交叉學(xué)科建設(shè)中氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)實(shí)驗(yàn)課程的設(shè)計(jì)

楊 晨，顏 軍，何 鋼，任鳳英，梁 立，魯 蘭

（成都大學(xué)藥學(xué)院，藥食同源植物資源開發(fā)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610106）

0 引言

不同學(xué)科間的交叉融合，多技術(shù)跨界交聯(lián)將不斷催生新學(xué)科、新技術(shù)和創(chuàng)新成果。在高校實(shí)驗(yàn)課程開展過程中，多學(xué)科交叉融合不僅可以拓展學(xué)生知識(shí)面，更能激發(fā)學(xué)生自主學(xué)習(xí)意識(shí)，提高實(shí)驗(yàn)中創(chuàng)新能力，更能推動(dòng)學(xué)院間學(xué)科協(xié)同發(fā)展從而培養(yǎng)出復(fù)合型人才［1-6］。

生物信息學(xué)作為當(dāng)今生命科學(xué)和自然科學(xué)重大前沿領(lǐng)域之一，是以計(jì)算機(jī)為工具對(duì)生物信息進(jìn)行儲(chǔ)存、檢索和分析的科學(xué)。生物信息學(xué)作為一門實(shí)踐性很強(qiáng)的學(xué)科，需要從網(wǎng)絡(luò)信息中獲取大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，因此對(duì)學(xué)生的計(jì)算機(jī)操作能力和數(shù)據(jù)分析能力顯得十分重要。通過生物信息學(xué)技術(shù)，可以去探索基因如何形成代謝通路控制復(fù)雜生命現(xiàn)象和行為［7-12］。儀器分析作為化學(xué)學(xué)科重要分支，是以物質(zhì)理化性質(zhì)為基礎(chǔ)建立的一種分析方法。氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）以其靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可檢測(cè)到大量低含量小分子物質(zhì)。目前已成為微生物功能基因組代謝表型研究的常規(guī)分析技術(shù)。GC-MS在色譜分析重復(fù)性、分辨率和質(zhì)譜裂解碎片重復(fù)性方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，因此可以選擇性地富集和檢測(cè)大量代謝物中痕量物質(zhì)，表型代謝通路中參與各種反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)，使其在代謝組學(xué)基礎(chǔ)上更好地評(píng)估生命系統(tǒng)。

結(jié)合生物、藥學(xué)學(xué)科特點(diǎn)以及研究生科研項(xiàng)目需求，本實(shí)驗(yàn)以生物信息學(xué)技術(shù)結(jié)合GC-MS對(duì)銅綠假單胞菌胞內(nèi)代謝物進(jìn)行定性分析，通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使學(xué)生掌握氣質(zhì)聯(lián)用儀工作原理，熟悉生物信息數(shù)據(jù)挖掘方法和化合物定性分析檢測(cè)技術(shù)。

1 實(shí)驗(yàn)教學(xué)方案

1.1 實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)面向生物專業(yè)、藥學(xué)專業(yè)本科生及一年級(jí)藥物分析學(xué)研究生開設(shè)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容設(shè)計(jì)要在學(xué)生掌握基本知識(shí)與技能基礎(chǔ)上，提高學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過程中的主動(dòng)性，挖掘?qū)嶒?yàn)分析結(jié)果的創(chuàng)造性。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容不僅包含數(shù)據(jù)挖掘分析，還涉及儀器分析中氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法的應(yīng)用，因而實(shí)驗(yàn)課程分為生物信息學(xué)數(shù)據(jù)挖掘及代謝產(chǎn)物定性鑒別兩部分構(gòu)成。本實(shí)驗(yàn)以大型精密儀器為教學(xué)平臺(tái)，結(jié)合微生物樣本和學(xué)科前沿內(nèi)容而開設(shè)，有利于充分建立不同學(xué)科專業(yè)知識(shí)間聯(lián)系，體現(xiàn)學(xué)科之間交叉性，提高學(xué)生實(shí)踐能力。

1.2 實(shí)驗(yàn)基本原理

基因表達(dá)的綜合性（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫是生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)的重要基礎(chǔ)，它接收和管理各研究機(jī)構(gòu)提交的基因芯片或測(cè)序技術(shù)獲得的不同生理、病理狀態(tài)等基因表達(dá)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)選取GSE65882 數(shù)據(jù)芯片和GPL84（Affymetrix Pseudomonas aeruginosa Array）平臺(tái)，利用GEO2R 在線分析工具比較芯片中兩組樣品，以鑒定在整個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下差異表達(dá)基因［13］。獲得的大量差異表達(dá)基因通過KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書）數(shù)據(jù)庫，利用富集分析篩選與研究相關(guān)信號(hào)通路，為后續(xù)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)提供思路。

GC-MS主要由氣相色譜-接口-質(zhì)譜儀組成。樣品經(jīng)進(jìn)樣口高溫霧化后進(jìn)入毛細(xì)管色譜柱，利用不同組分在兩相間吸附能力、分配系數(shù)等不同性質(zhì)使不同組分得到分離。分離后各組分通過毛細(xì)管柱直接連接法進(jìn)入質(zhì)譜儀。質(zhì)譜儀主要由離子源、質(zhì)量分析器和檢測(cè)器3 部分構(gòu)成。電子轟擊電離源（EI）作為應(yīng)用最廣泛的一種離子源，其電離效率高、能量分散小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作方便；得到的特征性質(zhì)譜圖對(duì)化合物結(jié)構(gòu)鑒別和解析十分有利。質(zhì)量分析器將電離室中離子按質(zhì)荷比（m／z）大小分開進(jìn)入檢測(cè)器，最后在檢測(cè)器將離子束轉(zhuǎn)變成放大后的電信號(hào)。計(jì)算機(jī)將采集到的每個(gè)質(zhì)譜的所有離子相加得到總離子強(qiáng)度，其隨時(shí)間變化形成的曲線作為總離子流色譜圖（TIC），從而推斷每個(gè)色譜峰分子結(jié)構(gòu)相關(guān)信息。

由于GC-MS適用于分離分析具有揮發(fā)性物質(zhì)，對(duì)揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)不能直接進(jìn)樣分析，因而常對(duì)樣品進(jìn)行衍生化反應(yīng)，取代分子中的活潑氫來降低化合物極性。硅烷化反應(yīng)在GC分析中常用來對(duì)樣品進(jìn)行前處理，化合物中羥基或氨基上活潑氫與硅烷化試劑中的烷基硅烷基發(fā)生交換，形成烷基硅烷基產(chǎn)物。常用的硅烷化類型有三甲基硅烷化（-TMS）和叔丁基二甲基硅烷化（-TBDMS）。烷基硅烷基產(chǎn)物其極性減弱，被測(cè)能力增強(qiáng)，熱穩(wěn)定性提高而有利于GCMS對(duì)其分離分析。各產(chǎn)物經(jīng)國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（NIST）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒定后，通過KEGG數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證差異表達(dá)基因信號(hào)通路富集分析結(jié)果。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器和材料

（1）實(shí)驗(yàn)儀器。Clarus SQ8 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國珀金埃爾默公司）、AS5150A 超聲儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）、TGL-16B 離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、XS205 精密電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

（2）實(shí)驗(yàn)材料。鹽酸、吡啶、N，O-雙三甲硅基乙酰胺（BSA）均由成都市科隆化學(xué)品有限公司提供、色譜乙腈（美國Fisher公司）；銅綠假單胞菌凍干菌絲體（由成都大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供）。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

（1）差異表達(dá)基因的篩選。采用GEO2R 在線分析工具（https：／ ／www.ncbi.nlm.nih.gov／geo／geo2r／）對(duì)GSE65882 數(shù)據(jù)芯片進(jìn)行分析。4 個(gè)對(duì)照組樣本（GSM1608059、GSM1608060、GSM1608061、GSM1608062）和6 個(gè)樣品組樣本（GSM1608067、GSM1608068、GSM1608069、GSM1608070、GSM1608071、GSM1608072）篩選銅綠假單胞菌差異表達(dá)基因，其中P＜0.05，＞1 的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因。

（2）差異表達(dá)基因KEGG通路分析。將差異表達(dá)基因?qū)隓AVID（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）數(shù)據(jù)庫（http：／ ／david.ncifcrf.gov／）中進(jìn)行KEGG 通路分析，以P＜0.05作為標(biāo)準(zhǔn)篩選得到銅綠假單胞菌KEGG關(guān)鍵信號(hào)通路［14］。

（3）樣品的準(zhǔn)備。精確稱取菌絲體樣品2 mg，加入100 μL 0.1% HCl-乙腈溶液。超聲處理10 min后，加入100 μL BSA 和100 μL 吡啶。60 ℃反應(yīng)30 min后離心，將上清液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中進(jìn)行GC-MS分析。

（4）GC-MS 色譜條件。氣相色譜采用PerkinElmer clarus680 系統(tǒng)，色譜柱為PerkinElmer Elite-5 ms毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；柱溫箱初始溫度設(shè)置為50 ℃，保持5 min 后以10 °C／min速度升溫至180 ℃，隨后以15 °C／min速度升溫至300℃，保持5 min。進(jìn)樣口溫度為200 ℃；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積1 μL；載氣為高純氦氣，流速為1.5 mL／min。質(zhì)譜采用PerkinElmer Clarus SQ8 MS 質(zhì)譜儀，離子源為電子轟擊離子源（EI）200 ℃，離子化能量70 eV；傳輸線溫度220 ℃；掃描方式為全掃描；掃描范圍50～500 amu。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 差異表達(dá)基因及KEGG通路分析

GSE65882 芯片利用GEO2R 工具共篩選出3 138個(gè)差異表達(dá)基因，其中2 199 個(gè)為上調(diào)基因，939 個(gè)為下調(diào)基因。3 138 個(gè)差異表達(dá)基因中篩選出含有標(biāo)準(zhǔn)基因名基因1 020 個(gè)，經(jīng)KEGG富集分析，以P＜0.05為篩選條件，共得到13 個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路：代謝途徑（Pae01100）、抗生素生物合成（Pae01130）、次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成（Pae01110）、氨基酸生物合成（Pae01230）、氧化磷酸化（Pae00190）、不同環(huán)境中微生物代謝（Pae01120）、碳代謝（Pae01200）、糖酵解／糖異生（Pae00010）、氮代謝（Pae00910）、嘧啶代謝（Pae00240）、檸檬酸循環(huán)（TCA 循環(huán)）（Pae00020）、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（Pae00260）、氨基糖和核苷酸糖代謝（Pae00520），結(jié)果見圖1。

圖1 差異表達(dá)基因及其KEGG通路分析結(jié)果

2.2 GC-MS定性分析

采用GC-MS對(duì)樣品中成分進(jìn)行分析鑒定。通過NIST17 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對(duì)各色譜峰進(jìn)行鑒定。分離鑒定出的9 種氨基酸類化合物見圖2 和表1。以橫坐標(biāo)為質(zhì)荷比m／z，縱坐標(biāo)為相對(duì)豐度，得到丙氨酸硅烷化反應(yīng)后特征離子峰m／z＝73，116，147，190；纈氨酸硅烷化反應(yīng)后特征離子峰m／z＝73，144，218；異亮氨酸硅烷化反應(yīng)后特征離子峰m／z＝73，158，218，232；甘氨酸硅烷化反應(yīng)后特征離子峰m／z＝73，147，174，248，276；絲氨酸硅烷化反應(yīng)后特征離子峰m／z＝73，147，204，218，278；焦谷氨酸硅烷化反應(yīng)后特征離子峰m／z＝73，147，156，230，258；苯丙氨酸硅烷化反應(yīng)后特征離子峰m／z＝73，192，218；鳥氨酸硅烷化反應(yīng)后特征離子峰m／z＝73，142，174；賴氨酸硅烷化反應(yīng)后特征離子峰m／z＝73，128，156，174，230，317。以質(zhì)譜峰的特征離子碎片作為定性依據(jù)，對(duì)樣品進(jìn)行定性分析，并讓學(xué)生發(fā)現(xiàn)m／z＝73 或147 為三甲基硅烷基碎片特征峰，引導(dǎo)學(xué)生使用NIST17 數(shù)據(jù)庫對(duì)未知化合物進(jìn)行鑒定。

表1 鑒定出的9 種氨基酸類化合物

圖2 9種氨基酸GC-MS總離子流色譜圖與質(zhì)譜圖

通過鑒定出的9 種氨基酸類化合物，導(dǎo)入MBROLE2.0 數(shù)據(jù)庫，以pseudomonas aeruginosa PAO1為生物背景進(jìn)行KEGG 富集分析［15-16］。結(jié)果可得9種氨基酸都參與了代謝途徑（Pae01100）過程。甘氨酸和絲氨酸同時(shí)參與了甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸（Pae00260）代謝過程。通過GC-MS 對(duì)各化學(xué)成分的定性鑒別，學(xué)生能將定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與生物信息學(xué)分析推論得到信號(hào)通路結(jié)合在一起，驗(yàn)證KEGG 信號(hào)通路富集結(jié)果的可靠性。同時(shí)，樣品中其他未鑒定成分的定性分析，能激發(fā)學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)探索的興趣。

3 教學(xué)實(shí)踐要點(diǎn)

本實(shí)驗(yàn)課程是在微生物實(shí)驗(yàn)和儀器分析實(shí)驗(yàn)課程基礎(chǔ)上而開設(shè)，由于本實(shí)驗(yàn)課程難點(diǎn)在于實(shí)驗(yàn)內(nèi)容多，學(xué)科知識(shí)交叉廣，并且大部分本科生以及一年級(jí)研究生對(duì)儀器設(shè)備接觸較少，因此很難在短時(shí)間內(nèi)理解并掌握儀器原理及操作，又能把實(shí)驗(yàn)結(jié)果與生物信息學(xué)分析結(jié)果緊密聯(lián)系在一起。因此，本實(shí)驗(yàn)教學(xué)以“提出問題-解決問題-存在問題”為思路，利用思維導(dǎo)圖構(gòu)筑課堂筆記及實(shí)驗(yàn)記錄，鼓勵(lì)學(xué)生以實(shí)驗(yàn)小組為單位在有效時(shí)間內(nèi)將課堂中原理內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)過程整體體現(xiàn)在思維導(dǎo)圖中（見圖3）。

圖3 生物信息學(xué)與GC-MS實(shí)驗(yàn)原理思維導(dǎo)圖

本實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中教師對(duì)生物信息學(xué)及GC-MS概念和原理進(jìn)行講解后，提出如何建立兩者之間密切聯(lián)系，如何將生物信息分析結(jié)果與儀器檢測(cè)數(shù)據(jù)有機(jī)整合等問題。將以上問題帶入實(shí)驗(yàn)過程中，利用GCMS采集得到9 種氨基酸類代謝產(chǎn)物與GSE65882 芯片差異表達(dá)基因富集的信號(hào)通路建立關(guān)聯(lián)性，驗(yàn)證生物信息分析結(jié)果。同時(shí)，引導(dǎo)學(xué)生對(duì)其他未知代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性鑒定，利用代謝產(chǎn)物表征差異性探索與代謝相關(guān)的其他重要信號(hào)通路。實(shí)驗(yàn)完成后學(xué)生撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告，分析實(shí)驗(yàn)過程中存在問題，總結(jié)實(shí)驗(yàn)得失，對(duì)生物信息學(xué)及儀器分析知識(shí)要點(diǎn)進(jìn)行歸納與總結(jié)，形成學(xué)科交叉關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖，并且在實(shí)驗(yàn)報(bào)告中，通過數(shù)據(jù)分析處理結(jié)果，建立學(xué)科之間關(guān)聯(lián)性，對(duì)交叉學(xué)科實(shí)驗(yàn)心得體會(huì)進(jìn)行探討。

4 結(jié)語

在以前的學(xué)科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，學(xué)生實(shí)驗(yàn)內(nèi)容較單一且僅局限與本學(xué)科知識(shí)的掌握，因此實(shí)驗(yàn)教學(xué)相對(duì)簡(jiǎn)單，內(nèi)容單調(diào)，結(jié)果單薄，實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用分析不強(qiáng)。交叉學(xué)科實(shí)驗(yàn)具有創(chuàng)新性、綜合性、多樣性等特點(diǎn)，能夠培養(yǎng)出高層次、高素質(zhì)復(fù)合型人才，因此在各大高校大力推進(jìn)交叉學(xué)科人才培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)教學(xué)正是基于生物信息學(xué)技術(shù)與氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對(duì)銅綠假單胞菌胞內(nèi)代謝物進(jìn)行定性分析，通過GEO數(shù)據(jù)庫篩選目標(biāo)芯片獲得差異表達(dá)基因，利用代謝物分析結(jié)果驗(yàn)證差異表達(dá)基因富集信號(hào)通路。本實(shí)驗(yàn)具有知識(shí)點(diǎn)多綜合性強(qiáng)的特點(diǎn)，不僅能全面提升學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作能力、豐富實(shí)驗(yàn)技能、擴(kuò)充知識(shí)領(lǐng)域、提高科研能力，還能用于學(xué)生畢業(yè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，不但可以順利完成畢業(yè)實(shí)驗(yàn)，而且讓學(xué)生更多參與大型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行探索性及創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)，從而培養(yǎng)出符合社會(huì)需要的高素質(zhì)復(fù)合型人才。