丹蔞片改善大鼠急性心肌缺血的作用研究

譚亞芳，潘詩(shī)婷，祁建勇，張敏州

心肌缺血是常見的心血管疾病，預(yù)防和治療心肌缺血已成為研究熱點(diǎn)。中醫(yī)理論認(rèn)為氣虛血瘀是心肌缺血的病機(jī)。丹萎片秉承痰瘀同治法，具有通陽(yáng)散結(jié)、行氣祛痰的功效，可用于改善冠心病心絞痛痰瘀互結(jié)型病人的臨床癥狀[1-3]、減少心肌細(xì)胞凋亡[4]、改善心室重構(gòu)[5]、調(diào)節(jié)心律失常[6]、改善血脂紊亂等[7]，對(duì)心肌缺血具有保護(hù)作用[8]。本研究建立大鼠急性心肌缺血模型[9]，探討丹蔞片對(duì)心肌缺血的保護(hù)作用機(jī)制，闡明丹蔞片改善心肌缺血的優(yōu)勢(shì)和作用靶點(diǎn)，為防治心肌梗死和再灌注損傷提供方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性健康SD大鼠190只，8～10周齡，體質(zhì)量(230±20)g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于廣東省中醫(yī)院無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SYXK(粵)2018-0094。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及飼養(yǎng)方案均遵照中華人民共和國(guó)動(dòng)物處理?xiàng)l例(條例號(hào)：552001)，且所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在廣東省中醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)允許下進(jìn)行。

1.2 藥物、試劑和儀器 丹蔞片超微粉(吉林康乃爾公司生產(chǎn))；異丙腎上腺素(SIGMA公司生產(chǎn))，美托洛爾(SIGMA公司生產(chǎn))，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制劑PD98059(CST公司生產(chǎn))，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制劑LY294002(CST公司生產(chǎn))，鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶(CaMK)抑制劑KN93(CST公司生產(chǎn))，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)抑制劑L-NAME(CST公司生產(chǎn))；7180全自動(dòng)生化分析儀，Cobas e601電化學(xué)發(fā)光分析儀。

1.3 動(dòng)物模型的建立和給藥 參考文獻(xiàn)方法及本實(shí)驗(yàn)室既往研究基礎(chǔ)制定手術(shù)方案，連續(xù)兩天皮下注射異丙腎上腺素85 mg/kg構(gòu)建大鼠急性心肌缺血模型[10]。

1.3.1 現(xiàn)象實(shí)驗(yàn) 選取SD大鼠40只，隨機(jī)分為對(duì)照組、異丙腎上腺素組、丹蔞片1 000 mg/kg組、美托洛爾組，每組10只，給藥2 d，具體給藥方法見表1。

表1 現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)各組給藥方法

1.3.2 量效實(shí)驗(yàn) 選取SD大鼠80只，隨機(jī)分為生理鹽水組、異丙腎上腺素組、美托洛爾組、丹蔞片5 mg/kg組、丹蔞片50 mg/kg組、丹蔞片100 mg/kg組、丹蔞片500 mg/kg組、丹蔞片5 000 mg/kg組，每組10只，給藥2 d，具體給藥方法見表2。

表2 量效實(shí)驗(yàn)各組給藥方法

1.3.3 機(jī)制實(shí)驗(yàn) 選取SD大鼠60只，隨機(jī)分為異丙腎上腺素組、丹蔞片組、PD98059組、LY294002組、KN93組、L-NAME組，每組10只，給藥2 d，具體給藥方法見表3。

表3 機(jī)制實(shí)驗(yàn)各組給藥方法

1.4 檢測(cè)指標(biāo) 大鼠血液的心肌酶5項(xiàng)及肌鈣蛋白：由廣東省中醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院檢驗(yàn)科收取樣本，7180全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、α-羥丁酸脫氫酶(α-BDH)；采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)肌鈣蛋白T(cTnT)。

2 結(jié) 果

2.1 現(xiàn)象實(shí)驗(yàn) 與對(duì)照組比較，給藥后異丙腎上腺素組AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBD、cTnT水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與異丙腎上腺素組比較，丹蔞片1 000 mg/kg組和美托洛爾組給藥后AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBD、cTnT水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)血液檢測(cè)指標(biāo)(±s)

2.2 量效實(shí)驗(yàn) 與對(duì)照組比較，異丙腎上腺素組給藥后AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBD、cTnT水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與異丙腎上腺素組比較,美托洛爾組、丹蔞片5 mg/kg組、丹蔞片50 mg/kg組、丹蔞片100 mg/kg組、丹蔞片500 mg/kg組、丹蔞片5 000 mg/kg組給藥后AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBD、cTnT水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中，不同丹蔞片給藥劑量組AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBD、cTnT水平下降幅度不同，且丹蔞片100 mg/kg組各指標(biāo)下降幅度最大。詳見表5。

表5 量效實(shí)驗(yàn)血液檢測(cè)指標(biāo)(±s)

2.3 機(jī)制實(shí)驗(yàn) 與對(duì)照組比較，異丙腎上腺素組給藥后AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBD、cTnT水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與異丙腎上腺素組比較，丹蔞片組、PD98059組、LY294002組、L-NAME組、KN93組給藥后心肌酶AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBD、cTnT水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表6。

表6 機(jī)制實(shí)驗(yàn)血液檢測(cè)指標(biāo)(±s)

3 討 論

心肌缺血是指心臟的血液灌注減少，導(dǎo)致心臟的供氧減少，不能支持心臟正常工作的一種病理狀態(tài)。血壓降低、主動(dòng)脈供血減少、冠狀動(dòng)脈阻塞可直接導(dǎo)致心臟供血減少、心瓣膜病、血黏度變化，心肌本身病變也會(huì)使心臟供血減少。

研究顯示，丹蔞片可緩解不穩(wěn)定型心絞痛、高脂血癥，改善代謝綜合征病人的血管內(nèi)皮功能。繆靜等[11]觀察了丹蔞片對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)大鼠血清抵抗素(resistin)、內(nèi)皮素-1(ET-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和一氧化氮(NO)水平的影響，探討丹蔞片對(duì)AS模型大鼠血管內(nèi)皮的保護(hù)作用及可能機(jī)制，結(jié)果表明，丹蔞片可通過降低AS模型大鼠血清抵抗素、ET-1、IL-6 和TNF-α水平，升高NO 水平，減輕AS模型大鼠血管內(nèi)皮損傷，作用與他汀類藥物相似，表明丹蔞片亦可保護(hù)血管內(nèi)皮，其作用機(jī)制可能是通過降低血清抵抗素、ET-1、IL-6和 TNF-α水平，增加 NO 的分泌，從而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整和功能的完善，揭示了丹蔞片對(duì)急性心肌缺血的可能機(jī)制。李琳等[4]研究顯示，丹蔞片通過上調(diào)Bcl-2的表達(dá)、下調(diào)Caspase-3的表達(dá)，從而減輕心肌細(xì)胞凋亡、減少心肌梗死面積，保護(hù)心肌缺血損傷。雖然丹蔞片改善心肌缺血的療效已在臨床得到證實(shí)，但其潛在的機(jī)制尚未明確。

本研究通過假設(shè)丹蔞片可改善大鼠急性心肌缺血，并通過檢測(cè)大鼠血液的心酶5項(xiàng)和cTnT值，評(píng)估丹蔞片對(duì)大鼠急性心肌缺血的改善作用。同時(shí)通過給予通路抑制劑來(lái)排除得到丹蔞片治療急性心肌缺血的潛在機(jī)制，證實(shí)了異丙腎上腺素連續(xù)皮下注射2 d大鼠急性心肌缺血模型造模成功，結(jié)果還顯示美托洛爾和丹蔞片都具有抗心肌缺血的作用，且丹蔞片與美托洛爾效果相當(dāng)，但仍需進(jìn)一步明確其作用機(jī)制。