益生菌聯(lián)合消退素D1對牙周炎大鼠牙齦組織中炎癥因子、正五聚體蛋白3和氧化應激的影響

牙周炎是一種非特異性的炎性疾病，牙齦紅腫、牙齦出血及牙齒松動等是其常見的臨床表現(xiàn)，牙周炎的發(fā)生涉及氧化應激、炎癥、信號傳導等多個過程，尋找有效藥物改善牙周炎是目前亟待解決的問題

。消退素可分成E類和D類，D類消退素主要來源于二十二六烯酸，消退素D1屬于D類消退素，具有消炎、鎮(zhèn)痛等作用

。已經(jīng)證明消退素D1對牙周炎有治療功效

。益生菌是一種微生態(tài)制劑，能夠調(diào)節(jié)免疫、降低膽固醇、改善消化系統(tǒng)

。臨床研究

顯示，益生菌可減輕慢性牙周炎患者出血、疼痛等癥狀，有美學修復效果。本次探討益生菌聯(lián)合消退素D1對牙周炎大鼠的影響及可能機制，為臨床上牙周炎的治療提供參考思路。

內(nèi)蒙古額仁高比一帶發(fā)育大量的早白堊世白音高老組的火山巖，分析地區(qū)白音高老組火山巖巖石地球化學特征，對揭示該時期巖漿作用具有重要地質(zhì)意義。通過1∶5萬區(qū)域地質(zhì)調(diào)查工作，探討其成因以及形成的大地構造環(huán)境。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑：MDA檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；益生菌購自法國Lactibiane；IL-1β檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所；兔抗MMP-2抗體、兔抗p-p38MAPK抗體購自美國Cell Signaling Technology；IL-6檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；TNF-α檢測試劑盒購自深圳市拓普生物科技有限公司；兔抗PTX3抗體購自美國Invitrogen；兔抗NF-κBp65抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；GSH-Px檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司；兔抗MMP-9抗體購自美國Abcam；消退素D1購自美國Sigma。

(3)要對各種管道配件的外形、尺寸“心中有數(shù)”，尤其是大口徑的管道配件，不但安裝時占用的空間大，還需要一定的操作空間，因此布置時一定要核對尺寸，不能盲目布置。配件的外形、尺寸等參數(shù)可以從有關手冊、標準圖和廠家的技術資料中查到。

1.2 主要實驗儀器：UV7分光光度計購自瑞士梅特勒-托利多；318C+酶標儀購自上海沛歐分析儀器有限公司；DYCSCZ7電泳儀購自北京東方瑞利科技有限公司。

1.3 實驗動物：健康SD大鼠，8周齡，體重280～320 g，購自天津市中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，許可證號：SCXK(津)2020-0005。

1.4.2 牙齦出血指數(shù)、菌斑指數(shù)及探診深度檢測：①牙齦出血指數(shù)。用探針輕觸牙周袋、齦溝，游離的齦緣沒有炎癥，不出血，記為0分；游離的齦緣沒有紅腫，但出血，記為1分；游離的齦緣紅腫、水腫，出血，記為2分；牙齦紅腫，出現(xiàn)潰瘍，記為3分；②探診深度。將有刻度的細探針探診牙周袋，選取中頰、遠中頰以及側頰共3個測量點，最后取均值；③菌斑指數(shù)。將菌斑染色溶液涂抹在選用牙上，孵育30 s，用自來水洗滌10 s，觀察牙面紫紅色，0分表示近齦緣區(qū)域沒有菌斑，1分表示近齦緣區(qū)域有薄菌斑，2分表示齦緣、鄰面存在菌斑，3分表示齦溝、鄰面、齦緣存在大量菌斑。

1.4.1 模型構建和分組：結合相關文獻構建牙周炎動物模型

。腹腔注射10%的水合氯醛麻醉大鼠，將牙齦剝離，用0.2 mm直徑的正畸結扎絲將大鼠左側上頜第一磨牙結扎，結扎的絲線置于齦溝內(nèi)。結扎后，大鼠飼喂高糖飼料（面粉6 g、脫脂奶粉28 g、蔗糖56 g、肝粉1 g、酵母粉4 g，少量食鹽以及蔬菜），飲用200 g/L的糖水。4周后，肉眼觀察大鼠牙齦紅腫，觸摸容易出血，牙齒松動，表明造模成功。

1.4 實驗方法

1.4.3 ELISA法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α水平：取牙齦組織，用ELISA法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α含量，步驟分別根據(jù)IL-1β檢測試劑盒、IL-6檢測試劑盒、TNF-α檢測試劑盒操作說明進行。

1.4.4 Western blot檢測PTX3、NF-κBp65、p-p38MAPK、MMP-9、MMP-2蛋白表達水平：取牙齦組織，添加含有PMSF的RIPA溶液，充分裂解，4℃，12 000 g離心10 min。取上清，與5×Loading Buffer混合，在100℃孵育5 min。每個泳道內(nèi)添加50 μg的蛋白樣品，首先設置90 V的電壓電泳30 min，然后設置120 V的電壓電泳1.5 h，肉眼觀察藍色染料進入分離膠的底部位置，停止電泳。NC膜根據(jù)分離膠的大小裁剪，設置100 V電壓轉(zhuǎn)膜2 h。NC膜浸泡在5%牛血清白蛋白溶液中，室溫結合2 h。然后把NC膜放在一抗溶液內(nèi)，4℃過夜反應。NC膜浸泡在二抗內(nèi)，室溫結合2 h。按照ECL方法顯色。GAPDH作為參照，根據(jù)條帶的灰度值分析目的蛋白表達量變化。PTX3、p38MAPK一抗按照1:800稀釋，MMP-9、MMP-2、NF-κBp65一抗按照1:1 000稀釋，p-p38MAPK一抗按照1:600稀釋。二抗均按照1:4 000稀釋。

2.3 益生菌聯(lián)合消退素D1抑制牙周炎大鼠牙齦組織中PTX3表達：與對照組比較，模型組大鼠牙齦組織中PTX3蛋白表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義（

＜0.05）；與模型組比較，益生菌組、消退素D1組、聯(lián)合組大鼠牙齦組織中PTX3蛋白表達量均降低，差異有統(tǒng)計學意義（

＜0.05）；與益生菌組、消退素D1組比較，聯(lián)合組大鼠牙齦組織中PTX3蛋白表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義（

＜0.05）。見圖1、表3。

2.2 益生菌聯(lián)合消退素D1對牙周炎大鼠牙齦組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的影響：與對照組比較，模型組大鼠牙齦組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量均升高，差異有統(tǒng)計學意義（

＜0.05）；與模型組比較，益生菌組、消退素D1組、聯(lián)合組大鼠牙齦組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量均降低，差異有統(tǒng)計學意義（

＜0.05）；與益生菌組、消退素D1組比較，聯(lián)合組大鼠牙齦組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量均降低，差異有統(tǒng)計學意義（

＜0.05）。見表2。

2.1 益生菌聯(lián)合消退素D1對牙周炎大鼠牙齦出血指數(shù)、菌斑指數(shù)及探診深度的影響：與對照組比較，模型組大鼠牙齦出血指數(shù)、菌斑指數(shù)及探診深度均升高，差異有統(tǒng)計學意義（

＜0.05）；與模型組比較，益生菌組、消退素D1組、聯(lián)合組大鼠牙齦出血指數(shù)、菌斑指數(shù)及探診深度均降低，差異有統(tǒng)計學意義（

＜0.05）；與益生菌組、消退素D1組比較，聯(lián)合組大鼠牙齦出血指數(shù)、菌斑指數(shù)及探診深度均降低，差異有統(tǒng)計學意義（

＜0.05）。見表1。

造模成功的大鼠分成模型組、益生菌組、消退素D1組及聯(lián)合組，每組11只。益生菌組從第5周開始，灌胃2 ml的益生菌液（5×10

CFU/ml）

；消退素D1組從第5周開始，尾靜脈注射2 μl的100 ng/ml的消退素D1

；聯(lián)合組從第5周開始，灌胃2 ml的益生菌液（5×10

CFU/ml），并尾靜脈注射2 μl的100 ng/ml消退素D1。各組大鼠每天用藥1次，連續(xù)用藥4周。模型組大鼠用生理鹽水代替藥物。選取11只對照組大鼠，按照同樣方法麻醉，但不結扎。各組大鼠檢測牙齦出血指數(shù)、菌斑指數(shù)、探診深度后，取大鼠牙齦組織，分別用于炎癥因子檢測、蛋白表達檢測和氧化應激指標檢測。

2 結果

封建社會的傳統(tǒng)是民敬官，民不能與官斗，因為胳膊擰不過大腿；下級不能與上級斗，因為官大一級壓死人。封建社會里百姓稱官員為“官老爺”，官不畏民，幾乎沒有官員認為自己也是百姓，像高以永既承認自己是百姓，還寫成對聯(lián)掛在縣衙三堂自勉的官員更是鳳毛麟角。他們多數(shù)會擺足官架子，騎在老百姓的頭上作威作福；偶有良善一些，稍微替老百姓做點事兒的官員，老百姓就會感激涕零，山呼青天大老爺。

1.4.5 SOD、MDA、GSH-Px檢測：取牙齦組織，用比色法檢測SOD、GSH-Px含量，分光光度計法檢測MDA含量，步驟分別按照SOD檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒、GSH-Px檢測試劑盒說明書進行。

漢字是不同與拼音文字的一種特殊的表義體系的文字，具有拼音文字所不具備的形音義關系，形聲字就是這種關系的最好的體現(xiàn)。如果留學生能夠提綱挈領地學習形聲字，了解和掌握形聲字的規(guī)律和特點，從而增強識字能力，減輕認字負擔。由此可見，形聲字教學在對外漢字教學中占有重要的地位，所以對外漢語教師應該在漢字教學過程，充分利用形聲字自身所具有的音義理據(jù)，針對外國留學生的水平，制定出一套有效的形聲字教學方法。

2.4 益生菌聯(lián)合消退素D1對牙周炎大鼠牙齦組織中SOD、MDA、GSH-Px的影響：與對照組比較，模型組大鼠牙齦組織中SOD、GSH-Px含量降低，MDA含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（

＜0.05）；與模型組比較，益生菌組、消退素D1組、聯(lián)合組大鼠牙齦組織中SOD、GSH-Px含量升高，MDA含量降低，差異有統(tǒng)計學意義（

＜0.05）；與益生菌組、消退素D1組比較，聯(lián)合組大鼠牙齦組織中SOD、GSH-Px含量升高，MDA含量降低，差異有統(tǒng)計學意義（

＜0.05）。見表4。

本文通過選取適宜的分析譜線和儀器工作參數(shù)，不同的積分、觀測方式，實現(xiàn)了同時測定Cu、Fe、Ni、Cd、Zn、Mn、Ca、Mg、Na、Si、As、S，采用內(nèi)標法補償因鈷鹽基體對待測元素的影響，經(jīng)試驗驗證可用于鈷產(chǎn)品生產(chǎn)過程CoCl2凈化液和Co(NO3)2凈化液中Cu、Fe、Ni、Cd、Zn、Mn、Ca、Mg、Na、Si、As、S等12種元素的測定。也可用于金屬Co、Co3O4、Co(OH)2等鈷產(chǎn)品中上述元素的測定。

2.5 益生菌聯(lián)合消退素D1抑制牙周炎大鼠牙齦組織中NF-κBp65、p-p38MAPK、MMP-9、MMP-2蛋白表達：與對照組比較，模型組大鼠牙齦組織中NF-κBp65、p-p38MAPK、MMP-9、MMP-2蛋白表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義（

＜0.05）；與模型組比較，益生菌組、消退素D1組、聯(lián)合組大鼠牙齦組織中NF-κBp65、p-p38MAPK、MMP-9、MMP-2蛋白表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義（

＜0.05）；與益生菌組、消退素D1組比較，聯(lián)合組大鼠牙齦組織中NF-κBp65、p-p38MAPK、MMP-9、MMP-2蛋白表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義（

＜0.05）。見圖2、表5。

2月20日，水利部直屬機關2012年黨的工作會議在京召開。水利部黨組書記、部長陳雷出席會議并作重要講話。中央國家機關工委副書記俞貴麟到會指導并講話。水利部黨組副書記、副部長矯勇主持會議。水利部黨組成員、中紀委駐部紀檢組組長董力傳達中央國家機關第二十六次黨的工作會議暨第二十四次紀檢工作會議精神。水利部黨組成員、副部長、直屬機關黨委書記周英作工作報告。水利部副部長胡四一，水利部黨組成員、副部長李國英，總工程師汪洪，總規(guī)劃師兼規(guī)劃計劃司司長周學文出席會議。

3 討論

牙周炎與慢性炎癥、氧化應激等有關

。IL-1β、IL-6、TNF-α是常見的炎癥因子，其表達增多后可誘導炎癥反應，加快炎癥損傷

。PTX3屬于炎性反應蛋白，PTX3表達改變與牙周炎慢性炎癥相關

。氧化應激是由過量的氧自由基引起的，而氧自由基的積累與機體內(nèi)抗氧化酶SOD、GSHPx等的水平有關；過量的氧自由基能夠?qū)⒅|(zhì)過氧化，生成MDA，因此檢測MDA含量變化可間接反應氧化應激水平

。

益生菌能夠改善宿主免疫水平、改善腹瀉

。益生菌對牙周炎患者有治療作用

。益生菌還可降低牙周炎患者炎癥因子TNF-α、IL-1β水平

。消退素D1有抑制炎癥等作用

。消退素D1處理后的牙周炎大鼠IL-1β、IL-6水平降低，牙齦指數(shù)明顯改善

。本實驗顯示，益生菌、消退素D1治療后的牙周炎大鼠牙齦出血指數(shù)、菌斑指數(shù)及探診深度明顯降低，并且牙齦組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平和PTX3蛋白表達量減少，提示益生菌、消退素D1可降低牙周炎炎癥，改善牙齦出血等癥狀，與之前的研究報道結果一致，均說明益生菌、消退素D1對牙周炎有治療功效。本實驗還顯示，益生菌、消退素D1治療后的牙周炎大鼠SOD、GSH-Px水平升高，MDA水平降低，并且兩者聯(lián)合后效果更佳，說明益生菌和消退素D1還可以降低牙周炎氧化應激水平，益生菌聯(lián)合消退素D1對牙周炎治療效果更好。

進一步分析發(fā)現(xiàn)，益生菌、消退素D1降低牙周炎大鼠牙齦組織中NF-κBp65、p-p38MAPK、MMP-9、MMP-2蛋白表達量。牙周病原微生物可激活Toll受體，誘導p38MAPK信號活化，進而激活NF-κB信號通路，促進炎癥因子生成，誘導炎癥

。p38MAPK、NF-κB信號還可調(diào)控氧化應激、細胞外基質(zhì)降解等過程，促進氧化損傷和牙齦損傷

。MMP-9、MMP-2能夠促進牙周炎癥過程中外基質(zhì)降解，加快牙齦損傷

。本次實驗說明，益生菌、消退素D1可能通過抑制p38MAPK、NF-κB信號改善牙周炎炎癥損傷、氧化應激和牙齦損傷。益生菌聯(lián)合消退素D1可能是未來牙周炎治療的有效途徑。

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