酒精性肝損傷保護的藥理實驗教學設計

劉 蕾，高越穎，郭 琳，邱立朋，李 會，耿 燕

（江南大學生命科學與健康工程學院，江蘇無錫 214122）

0 引言

新工科背景下要求高等教育培養(yǎng)多元化、創(chuàng)新型的卓越工程人才，具有系統(tǒng)化、戰(zhàn)略型、創(chuàng)新性、開放式的特征［1］。實驗教學是高等醫(yī)藥院校培養(yǎng)應用型技術(shù)人才的重要組成部分；其中，設計性實驗是基于理論指導實踐，學生自主完成探索性實驗的過程，是推進實驗教學改革、培養(yǎng)學生綜合創(chuàng)新意識和能力過程中不可或缺的環(huán)節(jié)［2］。藥理學實驗是研究藥物與機體相互作用及機制、理解藥物防治疾病機理的學科，是制藥工程專業(yè)的必修課程之一［3］。傳統(tǒng)藥理學實驗大多依附理論教學，側(cè)重演示、驗證，而綜合和設計性實驗較少，忽視了學生創(chuàng)新與探索能力培養(yǎng)，缺乏與其他學科的融合交叉，存在一定程度上基礎與臨床、傳統(tǒng)與新興科研熱點脫節(jié)的問題。如何在藥理學實驗中結(jié)合當代醫(yī)藥熱點，開展“多學科多層次”的教學模式，挖掘和培養(yǎng)學生綜合創(chuàng)新能力，是目前我院藥理學實驗改革的出發(fā)點與落腳點。

鑒于我國的飲酒文化，長期過度飲酒引發(fā)的酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）［4-5］，已成為我國最主要的慢性肝臟疾病之一，嚴重危害了國人健康；其發(fā)病機制復雜，主要與炎癥、氧化應激、乙醇代謝反應及脂代謝等有關(guān)［6］，開發(fā)預防和治療ALD的功能性食品及藥品具有重要的臨床意義。近期有研究發(fā)現(xiàn)ALD與體內(nèi)腸道微生物菌群的失調(diào)有關(guān)，臨床上可通過補充益生菌［7］、合理使用抗生素［8］和糞菌移植［9］等方式治療，針對腸道微生態(tài)失衡的靶向治療亦是現(xiàn)代藥理學研究的新興方向。

由此結(jié)合本專業(yè)生物制藥特色，促進創(chuàng)新性藥理學實驗項目的開展，設計了綜合設計性實驗——以腸道微生態(tài)藥物為主的酒精性肝損傷保護實驗，引導學生圍繞酒精性肝損傷及腸道微生態(tài)研究，比較了益生菌酸奶、抗生素及聯(lián)苯雙酯對急性酒精肝損傷的保護作用。該實驗涵蓋了藥理學、病理學、微生物學、分子生物學及分析化學等課程的知識點和技能訓練，訓練學生解剖、組織切片染色、顯微鏡觀察以及細胞活性檢測等多學科實驗技能；亦通過小鼠行為學變化、器官指數(shù)及血清生化指標等來比較不同藥物前期干預的解酒及保肝效果，了解腸道微生態(tài)對相關(guān)疾病的影響。與傳統(tǒng)使用保肝藥所進行的驗證性實驗相比，本實驗緊跟時代潮流，促使學生有效地將理論知識與實踐相結(jié)合，發(fā)揮自主能動性，學習不同疾病藥物的前期探索及篩選過程，訓練了創(chuàng)造性發(fā)散思維，為畢業(yè)設計及今后科研工作奠定良好的基礎。

1 實驗設計

本教研室以學生為中心，能力培養(yǎng)為教學目標，優(yōu)化了藥理學實驗教學內(nèi)容及方法，將傳統(tǒng)的填鴨式教學模式轉(zhuǎn)變?yōu)橐詫W生為中心、教師為輔的翻轉(zhuǎn)課堂教學模式，借助課內(nèi)外知識點，更新驗證性實驗為設計性、探索性綜合實驗，挖掘融合更多學科的知識點及實驗技能，通過課前-課中-課后教師與學生之間不同的任務安排，培養(yǎng)學生綜合科研能力。優(yōu)化設計的酒精性肝操作保護的藥理實驗及實施過程如圖1 所示。

圖1 藥理學設計性實驗優(yōu)化及實施過程

本實驗共安排10 學時，分兩周次進行。①課前，學生4 或5 人1 組，共8 組，自行查閱文獻，了解酒精性肝損傷的發(fā)病機制，針對不同機制判斷用藥；結(jié)合教研平臺條件，設計合理的分析指標來考察不同藥物的保肝作用；最終各組設計1 或2 種腸道藥物為主的實驗方案，通過全班討論及教師答疑評估的方式選出最適宜的2 或3 種藥物進行后續(xù)實驗，期間鼓勵學生團隊協(xié)作，培養(yǎng)創(chuàng)新思維。表1 所示列出了學生提出的4 種不同藥物，最終考慮到藥物機制不同、藥效快慢、日常獲得難易程度、課時安排是否合理等因素選取了抗生素、益生菌為主，聯(lián)苯雙酯為陽性藥進行實驗。②課中，各組在教師的監(jiān)督配合下完成實驗準備、動物模型的建立與給藥、取材及數(shù)據(jù)結(jié)果分析等過程，突出學生的實驗主體地位，培養(yǎng)學生自主實驗意識以及發(fā)現(xiàn)-分析-解決問題的能力。③課后，學生按論文形式撰寫一份實驗報告，闡述實驗目的、原理、方法、步驟及結(jié)果討論等，要求對本組及全班結(jié)果匯總分析，并對實驗中所遇到的實驗操作、團隊協(xié)作等問題進行討論，思考實驗啟示及創(chuàng)新點。教師根據(jù)學生分組情況、試驗方案設計、課堂討論、基礎操作以及報告書寫來進行成績評定，整個實驗成績按照20%的比例計入藥理學實驗課成績。

表1 酒精性肝損傷保護的藥理實驗學生設計的可行性方案選項

2 實驗過程與結(jié)果

2.1 實驗目的

酒精性肝損傷保護的藥理實驗目的主要有：①學習急性酒精肝小鼠模型的建立；了解腸道微生態(tài)干擾藥物抗生素及益生菌酸奶對酒精肝的預防保護作用；②掌握小鼠取材實驗操作；③掌握谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒分析方法；④掌握蘇木精-伊紅（HE）染色法及顯微鏡使用；⑤學習SPSS 22.0 軟件操作。

2.2 實驗原理

肝臟和腸道在結(jié)構(gòu)和功能上緊密相連，形成了“腸-肝軸”循環(huán)［10］，肝臟作為機體最大免疫器官，具有聚集并激活免疫細胞、應答腸源性代謝物質(zhì)或炎癥信號的能力。正常免疫狀態(tài)下，少量細菌或內(nèi)毒素會激發(fā)肝臟Kupffer細胞對其進行免疫清除，但當腸道菌群失調(diào)或門靜脈破壞腸粘膜時，進入肝臟的細菌及內(nèi)毒素增多，引發(fā)一系列炎癥反應造成慢性肝損傷，從而引起肝組織壞死和破裂出血，肝細胞膜通透性增大，肝臟的內(nèi)源性轉(zhuǎn)氨酶，即AST 和ALT 大量地釋放到細胞外，致使血清中二者含量升高，因此二者是臨床上判斷肝功能的主要指標［11］。

酒精是最常見的外源性物質(zhì)，長期或大量飲酒會造成腸道菌群紊亂、腸源性內(nèi)毒素血癥、腸黏膜屏障功能破壞及細菌易位［12］，其中，腸源性內(nèi)毒素血癥是較為嚴重的腸道微生態(tài)失衡表現(xiàn)之一。長期飲酒會造成腸道內(nèi)產(chǎn)內(nèi)毒素的細菌如Treptococci 等增多，而產(chǎn)短鏈脂肪酸的細菌如Lachnospiraceae 和Lactobacillus 等益生菌減少［13-14］，破壞腸道屏障，觸發(fā)酒精性肝炎。同時，肝臟清除內(nèi)毒素的功能減弱，大量內(nèi)毒素進入體循環(huán)，引起血液中脂多糖濃度升高，加重炎癥反應［15］，造成惡性循環(huán)。因此，目前大多針對腸道微生態(tài)的治療方式如抗生素、益生元、益生菌和合生元治療等都是試圖抑制腸道革蘭氏陰性菌的過度生長，維持腸道滲透壓的穩(wěn)定性來降低血清內(nèi)毒素。

2.3 實驗動物

C57BL／6 小鼠50 只（SPF 級），體重18～22 g，雌雄各半，約9 周齡，江蘇集萃藥康生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK（蘇）2018-0008；溫度20～24 ℃，相對濕度50%～70%，自然光照，自由攝食和飲水，該研究經(jīng)學校實驗動物中心倫理委員會批準。

2.4 主要試劑、實驗器材

聯(lián)苯雙酯（批號D843898）；抗生素：鹽酸萬古霉素（批號V820413）、硫酸多粘菌素B（批號P815744），甲硝唑（批號M813526），氨芐西林（批號A830931）；以上試劑均來自上海麥克林生化科技有限公司。自制發(fā)酵酸奶（發(fā)酵劑：保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，安琪酵母股份有限公司）、無水乙醇（國藥試劑，批號：20210307）。ALT 試劑盒（批號C009-2-1），AST 試劑盒（批號C010-2-1）均購于南京建成生物工程研究所。

酶標儀，美國Bio-Rad公司；HH-S4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海越眾儀器設備有限公司；臺式冷凍離心機，德國艾本德公司；光學顯微鏡，OLYMPUS；石蠟切片機，德國徠卡公司等。

2.5 實驗分組、給藥及檢測指標

（1）試驗小鼠的處理。小鼠隨機分為5 組，1 組10 只（見表2）；連續(xù)灌胃給藥14 天，灌胃前禁食不禁水約5 h。A正常組：生理鹽水；B模型組：生理鹽水；C陽性對照聯(lián)苯雙酯組：10（mg·kg-1）／BW聯(lián)苯雙酯；D抗生素組：將鹽酸萬古霉素、硫酸多粘菌素B、甲硝唑、氨芐西林配置抗生素水溶液，終濃度1 mg／mL，由小鼠自由飲水；E 益生菌酸奶組：100（μL·10 g-1）／BW。末次給藥后1 h，除正常組小鼠給予等量蒸餾水灌胃外，其他各組小鼠給予50%乙醇（5.5（g·kg-1）／BW）灌胃建立急性酒精性肝損傷模型，造模后禁食不禁水。

表2 實驗分組及檢測指標

（2）檢測指標。①一般觀察。造模期間觀察小鼠精神、活動、飲食及排便等一般情況。每日灌胃前稱重；酒精灌胃后12～16 h內(nèi)，觀察小鼠自主活動狀態(tài)。②血清生化指標測定。末次給酒后16 h，眼球取血約1.5 mL，37 ℃恒溫30 min，3 500 r／min離心10 min，得上清液血清，按試劑盒要求檢測ALT 及AST 值。③器官指數(shù)測定。小鼠頸椎脫臼處死后，取肝、脾、胃、小腸、盲腸、結(jié)直腸等器官，生理鹽水洗凈，濾紙吸干，稱重，計算各器官指數(shù)（器官指數(shù)＝器官質(zhì)量／體質(zhì)量×100%）。④肝組織病理切片。取小鼠的左葉中部肝臟，不超過1 cm3，用4%多聚甲醛固定后常規(guī)脫水，包埋，切片染色，顯微鏡下觀察其病理變化。

（3）采用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計學分析（見表3），結(jié)果以s表示；采用單因素方差分析法對組間數(shù)據(jù)進行差異比較，P＜0.05，P＜0.01 表示有統(tǒng)計學意義。

表3 小鼠器官指數(shù)變化（ˉx±s，n ＝10）

2.6 結(jié)果

（1）小鼠的行為觀察。造模前小鼠狀態(tài)正常，飲水進食、毛發(fā)及大便均正常，體重亦緩步增加。給予50%的乙醇后模型組小鼠出現(xiàn)興奮狀態(tài)，逐漸走路不穩(wěn)，四肢疲軟，約15 min后醉倒，呼吸變得急促并開始抽搐，此狀態(tài)持續(xù)數(shù)小時；其余3 組先表現(xiàn)為行動緩慢不穩(wěn)，約30 min 進入嗜睡及翻正反射消失等醉酒狀態(tài)，進食變少，待12 h后，大部分小鼠已恢復正常清醒狀態(tài)，少數(shù)雄性小鼠仍處于昏睡狀態(tài)；說明聯(lián)苯雙酯、抗生素及益生菌均具有不同程度的解酒作用。

（2）小鼠器官指數(shù)比較。與正常組比較，酒精模型組的肝臟、脾、胃及小腸指數(shù)顯著性增高，尤其是肝臟指數(shù)有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），大劑量酒精引起肝組織腫脹并出現(xiàn)炎癥，說明造模成功；與模型組對比，聯(lián)苯雙酯組及抗生素組的肝臟、脾、胃及小腸指數(shù)有所下降，其中聯(lián)苯雙酯及抗生素組的肝指數(shù)呈顯著性降低，說明二者均對酒精性肝損傷有提前干預及保護作用；益生菌酸奶組只有脾臟指數(shù)與模型組有顯著性差異，其余臟器變化不大，說明益生菌酸奶對酒精性肝損傷前期干預作用不強；本實驗中3 種藥物對酒精性肝損傷保護的強弱順序：聯(lián)苯雙酯＞抗生素＞益生菌酸奶。

（3）血清生化指標檢測。由圖2 可知，模型組小鼠血清ALT 和AST 水平較正常組顯著升高（P＜0.01），表示小鼠經(jīng)一次性灌胃50%酒精后出現(xiàn)了肝損傷，造模成功；陽性對照聯(lián)苯雙酯組的血清ALT 及AST較正常組亦明顯降低，其中ALT 水平降低更明顯（P＜0.01）。

圖2 各組血清肝功能指標

抗生素組、益生菌酸奶組與模型組相比，血清ALT水平均有下降（P＜0.05）；與陽性對照組相比，二組ALT水平下降幅度有所減緩，但無顯著性差異；由此血清ALT水平：正常組＜聯(lián)苯雙酯組＜抗生素組＜益生菌酸奶組＜模型組。

抗生素組與益生菌酸奶組的血清AST 水平與模型組相比，呈現(xiàn)不同程度的降低，其中抗生素組的AST水平顯著性降低（P＜0.01），本實驗中比陽性藥聯(lián)苯雙酯效果更好，學生推測：由于抗生素清除了體內(nèi)大部分的內(nèi)毒素，即使攝入酒精后通過炎癥反應所進入肝臟的內(nèi)毒素也已大大降低，起到了前期干預保護作用；益生菌酸奶組AST水平與模型組相比，雖有所下降但未見顯著性差異，學生推測：由于益生菌是通過改變不同菌群比例，即促進有益菌群的增長、限制病原微生物繁殖從而降低內(nèi)毒素起到保護肝臟的作用，此過程較為緩慢，而本實驗中樣本數(shù)較少，課時較短，且學生實驗操作及血樣處理時間差異等人為操作誤差也會引起結(jié)果不同，因此無法觀察到顯著性差異；由此血清AST水平：正常組＜抗生素組＜聯(lián)苯雙酯組＜益生菌酸奶組＜模型組。

（4）急性ALD 后肝組織病理形態(tài)變化。染色結(jié)果（見圖3）顯示，正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，細胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，以中央靜脈為中心呈放射狀排列，未出現(xiàn)腫脹、炎細胞浸潤等病理現(xiàn)象；模型組肝細胞存在明顯變性腫脹，細胞壞死，存在一定的炎性浸潤現(xiàn)象，排列紊亂，提示本次造模成功。

圖3 各組小鼠肝組織病理形態(tài)

陽性藥聯(lián)苯雙酯組中央靜脈周圍細胞正常，肝小葉周邊細胞空泡稍增多，提示在陽性藥的干預下，大部分肝細胞未受到酒精傷害?？股亟M出現(xiàn)少量肝細胞死亡，炎細胞局部浸潤，同時伴隨有雙核細胞增加，排列緊密，說明細胞正在自我修復，提示抗生素對酒精性肝損傷的保護作用較強。益生菌酸奶組肝細胞由中央靜脈至邊緣肝小葉均不同程度出現(xiàn)空泡，細胞腫脹，間隙較大，呈現(xiàn)中度損傷，提示益生菌酸奶對酒精肝保護作用較弱。

3 教學效果分析與討論

（1）優(yōu)化實驗項目和教學方法，保持學科前沿性。受原驗證性實驗的課時限制，學生僅參與課堂上小鼠一般觀察、解剖取材及器官指數(shù)測定工作，前期實驗設計、動物給藥、造模以及后期HE 染色、生化指標檢測等都無法參與，缺乏完整系統(tǒng)的學習過程。經(jīng)過與教研室、動物中心及分析測試中心協(xié)調(diào)，開展了以日常疾病為主的設計性實驗，將原4 課時增至10 課時，開放所有實驗室。以翻轉(zhuǎn)課堂的教學模式，學生可結(jié)合課余及課堂時間在教師的指導下參與整個實驗過程，增加了實驗操作機會，調(diào)動了學生積極性和探索性；同時要求教師不斷提高業(yè)務能力，把握學科研究熱點，保持學科教學前沿性。

（2）多學科交叉訓練，提高學生發(fā)現(xiàn)-分析-解決問題的能力。綜合運用多學科知識點及基礎技能，如解剖、病理、微生物、生化、分析化學、藥理等課程，實現(xiàn)多學科交叉融合。學生從感性認識開始，通過觀察疾病發(fā)生-藥物治療-病癥指標檢測，學習篩選治療不同疾病藥物的過程，訓練分析判斷、邏輯思維能力。如學生在動物造模環(huán)節(jié)中意識到分組、抓取、灌胃等基礎操作的熟練程度會造成小鼠的狀態(tài)不佳，影響一般觀察結(jié)果以及藥效的發(fā)揮；在生化指標檢測時，發(fā)現(xiàn)染色切片、酶標儀等儀器操作不規(guī)范大大影響實驗結(jié)果，益生菌酸奶組在測定ALT及AST生化指標時，血樣操作時間間隔較長，樣品長時間暴露在室溫下，導致本組的AST指標出現(xiàn)了較大的誤差等；諸如此類發(fā)現(xiàn)并分析問題的過程，也培養(yǎng)了學生嚴謹?shù)目蒲袘B(tài)度。

（3）拓展實驗內(nèi)容，以賽促學，培養(yǎng)學生創(chuàng)新意識。在加強學生實踐訓練的同時，也拓寬了學生的科研視野，推動學生積極參加學科競賽，達到“以賽促學、以賽促教、以賽促改”的效果［16］，全面提升專業(yè)素養(yǎng)和綜合創(chuàng)新能力，為今后科研及工作奠定基礎。如有學生提出可增加其他體內(nèi)生化指標如肝臟中脂多糖、谷胱甘肽以及通過測定體外總抗氧化還原能力、DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基清除率及羥自由基清除率等來進一步驗證抗生素及益生菌酸奶對ALD的保護作用，亦可篩選二者同類型或衍生藥物。借此拓展思路，2018、2019 級學生分別在2020 年省級及2021 年國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃中獲得了優(yōu)異的成績。

4 結(jié)語

本設計性實驗選取與生活實際密切相關(guān)的酒精性肝病及腸道微生態(tài)為主題，從基礎研究出發(fā)，通過對理論知識的拓展，整合多學科知識點，相互滲透，有效銜接大二大三課程，使專業(yè)實驗一體化，各課程及實驗內(nèi)容得到較好的延續(xù)性及完整性，讓藥理學實驗更具實踐性、科學性和創(chuàng)新性，培養(yǎng)了學生綜合科研素質(zhì)，為成為科研與臨床高級藥學人才打下堅定的基礎。同時，今后可以有意識地結(jié)合人文思想教育，如用藥安全、動物倫理、綠色健康等，一方面加深學生的感性認識，提高學習興趣，另一方面為他們的未來制藥研發(fā)工作起到警示和預防作用，培養(yǎng)社會責任感和良好道德，達到教書育人之目標。