復(fù)方芪參提取物對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞遷移侵襲和周期的影響

瘢痕疙瘩是一種組織在創(chuàng)傷或感染后過度修復(fù)、纖維化的良性腫瘤，其病理進(jìn)展與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲的調(diào)控異常有關(guān)

。有研究表明，復(fù)方芪參提取物能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制可能與抑制Smad2連接區(qū)和Smad3連接區(qū)磷酸化有關(guān)

。復(fù)方芪參提取物可能通過調(diào)控TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)通路抑制兔耳瘢痕增生

。復(fù)方芪參提取物通過抑制肝纖維化和PAI-1mRNA的表達(dá)而阻礙肝細(xì)胞癌發(fā)展

。但復(fù)方芪參提取物對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞遷移侵襲和細(xì)胞周期的影響鮮有研究。故本次對此進(jìn)行研究。

拌和站的混合料拌和能力應(yīng)與混合料攤鋪速度相匹配，在瀝青混合料攤鋪時(shí)，應(yīng)保證攤鋪機(jī)前始終有4～5輛自卸卡車等待卸料?；旌狭显谶\(yùn)輸過程中，為防止溫度下降過快，影響長大縱坡試驗(yàn)段路面攤鋪、壓實(shí)質(zhì)量，最好在自卸式卡車上覆蓋一層油氈布，同時(shí)盡可能加快車輛在運(yùn)輸時(shí)的速度，以減少混合料熱量的散發(fā)。

1 材料和方法

1.1 材料：瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（筆者醫(yī)院外科手術(shù)切除的瘢痕組織離體標(biāo)本）。

1.2 藥物和主要試劑：中藥材丹參（安徽省亳州市藥材市場）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國）；1%青霉素鏈霉素抗生素（Thermo Fisher，美國）；胰蛋白酶和10%胎牛血清（Thermo Fisher，美國）；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗（艾美捷科技，武漢）；RIPA裂解液、PVDF膜（ThermoFisher，美國）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天，上海）；CO

細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國）；MTT試劑盒（生物工程股份有限公司，上海）；兔抗人細(xì)胞周期蛋白1（Cyclin D1）抗體、VEGF抗體、MMP9抗體、p53蛋白抗體（Santa Cruz，美國）；BIO-RAD Powerpac Universal通用型電泳儀（伯樂，美國）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：將瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)移至5 ml EP管中，并加入1 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，將兩者混勻，并放于離心機(jī)中進(jìn)行離心（1 000 rpm，5 min），棄掉上清液，對細(xì)胞沉淀進(jìn)行收集，之后加入2 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液并吹打混勻，以適當(dāng)密度接種于新的培養(yǎng)皿中，放置于培養(yǎng)箱中（37℃、5% CO

）進(jìn)行孵育。待細(xì)胞密度到達(dá)80%以上時(shí)，進(jìn)行傳代，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%以上時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，之后用3 ml的PBS緩沖液沖洗2～3次，將剩余的PBS緩沖溶液吸去，再加入1 ml的胰酶在37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化，待細(xì)胞變圓，相互分離時(shí)，立即加入新鮮培養(yǎng)液2 ml終止消化，吹打成細(xì)胞懸液并吸取到5 ml EP管中，將其放于離心機(jī)中進(jìn)行離心（1 000 rpm，5 min），倒掉上清液，對細(xì)胞沉淀進(jìn)行收集，加入新鮮培養(yǎng)液2 ml配制成細(xì)胞懸液，吹打混勻以適當(dāng)密度接種至新的培養(yǎng)皿中，之后對培養(yǎng)皿外表面進(jìn)行消毒，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育。后續(xù)將瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于復(fù)方芪參提取物的DMEM培養(yǎng)基中，以維持耐藥性。將瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞分為對照組、低濃度組，中濃度組及高濃度組

。

1.3.2 MTT檢測瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞活力：取對數(shù)生長期的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，將各組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入200 μl的細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁后，加入復(fù)方芪參提取物進(jìn)行處理。將復(fù)方芪參提取物設(shè)為3個(gè)不同濃度(10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L)，與細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μl的MTT試劑，置于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，之后使用酶標(biāo)儀檢測波長為490 nm處的吸光度（OD）值

。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（OD

-OD

）/OD

×100%。

2.4 復(fù)方芪參提取物對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞VEGF、MMP9、Cyclin D1、p53蛋白表達(dá)的影響：Western blot結(jié)果可知，與對照組相比，低、中及高濃度組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞VEGF、MMP9、Cyclin D1、p53蛋白表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.05）。見圖3，表4。

2.3 復(fù)方芪參提取物對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期的影響：與對照組相比，低、中及高濃度組在G0/G1期的阻滯率明顯上升，S期的阻滯率明顯下降，G2/M期的阻滯率上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.05）。由于G0/G1期細(xì)胞占比較高，因此復(fù)方芪參提取物主要通過增加G0/G1期細(xì)胞阻滯抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的周期進(jìn)展。見圖2，表3。

1.3.5 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞周期進(jìn)程檢測：將瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞接種到12孔板中，細(xì)胞接種密度為1.5×10

個(gè)細(xì)胞/孔，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，分為對照組、低濃度組，中濃度組及高濃度組，每個(gè)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，使用乙醇（75%）固定瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，用RNA酶進(jìn)行處理，用10 μg碘化丙啶進(jìn)行染色。為了進(jìn)行S相分析，使用50 μM的溴脫氧尿苷培養(yǎng)細(xì)胞3 h。固定后，對鹽酸處理覆蓋物，并進(jìn)行免疫熒光處理。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，然后檢測各組HepG2.2.15細(xì)胞的周期阻滯率

。

式中：Si為某污染物的污染指數(shù)；Ci為某污染物的實(shí)測濃度，mg/L；C0為某污染物的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)值，mg/L.

1.3.4 Western Blot檢測復(fù)方芪參提取物對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中VEGF、MMP9、Cyclin D1、p53蛋白表達(dá)的影響：將對數(shù)生長期細(xì)胞以2×10

個(gè)/瓶接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至傳代時(shí)，使用預(yù)冷的PBS洗滌3次，向每組加入150 μl的RIPA裂解液，對細(xì)胞進(jìn)行均勻吹打，放置于4℃搖床上裂解15 min，之后將細(xì)胞刮下，經(jīng)超聲振蕩離心后提取總蛋白，用BCA蛋白測定試劑盒進(jìn)行定量，對上樣緩沖液均勻混合后，取40 μg蛋白進(jìn)行上樣后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳（1.5 h，250 mA），于室溫下封閉1 h。分別加入抗體VEGF、MMP9、Cyclin D1、p53（1:1 000），經(jīng)TBST沖洗3次后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔1gG二抗（1:2 000），室溫下孵育1.5 h，進(jìn)行顯影。用目的蛋白條帶和內(nèi)參吸光度（A）值的比值表示目的蛋白水平

。

日本雕塑家新宮(SusumuShingu)是一位自上世紀(jì)70年代以來一直活躍在動(dòng)態(tài)雕 塑領(lǐng)域的藝術(shù)家，他的作品大都從大自然中來。他是一位仍然堅(jiān)持用最簡單、 原始的一套動(dòng)態(tài)藝術(shù)原理制作動(dòng)態(tài)雕塑的藝術(shù)家。并且，與考爾德雕塑的強(qiáng)大自然動(dòng)力形式不同的是新宮晉的動(dòng)態(tài)雕塑中所體現(xiàn)出的“自然哲思”（見圖6）。

2 結(jié)果

2.2 復(fù)方芪參提取物對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞遷移和侵襲的影響：Transwell檢測可知，與對照組比較，隨著復(fù)方芪參提取物濃度的增加，低、中及高濃度組細(xì)胞遷移數(shù)逐漸降低，細(xì)胞侵襲數(shù)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.05）。見圖1、表2。

2.1 復(fù)方芪參提取物對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的影響：見表1，MTT檢測結(jié)果可知，復(fù)方芪參提取物處理瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞48 h后，隨著復(fù)方芪參提取物濃度的增加，細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.05），表明復(fù)方芪參提取物能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖。

3.借鑒存款保險(xiǎn)制度。退押準(zhǔn)備金制度只能保證共享租賃企業(yè)正常運(yùn)營時(shí)的退押順利。共享租賃公司作為新型經(jīng)濟(jì)主體，本身就存在較大風(fēng)險(xiǎn)，打去年以來，已有多家共享單車企業(yè)倒閉。倒閉公司的押金退回風(fēng)險(xiǎn)已經(jīng)發(fā)生。因此為避免公司倒閉帶來的押金風(fēng)險(xiǎn)，我們依然可以借鑒銀行業(yè)的存款保險(xiǎn)制度，由共享單車企業(yè)為押金投保，一旦發(fā)生公司倒閉，由保險(xiǎn)公司分擔(dān)風(fēng)險(xiǎn)。

1.3.3 Transwell檢測瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞侵襲能力：將24孔的Transwell室上腔室底部預(yù)涂基質(zhì)，將1×10

個(gè)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞接種于上室，用無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。將細(xì)胞培養(yǎng)液與含15%胎牛血清的新鮮DMEM培養(yǎng)液1:1混合加入下腔室。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用10%甲醇固定細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫染色。最后，在顯微鏡下觀察染色后的細(xì)胞

。

3 討論

瘢痕疙瘩是由皮膚組織受損后異常愈合引起的，主要是因?yàn)槌衫w維細(xì)胞異常增殖從而導(dǎo)致細(xì)胞膠原分泌量增加，進(jìn)而使得結(jié)締組織增生或變形為瘢痕，瘢痕疙瘩形成已經(jīng)嚴(yán)重影響到患者的身心健康，目前，在臨床上主要使用手術(shù)、藥物以及激光等治療技術(shù)，但是治療效果不理想，復(fù)發(fā)率高

。研究表明促進(jìn)成纖維細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡，抑制細(xì)胞增殖，可以有效改善瘢痕疙瘩

。因而根據(jù)瘢痕疙瘩的分子機(jī)制，尋找出治療靶點(diǎn)來提高治療效果及降低復(fù)發(fā)率至關(guān)重要。

2.4.3 不同年齡的醫(yī)務(wù)人員院感知識(shí)認(rèn)知正確率比較分析 按年齡段分析醫(yī)務(wù)人員院感知識(shí)認(rèn)知正確率發(fā)現(xiàn)，30歲以上的醫(yī)務(wù)人員對問卷的總體認(rèn)知正確率要顯著高于30歲以下的醫(yī)務(wù)人員，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。逐一對問卷的7個(gè)方面進(jìn)行分析，可知不同年齡段的醫(yī)務(wù)人員在傳染病認(rèn)知、院感傳播知識(shí)認(rèn)知、治療過程防護(hù)認(rèn)知、操作相關(guān)知識(shí)認(rèn)知等正確率上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且31～50歲年齡段的醫(yī)務(wù)人員普遍具有較高的認(rèn)知正確率，見表3。

復(fù)方芪參提取物屬于中藥復(fù)方制劑，由中藥丹參以及黃芪所提取的有效成分黃芪總苷、黃芪多糖和丹酚酸按一定的比例組成。丹參具有化瘀散結(jié)的功效，黃芪具有斂瘡生肌功效，兩者均能夠治療肝纖維化、病理性瘢痕等疾病

。本課題通過體外實(shí)驗(yàn)表明，復(fù)方芪參提取物對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞作用48 h后，隨著復(fù)方芪參提取物濃度的增加，低、中及高濃度組細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高，細(xì)胞遷移數(shù)以及侵襲數(shù)逐漸降低。表明復(fù)方芪參提取物能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖，削弱瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移的潛能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致

。

病理性瘢痕中，成纖維細(xì)胞過度增殖是導(dǎo)致瘢痕形成的主要環(huán)節(jié)，多種凋亡抑制基因與促凋亡基因參與成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡過程，Bax和Bcl-2均作為Bcl-2家族成員，Bax為促凋亡蛋白，Bcl-2能夠抑制凋亡，兩者相互作用從而影響細(xì)胞凋亡過程

。在病理性瘢痕中，細(xì)胞凋亡基因受到抑制，細(xì)胞調(diào)控周期變短，促進(jìn)細(xì)胞增生，促進(jìn)瘢痕形成

。研究表明Cyclin D1是G1期細(xì)胞增殖信號的關(guān)鍵蛋白，抑制增生瘢痕中Cyclin D1的表達(dá)并可通過與細(xì)胞周期依賴蛋白激酶（CDK4/6）結(jié)合形成復(fù)合物從而阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖

。本實(shí)驗(yàn)研究，與對照組相比，低、中及高濃度組在G0/G1期的阻滯率明顯上升，S期的阻滯率明顯下降，G2/M期的阻滯率上升，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平明顯下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致

。

綜上，復(fù)方芪參提取物能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖，降低瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移的潛能。

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