艾芬地爾對腦缺血再灌注大鼠腦細胞NR2B亞基表達的影響及腦保護作用

李振宇，王天棟，李作鵬，張 金

急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)是人類致殘、致死的主要病因之一。隨著醫(yī)療技術的進步，靜脈溶栓與機械取栓已廣泛應用于臨床，腦血流再通率顯著提高[1]。研究顯示，靜脈溶栓橋接機械取栓腦血管再通率可達88%[2]。然而，血流再通后所致的缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)可加重神經(jīng)細胞壞死[3]。所以，再灌注后的神經(jīng)保護非常關鍵。

NR2B為N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)的亞基之一，此亞基通常表達于海馬、丘腦與前腦皮層等區(qū)域的神經(jīng)細胞突觸外細胞膜。正常情況下，此亞基會結合谷氨酸(glutamate，Glu)，使NMDAR活化，從而使神經(jīng)細胞得以維持正常機能。若出現(xiàn)腦缺血與再灌注，Glu過量積聚使NMDAR過表達，從而引起一系列致細胞壞死或凋亡過程即興奮性氨基酸(excitatory amino acid，EAA)毒性作用[4]。艾芬地爾(Ifenprodil)是一類高選擇性NMDAR阻滯劑，對過度激活的NMDAR具有抑制作用，使其生成的興奮性毒性下降，釋放神經(jīng)保護效能[5]。本研究探討艾芬地爾對腦缺血再灌注后各階段NR2B亞基表達狀況的影響與腦保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠67只，9～11周齡，體質量250～310 g，由山西醫(yī)科大學動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK(晉)2019-0004。于屏蔽環(huán)境實驗室進行實驗，濕度40%～55%，溫度22～26 ℃，明暗光照12 h/12 h。

1.2 實驗試劑及材料 ①艾芬地爾(上海陶素公司生產(chǎn))，將25 mg 艾芬地爾溶于0.1 L生理鹽水中制成艾芬地爾溶液；②兔抗大鼠NMDAR-NR2B多抗由北京博奧森公司生產(chǎn)；③SABC-POD[兔免疫球蛋白G(IgG)]試劑盒(即用型)、羊抗兔IgG(由生物素標記)由武漢博士德公司生產(chǎn)；④2，3，5氯化三苯基四氮唑(TTC)(北京索萊寶公司生產(chǎn))，將5 g TTC溶于250 mL的0.4%磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中得到2%的TTC溶液；⑤魚線(威海漢鼎魚具公司生產(chǎn)，規(guī)格：0.26 mm)，將0.26 mm型號魚線制成4.5 cm長，分別于2 cm、3 cm處做標記，頭端加熱至尖端圓潤，并涂以硅膠，風干24 h備用。

1.3 實驗分組 采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術組、艾芬地爾 1 h組、艾芬地爾 2 h組、艾芬地爾 3 h組、對照1 h組、對照2 h組、對照3 h組。除假手術組7只大鼠外，剩余每組10只大鼠。若造模未成功，則補齊各組數(shù)量。

1.4 模型制備及給藥 把大鼠置于屏蔽實驗室內，適應性飼養(yǎng)5～7 d。建模前1 d禁食，無需禁水。借助線栓法完成大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型的構建：稱重后用10%的水合氯醛30 mg/100 g腹腔麻醉。切開頸中線偏左3 mm區(qū)域皮膚，分離筋膜及肌肉，暴露迷走神經(jīng)、頸總動脈(CCA)及分支血管，在頸總動脈近心端(距分叉部位約1.2 cm處)用3-0號線進行結扎，CCA遠心端、頸外動脈(ECA)近心端分別備一縫合線，借助顯微血管夾將頸內動脈(ICA)血流阻斷，在CCA(距分叉部位約1 cm處)剪一切口，通過切口把線栓插至ICA血管夾部位，結扎CCA備線，將顯微血管夾打開，順勢緩慢勻速送入線栓，到達大腦中動脈處可感受到阻力，插入深度為(18.5±0.5)mm。艾芬地爾 1 h、艾芬地爾2 h、艾芬地爾3 h組動物再灌注0.5 h前[6]均腹腔注入2 mg/kg 艾芬地爾，對照組注入等量生理鹽水，假手術組不進行處理；再灌注時剪開ECA及CCA遠心端結扎線栓，在CCA遠心端再次打1個松結，待撤出線栓，馬上扎緊松結；縫合皮膚；假手術組則分離CCA與分支血管，只需對CCA進行結扎。

1.5 檢測方法

1.5.1 神經(jīng)功能缺損評分 參照Chang等[7]的評估標準對大鼠缺血再灌注損傷后1 d的神經(jīng)功能缺損情況進行評分。其中，未見癥狀計0分；軀干向栓塞對側彎曲、栓塞對側前肢屈曲計1分；能夠向兩側行走，將尾部提起使其懸空，可朝栓塞對側打轉計2分；向栓塞對側行走劃圈計3分；行走費力或無法行走計4分。將得分1～4分的動物作為入組對象，剔除昏迷大鼠。

1.5.2 梗死體積測定 缺血再灌注1 d后，隨機從艾芬地爾 1 h組、艾芬地爾 2 h組、艾芬地爾 3 h組、對照1 h組、對照2 h組、對照3 h組中選取4只大鼠，10%的水合氯醛麻醉后斷頭法處死，取出腦部組織，用生理鹽水沖洗后立即置入-20 ℃冰箱15～20 min，以2.5 mm為厚度冠狀切腦組織，共計5片。將腦組織切片放入2%的TTC溶液中，37 ℃避光孵育40 min(每10 min翻面1次)后攝像，采用Image Pro-Plus 6.0軟件計算梗死區(qū)體積。

1.5.3 免疫組織化學染色法檢測NR2B亞基表達 制作腦組織石蠟切片并進行免疫組織化學染色(immunohistochemistry，IHC)：脫蠟；內源性過氧化物酶(PO)滅活；抗原修復；封閉；一抗孵育，滴加稀釋比為1∶100的一抗，4 ℃下作用10～12 h，37 ℃復溫0.5 h，PBS溶液(酸堿度7.2～7.6)沖洗3遍，每遍5 min；二抗孵育，滴加羊抗兔IgG，37 ℃下孵育0.5 h后PBS溶液(酸堿度7.2～7.6)沖洗3遍，每遍5 min；SABC孵育；顯色；復染；封片。置高倍顯微鏡下觀察結果并拍照，采用Image Pro-Plus 6.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結 果

2.1 各組神經(jīng)功能缺損評分比較 假手術組未見神經(jīng)功能缺損為0分。艾芬地爾 1 h組神經(jīng)功能缺損評分低于對照1 h組，艾芬地爾 2 h組神經(jīng)功能缺損評分低于對照2 h組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；艾芬地爾3 h組與對照3 h組神經(jīng)功能缺損評分比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。說明早期應用艾芬地爾可使腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能缺損得到明顯改善。詳見表1。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評分比較(±s) 單位：分

2.2 各組腦梗死體積比較 假手術組未見梗死病灶。艾芬地爾 1 h組腦梗死體積小于對照1 h組、艾芬地爾 2 h組腦梗死體積小于對照2 h組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；艾芬地爾3 h組與對照3 h組腦梗死體積比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表2、圖1。

表2 各組腦梗死體積比較(±s) 單位：%

圖1 各組腦梗死情況

2.3 各組NR2B亞基陽性表達比較 各組動物額葉皮層細胞漿、細胞膜中均可見NR2B亞基表達。艾芬地爾1 h組、艾芬地爾2 h組、艾芬地爾3 h組NR2B亞基表達呈上升趨勢，各組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；對照1 h組、對照2 h組、對照3 h組NR2B亞基表達呈上升趨勢，各組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與假手術組比較，對照1 h組與艾芬地爾 1 h組NR2B亞基表達水平較低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；對照3 h組NR2B亞基表達水平較高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。艾芬地爾 1 h組比對照1 h組NR2B亞基表達水平低、艾芬地爾 2 h組比對照2 h組NR2B亞基表達水平低、艾芬地爾 3 h組比對照3 h組NR2B亞基表達水平低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表3、圖2。

表3 各組NR2B亞基陽性表達比較(±s)

圖2 各組NR2B亞基陽性表達免疫組化染色(×400)

3 討 論

在醫(yī)療技術發(fā)展下，急性缺血性腦卒中血管再通率大幅提升。然而，缺血再灌注損傷卻會使腦組織遭受第二次打擊。在當前治療腦缺血方面，最優(yōu)方案為腦血流再通和神經(jīng)保護的聯(lián)合[8]。缺血后NMDAR介導的興奮性氨基酸(EAA)毒性效應是細胞凋亡、壞死的關鍵因素[9]。缺血后腦細胞功能受損導致大量谷氨酸在細胞周圍蓄積，使NMDAR過度活化，引起毒性效應。NMDAR在神經(jīng)元促生存和促死亡信號通路中有雙重作用，非選擇性拮抗NMDAR，不僅能使生存信號途徑受抑，還可使神經(jīng)細胞受損，引發(fā)重度不良反應[10]。因此，更好的選擇是單獨阻斷NMDAR的促死亡效應，而保留促生存通路[11]。實驗證實，由NMDAR引起的興奮性毒性作用主要由含NR2B亞基的NMDAR過度激活導致[12]，此類受體活化會導致細胞內鈣超載，鈣離子大量蓄積，激活一氧化氮合酶、磷脂酶A2、核酸內切酶，損傷細胞。此外，NR2B亞基同時能夠使下游促死亡信號途徑活化，造成細胞凋亡[13]。故選擇性NR2B受體拮抗劑是副作用更小、更有效的神經(jīng)保護藥物。

艾芬地爾屬于選擇性NR2B受體拮抗劑，其分子量達400.49，能夠與NR2B亞基上多胺位點結合，抑制后者的變構調節(jié)作用，從而削弱NMDAR(內含NR2B亞基)活性[14-15]。研究顯示，艾芬地爾可使腦缺血損傷中EAA毒性效應減弱、減小梗死體積、緩解腦水腫，發(fā)揮腦保護效能[16-17]。但是，Araki等[17]研究大鼠全腦缺血模型的結果顯示，艾芬地爾無腦保護功能。故艾芬地爾治療腦缺血損傷的結果缺乏統(tǒng)一性，其腦保護功能尚需通過更為廣泛的研究來明確。雖然艾芬地爾作為神經(jīng)保護藥物仍存在爭議，但既往發(fā)表的文章多應用在永久性缺血模型，缺血再灌注后的意義仍有待評估，且具體的作用機制不是很明確，因此，本研究探討了艾芬地爾在缺血再灌注大鼠模型中對NR2B亞基表達研究。

研究顯示，興奮性氨基酸Glu在損傷后立即觸發(fā)興奮性毒性，但在損傷后不久則開始促進神經(jīng)修復，與其興奮毒性作用相比，Glu介導的神經(jīng)保護作用更為持久[18]。研究發(fā)現(xiàn)，既往發(fā)表的研究中病人入組的時間較長，缺血半暗帶幾乎消失，常導致陰性結果或顯示出過多的副作用[19]。本研究結果顯示，大鼠腦缺血后神經(jīng)機能明顯受損，分別對比艾芬地爾 1 h組、艾芬地爾 2 h組和對照1 h組、對照2 h組發(fā)現(xiàn)，大鼠神經(jīng)缺損評分減少、梗死體積減小，但對比艾芬地爾 3 h組、對照3 h組發(fā)現(xiàn)神經(jīng)功能缺損評分、梗死體積皆未見明顯不同，可見艾芬地爾可于腦缺血早期再灌注后抑制神經(jīng)功能損傷，減小腦梗死體積，若梗死時間較長，則對神經(jīng)功能缺損與梗死體積無幫助。

Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，鞘內注射艾芬地爾能夠使大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)壓迫模型內脊髓NR2B亞基表達量大幅下調，故判斷艾芬地爾除了可阻斷腦神經(jīng)細胞NR2B亞基，還可能對NR2B亞基表達具有抑制作用；該研究還發(fā)現(xiàn)，艾芬地爾能夠于缺血早期(2 h內)再灌注后下調NR2B表達，產(chǎn)生腦保護效能，在缺血時間增加的情況下，其雖然能夠繼續(xù)抑制NR2B表達，卻未見腦保護效能[21]。本研究結果顯示，對照1 h組與假手術組比較，再灌注后NR2B亞基明顯減少，此結果在艾芬地爾組更具顯著性，在NR2B亞基表達上，對照3 h組較假手術組偏高，判斷腦缺血早期血管再通后艾芬地爾的應用可能會改善預后。

綜上所述，艾芬地爾能夠于腦缺血初期再灌注后改善缺血再灌注損傷。艾芬地爾不僅對NR2B受體具有拮抗作用，還能夠在腦缺血早期下調NR2B受體表達，從而削弱此亞基介導的興奮性氨基酸毒性效應，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。但其具體作用機制尚需通過更為深入的研究來明確。