mg/mL；C：30 mg/mL；D：40mg/mL；E：50 mg/mL。

2.2 尖孢鐮刀菌遺傳轉(zhuǎn)化體系建立

對(duì)轉(zhuǎn)化受體分生孢子的培養(yǎng)時(shí)間、農(nóng)桿菌菌液濃度、乙酰丁香酮（AS）濃度和共培養(yǎng)的時(shí)間以及載體膜形狀的優(yōu)化結(jié)果表明，各參數(shù)對(duì)尖孢鐮刀菌的遺傳轉(zhuǎn)化均有顯著影響（圖2），轉(zhuǎn)化受體菌株B-9-1在PDB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)24 h獲得的分生孢子轉(zhuǎn)化效率顯著高于其他處理，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)于24 h的孢子懸浮液遺傳轉(zhuǎn)化效率均降低；農(nóng)桿菌菌液OD600=0.7時(shí)的轉(zhuǎn)化效率最高，可獲得轉(zhuǎn)化子數(shù)為223個(gè)/106孢子，OD600低于或高于該濃度轉(zhuǎn)化效率均降低；參照其它絲狀真菌乙酰丁香酮（AS）濃度為200mmol/mL時(shí)，獲得的轉(zhuǎn)化子最多，為98個(gè)/106孢子，隨著乙酰丁香酮濃度增加獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)量逐漸減少；每皿3個(gè)條形硝酸纖維膜時(shí)，平均每皿的轉(zhuǎn)化子數(shù)目為21個(gè)，而當(dāng)硝酸纖維膜為近培養(yǎng)皿大小的圓形時(shí)，平均每皿的轉(zhuǎn)化子數(shù)量?jī)H為2個(gè)（圖3）。因此，尖孢鐮刀菌的最優(yōu)轉(zhuǎn)化體系是在25℃條件下，以1 cm寬的條形硝酸纖維膜為載體，將攜帶有pCAM--質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌搖菌培養(yǎng)至OD600=0.7，與震蕩培養(yǎng)24 h獲得的濃度為106個(gè)/mL的尖孢鐮刀菌分生孢子懸浮液在含有200mmol/L乙酰丁香酮的共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)48 h。

注：圖中不同處理中不同小寫字母之間表示處理間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（≤0.05）。在待測(cè)指標(biāo)設(shè)置梯度外，其他指標(biāo)為分生孢子震蕩培養(yǎng)24 h、農(nóng)桿菌OD600=0.7、AS濃度為200mmol/L、共培養(yǎng)48 h、纖維膜為1 cm寬條形。

Note: Value within each column of the same treatment not marked by the same lowercase letters signifies significant difference (≤0.05). In addition to the gradient set for the indexes to be measured,, other indicators are conidia shock culture for 24 h,OD600=0.7, AS concentration of 200mmol/L, co-culture for 48 h and 1cm wide fiber membrane strip.

圖2 不同因素（分生孢子培養(yǎng)時(shí)間、農(nóng)桿菌濃度、乙酰丁香酮濃度、共培養(yǎng)時(shí)間和硝酸纖維膜形狀）對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

Fig. 2 The influence of different factors (Conidia culture time, agrobacterium concentration, Acetosyringone concentration, cocultivation time and shape of hybridization nitrocellulose filter) on transformation efficiency

圖3 最優(yōu)條件下轉(zhuǎn)化子獲得情況

2.3 轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性分析

隨機(jī)挑選的30個(gè)B-9-1的轉(zhuǎn)化菌株在常規(guī)PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)5代后，均可在含有50mg/mL潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，而野生型菌株不能生長(zhǎng)（圖4），證明T-DNA成功插入B-9-1的基因組中，并能穩(wěn)定遺傳表達(dá)。

2.4 轉(zhuǎn)化子PCR檢測(cè)

隨機(jī)挑選20個(gè)轉(zhuǎn)化菌株，用和基因引物對(duì)進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，除野生型菌株外，所有轉(zhuǎn)化子均可擴(kuò)增出560bp和1000bp的特異性片段（圖5），表明農(nóng)桿菌質(zhì)粒中的基因和基因成功整合到尖孢鐮刀菌的基因組中。

注：A為gfp基因檢測(cè)；B為hyg基因的檢測(cè)；M：DL2000 Marker；1～20：轉(zhuǎn)化子；21：ck-野生型尖孢鐮刀菌。

2.5 轉(zhuǎn)化子熒光檢測(cè)

如圖6所示，在熒光顯微鏡下，轉(zhuǎn)化菌株的菌絲、孢子可發(fā)出綠色熒光，而野生型菌株的菌絲和孢子則無熒光。說明農(nóng)桿菌質(zhì)粒的GFP報(bào)告基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入尖孢鐮刀菌基因組中，并可以正常表達(dá)。

圖6 轉(zhuǎn)化子熒光顯微觀察（A為野生型菌株，B為轉(zhuǎn)化子）

2.6 Southern Blot檢測(cè)

以潮霉素抗性基因片段為探針進(jìn)行Sourthern雜交，結(jié)果顯示，隨機(jī)挑選的6個(gè)轉(zhuǎn)化菌株均能檢測(cè)到特異性條帶，其中1、2、3、6為單拷貝，4和5為多拷貝，野生型菌株條帶，說明T-DNA成功整合到尖孢鐮刀菌基因組中，且60%以上為單拷貝插入。

圖7 轉(zhuǎn)化子southern blot檢測(cè)

3 討論

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化（ATMT）已在真菌遺傳轉(zhuǎn)化中得到廣泛應(yīng)用，為真菌寄主互作、侵染過程及菌株的生態(tài)學(xué)等研究提供了有力的工具[10]。轉(zhuǎn)化效率的高低是評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化體系的重要指標(biāo)，不同轉(zhuǎn)化條件直接影響轉(zhuǎn)化的成敗和效率[16-17]。不同真菌、甚至同一真菌不同小種之間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的條件都有不同的要求[18]。尖孢鐮刀菌為煙草鐮刀菌根腐病的主要致病菌之一，建立其遺傳轉(zhuǎn)化體系，構(gòu)建突變體庫(kù)，可為病原菌致病機(jī)制和新防治策略提供理論基礎(chǔ)和支持。

前人就分生孢子濃度對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響開展了較多研究[11,16]，但有關(guān)分生孢子培養(yǎng)方式、培養(yǎng)時(shí)間與遺傳轉(zhuǎn)化效率相關(guān)性研究鮮見報(bào)道。本研究表明，震蕩培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)化受體培養(yǎng)時(shí)間與ATMT轉(zhuǎn)化效率呈負(fù)相關(guān)，即培養(yǎng)時(shí)間越短，越新鮮的分生孢子越有利于轉(zhuǎn)化子的形成。其原因還有待進(jìn)一步研究。

已有研究表明，隨著農(nóng)桿菌或者受體菌濃度的增加，轉(zhuǎn)化效率明顯提高，且兩者數(shù)量達(dá)到一定比例時(shí)，可獲得最高的轉(zhuǎn)化效率[17]。本研究中，農(nóng)桿菌OD600在0.3～0.9范圍內(nèi)，農(nóng)桿菌濃度與轉(zhuǎn)化效率呈現(xiàn)先升后降的倒U型，這與馮澤慶的研究結(jié)果基本一致[19]，這是因?yàn)榍秩鹃_始前，農(nóng)桿菌要附著于受體細(xì)胞表面，當(dāng)附著的農(nóng)桿菌數(shù)量飽和時(shí)，再提高其濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響不大，而農(nóng)桿菌或者受體細(xì)胞濃度過大會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)化造成不良的影響[15]，張明星等[20]的研究也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。

共培養(yǎng)時(shí)間也是影響遺傳轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因 素[16]。不同絲狀真菌的共培養(yǎng)時(shí)間有差異，黃運(yùn)福等的研究表明少節(jié)叢孢菌遺傳轉(zhuǎn)化最適共培養(yǎng)時(shí)間為60 h[21]，楊越寒等的研究表明油菜黑脛病菌最適共培養(yǎng)時(shí)間為72 h[22]。本研究中，尖孢鐮刀菌與農(nóng)桿菌的最佳共培養(yǎng)時(shí)間為48 h。這與馮慶澤的結(jié)果一致[19]。共培養(yǎng)時(shí)間太短不能形成轉(zhuǎn)化子，而共培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng)容易產(chǎn)生假陽(yáng)性[23]，同時(shí)也會(huì)由于轉(zhuǎn)化子太大使得轉(zhuǎn)化子不易分辨[17]。

已有研究表明，在一定的濃度范圍內(nèi)乙酰丁香酮（AS）的濃度與轉(zhuǎn)化效率呈正相關(guān)，但當(dāng)乙酰丁香酮濃度達(dá)到一定程度會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率[24]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，當(dāng)AS濃度高于200mmol/L時(shí)，隨著AS濃度增加，轉(zhuǎn)化效率下降，這與油菜黑脛病菌、葡萄灰葡萄孢等病原菌的轉(zhuǎn)化研究結(jié)果一致[25-26]。本研究還發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)時(shí)硝酸纖維膜的形狀對(duì)轉(zhuǎn)化效率也有較明顯的影響，用1 cm寬的條形硝酸纖維膜的轉(zhuǎn)化效率為用圓形硝酸纖維膜的近10倍，此前并未有關(guān)于硝酸纖維膜形狀對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響的報(bào)道，本研究中尖孢鐮刀菌B-9-1轉(zhuǎn)化子基本位于硝酸纖維膜邊緣，可能與孢子萌發(fā)后菌絲穿透力有限有關(guān)，靠近硝酸纖維膜邊緣較容易穿透，條形纖維膜增加了邊緣面積，轉(zhuǎn)化子數(shù)量增加，關(guān)于導(dǎo)致這一結(jié)果的具體原因還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的尖孢鐮刀菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，成功將攜帶和基因的T-DNA整合到尖孢鐮刀菌基因組中，轉(zhuǎn)化菌株中的GFP蛋白和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶可以正常表達(dá)，穩(wěn)定遺傳，為煙草鐮刀菌根腐病害主要病原尖孢鐮刀菌致病基因的篩選及其致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

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Construction of-mediated genetic transformation system of tobacco

LI Juan1,2, QIU Rui1*, ZHANG Yingying1, LI Xiaojie1, LI Chengjun1, LI Shujun1

1 Key Laboratory for Green Preservation & Control of Tobacco Diseases and Pests in Huanghuai Growing Area, Tobacco Research Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences, Xuchang 461000, China;2 Dingxi Plant Protection and Quarantine Station, Dingxi 743000, China

Tobacco root rot caused byis one of the main devastating diseases in tobacco (L.) production. Identifying the pathogenic genes of plant pathogen could provide new targets for disease accurate control. The objectives of this study are to construct a stable genetic transformation system ofby usingcarrying pCAM-GFP-hyg plasmid to transform the conidia of pathogenic(B-9-1), and obtain the transformant strains of B-9-1 with green fluorescent protein (GFP).(1) The optimal transformation system ofwas obtained under following condition: the optimal lethal concentration of hygromycin was 50mg/mL, co-culturing of the conidia suspension with a concentration of 106/mL (that obtained by shaking culture for 24 h) andwith an OD600value of 0.7 on co-IM agar containing 200mmol/L Acetosyringone under 25℃ for 48 h. (2) The T-DNA was successfully inserted into the genome of, which was capable of conducting stable genetic expression by subculturing, molecular analysis and fluorescence microscopic verification. (3) The results of Sourthern blot analysis further demonstrated that T-DNA was successfully integrated intogenome, and more than 60% was single copy insertion.-mediated genetic transformation of tobaccowas successfully established, which laid foundation for the study of pathogenic mechanism and analysis of pathogenic genes of tobacco.

tobacco; genetic transformation; transformant

Corresponding author. Email：qiurui19840414@hotmail.com

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基礎(chǔ)性科研工作項(xiàng)目“煙草尖孢鐮刀菌致病相關(guān)基因的篩選與功能研究”（2021ZC25）；河南省煙草公司科技項(xiàng)目“煙草根腐病害發(fā)生的微生物群落分析和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警研究”（2020410000270012）；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院優(yōu)秀青年科技基金計(jì)劃項(xiàng)目“煙草茄病鐮刀菌復(fù)合群系統(tǒng)發(fā)育與致病特性研究”（2022YQ09）；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)“煙草主要病蟲害綠色防控關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用”（2022TD26）。

李娟（1993—），助理研究員，主要從事煙草鐮刀菌根腐病綠色防控相關(guān)研究，Tel：0374-4518504，Email：2672717259@qq.com

通訊作者：邱睿（1984—），主要從事煙草鐮刀菌根腐病致病機(jī)理、監(jiān)測(cè)預(yù)警及綠色防控相關(guān)研究，Tel：0371-86538118，Email：qiurui19840414@hotmail.com

2022-01-06；

2022-05-26

李娟，邱睿，張盈盈，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的尖孢鐮刀菌遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2022，28（4）.LI Juan, QIU Rui, ZHANG Yingying, et al. Construction of agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation system of tobacco Fusarium oxysporum[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022,28(4). doi:10.16472/j.chinatobacco.2022.005