HPLC 法測(cè)定婦康樂顆粒中延胡索乙素的含量

易徐航，張鈺祺，楊恢檢，熊毓，周璇，陳雅靜

萍鄉(xiāng)市食品藥品檢驗(yàn)所，江西 萍鄉(xiāng) 337000

婦康樂顆粒為萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院的醫(yī)院制劑，由延胡索、澤蘭、香附、夏枯草、當(dāng)歸、白花蛇舌草、魚腥草等7 味中藥組成。具有清熱解毒，利濕止帶之功效，主治盆腔炎（附件炎）所致黃帶、下腹痛等。延胡索為罌粟科植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang 的干燥塊莖，具有活血，行氣，止痛之功效。常用于胸脅、脘腹疼痛，經(jīng)閉痛經(jīng)，產(chǎn)后瘀阻，跌撲腫痛［1］，其主要藥效成分為延胡索乙素［2-6］。研究表明，延胡索乙素具有鎮(zhèn)痛、保護(hù)心肌等作用［6-10］。處方中延胡索作為其中君藥之一，其品質(zhì)將直接影響到婦康樂顆粒制劑的臨床療效。因此，為更好地對(duì)婦康樂顆粒中延胡索進(jìn)行內(nèi)在質(zhì)量的控制，本研究以延胡索乙素作為考察指標(biāo)，采用HPLC 法建立了婦康樂顆粒中延胡索乙素的含量測(cè)定方法，以期為婦康樂顆粒的內(nèi)在質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

對(duì)照品：延胡索乙素（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110726-202020，含量以99.3%計(jì)）；試劑：甲醇、乙腈（HPLC 級(jí)，北京百靈威公司）；其他試劑均為AR 級(jí)；水為屈臣氏蒸餾水；婦康樂顆粒（規(guī)格10 g/袋）由萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院提供。

1.2 儀器

高效液相色譜儀（美國Agilent 公司，型號(hào)1200）；萬分之一天平（瑞士Mettler 公司，型號(hào)ME-204）；十萬分之一天平（德國Satorius 公司，型號(hào)CP225D）；酸度計(jì)（德國Satorius 公司，型號(hào)PB-10）；超聲儀（江蘇昆山舒美公司，型號(hào)KQ-500VDE）。

2 方法及結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備精密稱取延胡索乙素對(duì)照品9.75 mg 置100 mL 量瓶中，加入甲醇-濃氨試液（20∶1）混合溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL 含0.096 8 mg 的儲(chǔ)備溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備取5 袋內(nèi)容物置研缽中研細(xì)，稱取約10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-濃氨試液（20∶1）混合溶液25 mL，稱定重量，超聲處理（500 W，45 kHz）30 min，放冷至室溫，再稱定重量，用甲醇-濃氨試液（20∶1）混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備取澤蘭100 g、香附150 g、夏枯草200 g、當(dāng)歸150 g、白花蛇舌草300 g、魚腥草300 g 加水煎煮二次，第一次2 h，第二次1 h，合并煎煮液，濾過，在60 ℃下濃縮煎液至相對(duì)密度約為1.15～1.18，加入乙醇使含醇量約為60%，放置48 h，上清液回收乙醇，得相對(duì)密度為1.13～1.17（60 ℃）的清膏，加入適量的輔料（糊精和蔗糖），制成陰性樣品顆粒，60 ℃以下干燥，制成1 000 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法操作，制成缺延胡索藥材的婦康樂顆粒陰性樣品溶液，依法測(cè)定，結(jié)果表明：陰性樣品的HPLC 圖譜中，未出現(xiàn)與對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰，見圖1。

2.2 色譜條件

色譜柱為Agilent 5 TC -C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以0.6%冰醋酸溶液（三乙胺調(diào)整pH值為6.0）為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B。梯度洗脫（0～20 min，57% A；20～22 min，57% A →20% A；22～25 min，20% A →57% A；25～35 min，57% A）。檢測(cè)流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果顯示，對(duì)照品與其他組分的色譜峰分離度良好。對(duì)照品、供試品、陰性樣品色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖：A.延胡索乙素對(duì)照品；B.供試品；C.陰性樣品

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察精密量取“2.1.1”對(duì)照品儲(chǔ)備液，加甲醇-濃氨試液（20∶1）混合溶液逐級(jí)稀釋得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，含延胡索乙素分別為6.052，12.105，24.209，48.419，96.837 mg/L。按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，得線性方程：Y=17.961 2X+0.750 4，r=0.999 9。結(jié)果表明對(duì)照品進(jìn)樣濃度在6.052～96.837 mg/L 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液（24.209 mg/L）10 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 針，記錄對(duì)照品的峰面積，其RSD 為0.8%。結(jié)果表明精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一批次（批號(hào)20210412）的樣品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、10 h、12 h精密吸取10 μL 進(jìn)樣，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，記錄峰面積，結(jié)果RSD 為0.8%。結(jié)果表明在室溫下婦康樂顆粒供試品溶液12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次（批號(hào)20210412）樣品6 份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備重復(fù)性試驗(yàn)供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算延胡索乙素的含量（mg/g）。結(jié)果RSD 為1.6%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn)取已知含量（0.060 2 mg/g）的婦康樂顆粒樣品，置研缽中研細(xì)，稱取約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入適量對(duì)照儲(chǔ)備液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定含量，測(cè)定加樣回收率，結(jié)果表明延胡索乙素的平均回收率為98.7%，RSD 為2.7%，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)

2.3.6 耐用性試驗(yàn)取同一批次（批號(hào)20210412）樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，分別采用Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），Sepax Amethyst C18-H（250 mm×4.6 mm，5 μm），Welch Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3 種品牌的色譜柱進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 樣品測(cè)定

取不同批號(hào)婦康樂顆粒樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試液。按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣和分析，結(jié)果見表2。

表2 婦康樂顆粒樣品中延胡索含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

采用DAD 檢測(cè)器對(duì)延胡索乙素對(duì)照品在210～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯示最大吸收波長(zhǎng)為280 nm，故選擇280 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。在流動(dòng)相的選擇中，由于婦康樂顆粒中含七味中藥，成分復(fù)雜，參考《中國藥典》2020 年版一部延胡索含量測(cè)定項(xiàng)下流動(dòng)相0.1%磷酸（三乙胺調(diào)整pH 值為6.0）-甲醇（45∶55），結(jié)果延胡索乙素的分離度達(dá)不到要求。通過對(duì)甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸（三乙胺調(diào)整pH 值為6.0），0.6%冰醋酸溶液（三乙胺調(diào)整pH 值為6.0）-乙腈系統(tǒng)梯度洗脫進(jìn)行比較，結(jié)果0.6%冰醋酸溶液（三乙胺調(diào)整pH 值為6.0）-乙腈梯度洗脫條件下分離效果最好，峰形最佳，故選擇0.6%冰醋酸溶液（三乙胺調(diào)整pH 值為6.0）-乙腈為流動(dòng)相。

3.2 提取方法及時(shí)間的考察

提取條件采用超聲提取法分別考察了甲醇、50%甲醇、甲醇-濃氨試液（20∶1）混合溶液作為提取溶劑［11-12］，結(jié)果表明甲醇-濃氨（20∶1）提取方式最佳。在此基礎(chǔ)上，分別考察了超聲和回流2 種提取方式，結(jié)果超聲與回流提取效率相似，故選用操作簡(jiǎn)便的超聲提取方式。同時(shí)對(duì)甲醇-濃氨試液（20∶1）混合溶液用量10 mL、25 mL、50 mL 以及超聲處理時(shí)間15 min、30 min、1 h 進(jìn)行考察，最后確定采用甲醇-濃氨試液（20∶1）混合溶液25 mL 超聲處理（500 W，45 kHz）30 min 為宜。

3.3 小結(jié)

本研究建立了婦康樂顆粒中延胡索乙素的含量測(cè)定方法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法準(zhǔn)確、快速，操作簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好。從5 批婦康樂顆粒樣品中延胡索的含量測(cè)定結(jié)果來看，延胡索乙素的含量為0.055 1 mg/g～0.119 0 mg/g，可用于婦康樂顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)。