超高效合相色譜法分離和測定氟苯尼考對(duì)映體

張文華，王英，侯建波，陶紅霞，胡起立，王良莉，謝文，徐敦明

（1.杭州海關(guān)技術(shù)中心，浙江杭州 310016）（2.浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江杭州 310016） （3.廈門海關(guān)技術(shù)中心，福建廈門 361026）

氟苯尼考（Florfenicol，F(xiàn)F）又稱氟甲砜霉素，化學(xué)名稱為2,2-二氯-N-[(1R,2S)-3-氟-1-羥基-1-(4-甲基磺?；交?-2-丙基]乙酰胺，是一種常用的獸用抗生素[1]，抑菌效果好、抗菌譜廣、安全高效，常用于防治畜禽消化道和呼吸道細(xì)菌性感染病[2]。氟苯尼考結(jié)構(gòu)中存在兩個(gè)對(duì)映體：(-)-氟苯尼考（左旋體）、(+)-氟苯尼考（右旋體）（圖1）。研究發(fā)現(xiàn)，氟苯尼考外消旋體中不同結(jié)果對(duì)映體之間的生物活性差異較大，其中含有抗菌活性的對(duì)映體為(-)-氟苯尼考（左旋體），無抗菌活性的對(duì)映體為(+)-氟苯尼考（右旋體），氟苯尼考中左旋體的含量決定了氟苯尼考藥效的高低[3,4]。

氟苯尼考的檢測方法一般有酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[5]、分光光度法[6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[7,8]、高效液相色譜法（HPLC）[9,10]等，主要測定氟苯尼考外消旋體，未檢測其對(duì)映體，因而無法準(zhǔn)確測定氟苯尼考產(chǎn)品中活性成分左旋體的含量，不利于對(duì)藥品質(zhì)量和藥效的監(jiān)控。高效液相色譜法[3,4,11,12]為國內(nèi)外檢測氟苯尼考對(duì)映體的主要方法，該方法分離效果好，但有機(jī)試劑使用量大，檢測時(shí)間長。超高效合相色譜技術(shù)（UPC2）作為一種新型高效的色譜分離技術(shù)受到了廣泛的關(guān)注，該技術(shù)的主體流動(dòng)相為超臨界狀態(tài)CO2，可通過調(diào)整系統(tǒng)背壓、色譜柱溫度及有機(jī)溶劑的比例，使流動(dòng)相的密度和極性發(fā)生改變，從而達(dá)到精密控制目標(biāo)物分離效果的目的[13]，在手性分離的應(yīng)用中具有明顯優(yōu)勢[14-17]。目前，UPC2技術(shù)應(yīng)用于氟苯尼考對(duì)映體的分離及含量測定未見有報(bào)道。

本研究建立了一種超高效合相色譜法快速分離和測定氟苯尼考對(duì)映體的方法。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了氟苯尼考對(duì)映體的色譜分離條件，考察了兩種氟苯尼考對(duì)映體標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性，并對(duì)市售的常見氟苯尼考外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了分離及測定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

Waters超高效合相色譜儀（配有PDA檢測器），美國Waters公司，；JJ500電子天平，美國雙杰天平公司；AE260電子天平，瑞士Mettler公司；Synergy185超純水儀，美國Millipore公司；N-1210BV旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化公司；N-EVAPTM111氮吹儀，日本東京理化公司；WH-861渦旋混勻器，太倉市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

異丙醇、乙醇、甲醇、正庚烷、乙腈、甲酸（色譜純），德國Merck公司；氨水（分析純），萊陽市康德化工有限公司；CO2（99.999%）；水為超純水；其他實(shí)驗(yàn)所用試劑除特殊說明外均為分析純。

手性分離色譜柱：Acquity Trefoil AMY1 [150 mm×3.0 mm，2.5 μm，填料為直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)]、Acquity Trefoil CEL1 [150 mm×3.0 mm，2.5 μm，纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)]、Acquity Trefoil CEL2 [150 mm×3.0 mm，2.5 μm，填料為纖維素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)]，美國Waters公司。

氟苯尼考對(duì)映體標(biāo)準(zhǔn)品：(-)、(+)-氟苯尼考（純度>99.0%，中國牧工商總公司研究院）。測試樣品來源于3個(gè)不同廠家，樣品均用甲醇超聲溶解，以20%（V/V）異丙醇正庚烷混合溶液稀釋至相應(yīng)濃度。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及工作液的配制

1.2.1 外消旋體標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

準(zhǔn)確稱取各氟苯尼考外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g（精確至0.1 mg），用甲醇準(zhǔn)確定容至10 mL容量瓶中，配制成1.00 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃保存30 d。

氟苯尼考外消旋體的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：準(zhǔn)確吸取一定量的外消旋體標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用正庚烷稀釋至10.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，-18 ℃保存14 d。

1.2.2 對(duì)映體標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

分別準(zhǔn)確稱取(-)、(+)-氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g（精確至0.1 mg），用甲醇準(zhǔn)確定容至10 mL容量瓶中，配制成1.00 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃保存30 d。

兩種氟苯尼考對(duì)映體的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確移取(-)、(+)-氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用正庚烷溶液配制成4.00、8.00、10.00、20.00、40.00、400.00 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，-18 ℃保存14 d。

1.3 色譜條件

色譜柱：Acquity Trefoil CEL2（150 mm×3.0 mm，2.5 μm）；流動(dòng)相A為CO2，助溶劑B為甲醇；采用梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?～2 min（10% B），2.0～3.0 min（10%～20% B），3.0～6.0 min（20% B），6.0～6.1 min（20%～10% B），6.1～8.0 min（10% B）；系統(tǒng)背壓17.2 MPa；檢測波長224 nm；流速1.0 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5.0 μL。

1.4 梯度分離條件

A為CO2，B為甲醇：

梯度分離條件1：0～8.0 min（15% B）；

梯度分離條件2：0～2.0 min（10% B），2.0～3.0 min（10%～20% B），3.0～6.0 min（20% B），6.0～6.1 min（20%～10% B），6.1～8.0 min（10% B）；

梯度分離條件3：0～3.0 min（12% B），3.0～4.0 min（12%～20% B），4.0～6.0 min（20% B），6.0～6.1 min（20%～12% B），6.1～8.0 min（12% B）。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

經(jīng)過UPC2二極管檢測器（PDA）掃描后，在色譜圖中所提取氟苯尼考羅對(duì)映體的紫外光譜圖。結(jié)果表明，在202、224、265 nm處出現(xiàn)了較強(qiáng)的吸收峰（圖2），其中最強(qiáng)的吸收波長為224 nm，靈敏度相對(duì)較高，氟苯尼考對(duì)映體出峰處干擾峰較少。綜合考慮，對(duì)氟苯尼考藥品檢測而言，用雜質(zhì)較少且吸光度較高的224 nm波長檢測更具有優(yōu)勢，故本實(shí)驗(yàn)選擇224 nm作為檢測波長。

2.2 色譜柱的優(yōu)化

本研究中分離的兩種氟苯尼考對(duì)映體，因結(jié)構(gòu)相似度高，較難分離。因此，選擇沃特世3種相同規(guī)格且適用于手性分離的色譜柱CEL2、AMY1、CEL1，來考察不同色譜柱對(duì)兩種氟苯尼考對(duì)映體的分離效果。移取3份10.0 mg/L氟苯尼考對(duì)映體的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.50 mL至3個(gè)進(jìn)樣小瓶中，采用上述色譜條件進(jìn)行檢測。

結(jié)果表明，采用AMY1和CEL1手性色譜柱分離時(shí)，在色譜圖上只出現(xiàn)1個(gè)色譜峰，說明兩種氟苯尼考對(duì)映體在這兩款手性色譜柱上無法實(shí)現(xiàn)分離；而采用CEL2手性色譜柱分離時(shí)，兩種氟苯尼考分離度和色譜峰形良好（圖3）。ACQUITY UPC2Trefoil色譜柱是基于改性的多聚糖型固定相，能提供廣泛的手性選擇性。Trefoil CEL2、AMY1和CEL1鍵合相不同，選擇性彼此互補(bǔ)，為手性化合物的分離提供不同的保留特性。多糖類纖維素CEL2手性柱固定相具有高度有序的結(jié)構(gòu)，能形成許多手性的空腔，其拆分機(jī)理為氟苯尼考對(duì)映體的官能團(tuán)與固定相上的手性空腔相互作用，通過“三點(diǎn)作用”方式[18]進(jìn)行手性識(shí)別，兩個(gè)對(duì)映體與固定相的作用力有差異，使得保留時(shí)間不同。由于(-)-氟苯尼考對(duì)映體分子中的空間構(gòu)型與CEL2手性固定相分子中的位阻基團(tuán)之間產(chǎn)生了強(qiáng)烈的位阻作用，阻礙了手性識(shí)別所需的分子間作用力的形成，減弱了其在手性固定相上的有效吸附，故(-)-氟苯尼考對(duì)映體分子被流動(dòng)相優(yōu)先洗脫而先出峰；而(+)-氟苯尼考對(duì)映體分子的空間構(gòu)型無明顯的位阻效應(yīng)，對(duì)映體分子中的羥基易與固定相的酯基形成氫鍵作用力，從而有利于“三點(diǎn)作用”的形成，在色譜柱上不易被洗脫，保留時(shí)間延長，后出峰。因此本實(shí)驗(yàn)選擇CEL2色譜柱作為氟苯尼考的手性分離柱。

2.3 梯度分離條件的優(yōu)化

為了獲取最佳的梯度分離條件，實(shí)驗(yàn)選擇流動(dòng)相為CO2（A）-甲醇（B），考察了“1.4”節(jié)中不同梯度分離條件對(duì)兩種氟苯尼考對(duì)映體分離效果的影響。由圖4可見，相比梯度1的分離條件，采用梯度2和梯度3的分離條件，兩種氟苯尼考對(duì)映體的色譜峰形更尖銳，但梯度2的分離度更好，達(dá)到1.68，故本實(shí)驗(yàn)采用梯度條件2。

2.4 流動(dòng)相中助溶劑的選擇

超高效合相色譜儀的有機(jī)溶劑使用量少，主要采用超臨界CO2作為流動(dòng)相，通過在助溶劑中加入少量有機(jī)溶劑來加強(qiáng)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫能力和選擇性。實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、0.5%（V/V）甲酸甲醇溶液、0.5%（V/V）氨水甲醇溶液等不同助溶劑對(duì)兩種氟苯尼考對(duì)映體分離的影響。如圖5所示，當(dāng)采用0.5%（V/V）甲酸甲醇溶液作為助溶劑時(shí)，色譜圖基線抬高，未出現(xiàn)目標(biāo)峰；當(dāng)采用0.5%（V/V）氨水甲醇溶液和甲醇作為助溶劑時(shí)，目標(biāo)物的色譜峰的峰形尖銳，且甲醇作為助溶劑時(shí)，兩種氟苯尼考對(duì)映體的分離度更好，達(dá)到1.69。因此，本實(shí)驗(yàn)室選擇甲醇作為助溶劑。

2.5 系統(tǒng)背壓的優(yōu)化

UPC2采用超臨界狀態(tài)的CO2作為流動(dòng)相，實(shí)驗(yàn)過程中通過控制系統(tǒng)背壓可有效改變流動(dòng)相的粘度和密度，從而調(diào)節(jié)流動(dòng)相的溶解能力和洗脫能力。流動(dòng)相的粘度和密度會(huì)隨著系統(tǒng)背壓的升高而增加。由于CO2的壓力超過7.38 MPa且溫度超過31 ℃以上，CO2才會(huì)進(jìn)入超臨界狀態(tài)。因此本實(shí)驗(yàn)以甲醇作為助溶劑，在柱溫40 ℃條件下，考察了10.3、13.8、17.2、20.7、24.1 MPa 4種系統(tǒng)背壓對(duì)目標(biāo)物峰形和分離度的影響。當(dāng)實(shí)驗(yàn)逐漸提高系統(tǒng)背壓，目標(biāo)物的保留時(shí)間提前，峰形變得更尖銳（圖6）。4種條件下，兩種氟苯尼考對(duì)映體在系統(tǒng)背壓17.2 MPa時(shí)色譜峰形和分離度均達(dá)到最佳。綜合考慮色譜峰形、分離度及系統(tǒng)壓力，最終選擇17.2 MPa為最佳系統(tǒng)背壓。

2.6 色譜柱溫的優(yōu)化

在UPC2系統(tǒng)中，色譜柱溫度主要通過影響超臨界狀態(tài)CO2流動(dòng)相的密度來影響對(duì)目標(biāo)物的分離效果。實(shí)驗(yàn)升高色譜柱溫度，流動(dòng)相的粘度逐漸降低，密度減小，對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫能力也隨之減弱，保留時(shí)間延長。鑒于Acquity Trefoil CEL2手性色譜柱的運(yùn)行最高溫度為40 ℃，CO2的溫度大于31 ℃且壓力高于7.38 MPa，CO2才會(huì)進(jìn)入超臨界CO2狀態(tài)。因此本實(shí)驗(yàn)考察了色譜柱溫在31～40 ℃范圍內(nèi)對(duì)目標(biāo)化合物色譜峰形和分離度的影響。結(jié)果表明，隨著溫度的升高，兩種氟苯尼考對(duì)映體的保留時(shí)間逐漸增加（圖7）。當(dāng)柱溫為31 ℃時(shí)，色譜圖基線不平，兩種氟苯尼考對(duì)映體的分離度為1.2；當(dāng)色譜柱溫為35 ℃和40 ℃時(shí)，兩種氟苯尼考對(duì)映體的分離度分別為1.70和1.69，在6.0 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)良好的基線分離。相比35 ℃，在40 ℃的柱溫條件下，色譜峰更尖銳。因此，最終選擇色譜柱溫度為40 ℃。

2.7 定容試劑的優(yōu)化

在樣品測定的過程中，定容試劑的選擇會(huì)對(duì)目標(biāo)化合物色譜峰的靈敏度和峰形產(chǎn)生較大的影響。因此 本實(shí)驗(yàn)考察5種常用定容試劑甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、正庚烷對(duì)氟苯尼考對(duì)映體色譜峰形的影響（圖8）。結(jié)果表明，當(dāng)用乙醇和乙腈作為定容試劑時(shí)，兩個(gè)氟苯尼考色譜峰未完全分離，峰形較差；當(dāng)用甲醇、異丙醇和正庚烷作為定容試劑時(shí)，兩種氟苯尼考對(duì)映體的色譜峰均在6.0 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了完全分離，但相比甲醇、異丙醇3種定容試劑，正庚烷作為定容試劑時(shí)，目標(biāo)物的色譜峰形變得尖銳，且分離度為1.65。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇正庚烷作為定容試劑。

2.8 標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性

化合物的穩(wěn)定性是保障整個(gè)實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果準(zhǔn)確的前提，因此本文以新配制氟苯尼考對(duì)映體標(biāo)準(zhǔn)溶液為基準(zhǔn)，計(jì)算儲(chǔ)存不同時(shí)間的氟苯尼考對(duì)映體的含量，來考察氟苯尼考對(duì)映體標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性。分別精確移取1.00 mL的10.00 mg/L氟苯尼考對(duì)映體的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液于7個(gè)1.5 mL UPC2專用進(jìn)樣小瓶中，上機(jī)進(jìn)行含量測定，檢測完成后再轉(zhuǎn)移至7個(gè)密封性良好的進(jìn)樣小瓶中，并用封口膜封好后于-18 ℃下保存放置。按照上述優(yōu)化后的色譜條件測定新配制的與分別儲(chǔ)存1、3、5、7、14、30、60 d的氟苯尼考對(duì)映體標(biāo)準(zhǔn)溶液，14 d內(nèi)(-)-氟苯尼考、(+)-氟苯尼考含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為4.0%、2.1%，30 d內(nèi)(-)-氟苯尼考、(+)-氟苯尼考含量的RSD分別為10.2%、12.1%。采用T檢驗(yàn)法比較新配制與儲(chǔ)存不同天數(shù)的氟苯尼考對(duì)映體含量是否存在顯著性差異。結(jié)果表明，兩種氟苯尼考對(duì)映體-18 ℃下放置14 d時(shí)p>0.05，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異，表現(xiàn)良好的穩(wěn)定性；-18 ℃下放置30 d時(shí)p<0.05，說明兩種氟苯尼考對(duì)映體在30 d時(shí)具有顯著性差異。因此，兩種氟苯尼考對(duì)映體標(biāo)準(zhǔn)溶液在-18 ℃條件下可保存14 d。

2.9 方法學(xué)考察

2.9.1 線性范圍和靈敏度

選擇“1.2.2節(jié)”中的4.00、8.00、10.00、20.00、40.00、400.00 mg/L的氟苯尼考對(duì)映體系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)行測定，以對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)（Y），標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，如表1所示。同時(shí)以3倍信噪比計(jì)算儀器的檢出限（LOD，S/N=3），結(jié)果表明，兩種氟苯尼考對(duì)映體的儀器檢出限（LOD）為2.00 mg/L，在表1所列的線性范圍內(nèi)，線性良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.9993。

表1 各個(gè)化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限 Table 1 Linear range, linear equation, correlation coefficient (r2) and limit of detection (LOD) of each compound

2.9.2 精密度

在優(yōu)化后的色譜條件下，“1.2.2”中的10.0 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次上機(jī)測定，記錄兩種目標(biāo)化合物的色譜峰面積，計(jì)算各物質(zhì)對(duì)應(yīng)峰面積的RSD，分別為0.65%和0.81%，表明該方法的精密度良好，符合GB/T 32465-2015[19]的要求，能夠滿足氟苯尼考對(duì)映體的分離和測定要求。

2.10 方法的應(yīng)用

在優(yōu)化的條件下，應(yīng)用本方法分別測定3份市售常見氟苯尼考粉中(-)、(+)-氟苯尼考的含量，采用“2.9.1”所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線以外標(biāo)定量法計(jì)算氟苯尼考粉中(-)、(+)氟苯尼考對(duì)映體的含量。結(jié)果表明，3份氟苯尼考粉中均未檢出(+)-氟苯尼考，均只檢出(-)-氟苯尼考，含量達(dá)到標(biāo)簽值的80%以上，樣品純度與文獻(xiàn)[3,11]報(bào)道采用HPLC法測試氟苯尼考樣品的純度相符。但目前文獻(xiàn)[3,4,11]所報(bào)道HPLC方法的檢測時(shí)長達(dá)到10 min以上，而本方法在6.0 min內(nèi)完成了兩個(gè)氟苯尼考對(duì)映體的分離及含量測定，相比而言，本方法的檢測時(shí)間更短，分離度更高、有機(jī)試劑使用量更少。

3 結(jié)論

本文采用UPC2對(duì)氟苯尼考對(duì)映體進(jìn)行分離，考察了氟苯尼考檢測波長和儲(chǔ)存穩(wěn)定性，同時(shí)還考察了手性色譜柱、梯度分離條件、助溶劑、系統(tǒng)背壓、柱溫、定容試劑對(duì)氟苯尼考對(duì)映體分離的影響。最佳色譜條件為：手性色譜柱Acquity Trefoil CEL2（150 mm×3.0 mm，2.5 μm），助溶劑甲醇，流速1.0 mL/min，檢測波長224 nm，柱溫40 ℃，系統(tǒng)背壓17.2 MPa。在6.0 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)兩種氟苯尼考對(duì)映體的分離。該方法分離效果好、檢測時(shí)間短、穩(wěn)定性良好，為氟苯尼考對(duì)映體的精確測定提供了一種新方法。