飼料中添加肌醇對施氏鱘消化生理的影響

■張樹澤 王常安 陸紹霞 劉思源 王亞玲 劉紅柏 楊雨虹 徐奇友

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江哈爾濱 150070；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；3.湖州師范學(xué)院，浙江湖州 313000）

肌醇（myo-inositol, MI）存在于生物體內(nèi)的各種組織如肝臟、腎臟和腦中，由L-肌醇-磷酸合成酶催化，通過葡萄糖-6-磷酸環(huán)化成肌醇-1-磷酸，然后通過肌醇-1-磷酸酶進(jìn)行去磷酸化生成[1]。在體內(nèi)主要以磷脂酰肌醇的形式作為生物膜結(jié)構(gòu)的組分發(fā)揮著重要作用[2]。肌醇作為維持水生動物正常生理功能必需的營養(yǎng)素之一，與水溶性維生素相似，如生物素、維生素B1，肌醇可以促進(jìn)水產(chǎn)動物機(jī)體發(fā)育，還能降低血脂，促進(jìn)脂肪代謝[3-4]，被廣泛應(yīng)用于水生動物飼料中，對魚類的主要作用表現(xiàn)為提高飼料利用率，加快魚類生長，促進(jìn)肝臟和其他組織中的脂肪代謝[5]。肌醇不足會引起養(yǎng)殖魚類脂質(zhì)代謝紊亂，降低抗氧化、非特異性免疫能力和對病原菌的抵抗力。目前，國內(nèi)外對于肌醇的研究已經(jīng)在牙鲆（Paralichthys olivaceus）[6]、奧尼羅非魚（Oreochromis niloticus×Oreochromis aureus）[7]、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）[8]、建鯉（Cyprinus carpio var. jian）[9]等養(yǎng)殖魚類中展開，在施氏鱘中還未見報(bào)道。

施氏鱘在自然條件下主要分布于黑龍江水系中，是黑龍江地區(qū)特有的經(jīng)濟(jì)魚類之一，是我國鱘魚中最具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的優(yōu)質(zhì)珍稀魚類。魚體細(xì)長呈細(xì)紡錘形，裸露無鱗，背有5行大的菱形骨板，幼魚骨板帶有尖棘，為軟骨硬鱗魚。其身體背部呈棕灰色或褐色，幼魚為黑色或淺灰色，腹部均為白色。施氏鱘生長速度快，魚肉脂肪少，無刺，脊椎骨是軟骨，是具有非常高價(jià)值的食用魚類。根據(jù)2021年《中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》[10]記錄2020年鱘魚的總產(chǎn)量為104 280 t，中國已經(jīng)成為世界第一鱘養(yǎng)殖大國[11]。但規(guī)模化的養(yǎng)殖并沒有專業(yè)的飼料作為基礎(chǔ)，尤其是飼料的基礎(chǔ)配方方面更是缺乏細(xì)致的研究。目前的研究對于鱘蛋白質(zhì)[12]、脂肪[13]、碳水化合物[14]等營養(yǎng)成分的需求已經(jīng)基本確定，但肌醇對于施氏鱘的作用未有報(bào)道。本試驗(yàn)研究飼料中不同肌醇水平對施氏鱘消化系統(tǒng)組織結(jié)構(gòu)及消化酶活性的影響，為其飼料的配制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以酪蛋白和明膠為蛋白質(zhì)來源配制肌醇（阿拉丁，濃度99%）水平為28.75、127.83、343.83、565.81、738.15 mg/kg和936.28 mg/kg（分析值）的6種試驗(yàn)飼糧（G1、G2、G3、G4、G5、G6組），基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)水平見表1。干燥的原料通過60目篩（250 μm），在飼料攪拌機(jī)中徹底混合后均質(zhì)。此外，魚油90 g/kg 和適量的水添加到配料中，飼料混合物用制粒機(jī)（HX-200G，長沙廣和儀器公司）實(shí)驗(yàn)室制粒。粒徑1.0 mm，飼料在55 ℃的烘干機(jī)中干燥，直到水分含量減少到80～100 g/kg，密封在塑料袋中，-20 ℃冰箱保存待用。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 試驗(yàn)魚飼喂與管理

試驗(yàn)魚暫養(yǎng)14 d 后開始正式養(yǎng)殖試驗(yàn)。魚饑餓24 h 后，采用完全隨機(jī)分組，將平均體重為（11.90±0.12）g的魚分為6個(gè)處理組的18個(gè)水族箱中，每組3個(gè)重復(fù)。稱量每缸魚總重。每天人工投喂4次（08：00、11：00、14：00、17：00），近飽食。每天記錄飼料投喂量。試驗(yàn)在220 L循環(huán)水箱中進(jìn)行，流速約為1.0 L/s，試驗(yàn)持續(xù)56 d。試驗(yàn)期間，每天測定水的pH和溫度，每周測定溶解氧和氨氮含量。水溫為（23.0±0.5）℃，溶解氧為（8.65±0.08）mg/L，氨氮為（0.022±0.006）mg/L，pH為（7.10±0.05）。每天維持光照14 h。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將每箱試驗(yàn)魚饑餓24 h后，測量并記錄體重和體長。

1.3 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后，用苯氧乙醇（0.05%）麻醉。每處理組每重復(fù)隨機(jī)取4尾魚用于消化酶分析。于冰盤上分離肝胰腺、瓣腸及前、中腸（剔除內(nèi)含物和脂肪），生理鹽水洗凈，濾紙吸干，稱重。按1∶9重量體積比（W/V）加入預(yù)冷生理鹽水，以FJ-200CL高速組織勻漿機(jī)勻漿（15 000 r/min，3 min）稀釋，4 ℃條件下4 000 r/min 離心10 min，取上清液放入1.5 mL 離心管中，-80 ℃冷凍保存，用于測定前腸、中腸、瓣腸和肝胰腺的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性。

1.4 消化酶活性測定和組織切片觀察

消化酶活性：蛋白酶以福林-酚法測定，脂肪酶用聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法測定，淀粉酶采用淀粉-碘比色法[14]測定。

組織切片：每重復(fù)隨機(jī)取4尾魚的肝胰腺、前腸、中腸和瓣腸于Bouin’s液中固定48 h，常規(guī)石蠟包埋，用KD1508型切片機(jī)對樣本進(jìn)行橫向連續(xù)切片，切片厚度為6 μm，蘇木精-伊紅染色法染色，中性樹膠封片，Motic光學(xué)顯微鏡下測定前、中、瓣腸的絨毛高度和肌層厚度，每張切片測定10個(gè)絨毛高度和肌層厚度。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 19.0 進(jìn)行單因素方差分析和Duncan’s法多重比較，設(shè)置顯著性水平P＜0.05。試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示。根據(jù)施氏鱘腸道蛋白酶活性，采用線性回歸方程分析確定施氏鱘最佳肌醇添加量，飼料肌醇水平和腸道蛋白酶活性的關(guān)系式為y=ax+b，其中y代表蛋白酶活性，x代表飼料肌醇水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中肌醇的添加水平對施氏鱘蛋白酶活性的影響（見表2）

表2 飼料中肌醇的添加水平對施氏鱘蛋白酶活性的影響（n=3，U/g prot.）

由表2可知，前腸、中腸、瓣腸和肝胰腺中蛋白酶活性均受到不同程度的影響。其中，前腸蛋白酶活性在G4 組達(dá)到最大值，且顯著高于G1 組（P＜0.05）。中腸蛋白酶活性在G5 組最高并顯著高于G1 組（P＜0.05）。瓣腸中蛋白酶活性在G3組達(dá)到最大值且顯著高于G1組（P＜0.05）。肝胰腺蛋白酶活性在G4組達(dá)到最大值，且顯著高于G1組（P＜0.05）。

2.2 飼料中肌醇的添加水平對施氏鱘脂肪酶活性的影響（見表3）

從表3 可知，隨著飼料中肌醇含量的增加，施氏鱘腸道和肝胰腺脂肪酶活性呈現(xiàn)不同的變化趨勢。一定濃度范圍內(nèi)的肌醇對前腸脂肪酶活性無顯著影響（P＞0.05）。與對照組相比，高濃度的肌醇（G6組）添加可顯著提高施氏鱘前腸脂肪酶活性（P＜0.05）；高濃度肌醇（G5組和G6組）添加可顯著提高施氏鱘中腸脂肪酶活性（P＜0.05）。瓣腸中脂肪酶活性在G5組活性最高，并顯著高于其他組（P＜0.05）。肝胰腺中脂肪酶活性在G3組達(dá)到最大值并顯著高于G1組（P＜0.05）。

表3 飼料中肌醇的添加水平對施氏鱘脂肪酶活性的影響（n=3，U/g prot.）

2.3 飼料中肌醇的添加水平對施氏鱘淀粉酶活性的影響（見表4）

表4 飼料中肌醇的添加水平對施氏鱘淀粉酶活性的影響（n=3，U/g prot.）

從表4 可知，飼料中添加不同水平肌醇，對前腸淀粉酶活性均沒有顯著影響（P＞0.05）。隨著肌醇添加水平的增加，各組施氏鱘中腸淀粉酶活性均顯著高于G1組（P＜0.05），并在G6組達(dá)到最大值。G3組肝胰腺淀粉酶活性達(dá)到最大值且顯著高于其他組（P＜0.05）。瓣腸淀粉酶活性在G3組和G2組活性最高，并顯著高于其他組（P＜0.05）。

2.4 根據(jù)腸道蛋白酶活性確定施氏鱘最佳肌醇需要量（見圖1）

圖1 施氏鱘腸道蛋白酶活性與飼料肌醇水平線性回歸分析

由于在不同肌醇含量條件下，腸道淀粉酶和脂肪酶活性受肌醇影響相對于蛋白酶活性不顯著，即飼料肌醇水平主要影響腸道蛋白酶活性，因此根據(jù)腸道（前腸、中腸、瓣腸）蛋白酶活性確定施氏鱘的最佳肌醇添加量。

線性回歸模型分析表明：當(dāng)肌醇含量在501.36～729.72 mg/kg時(shí)，施氏鱘腸道蛋白酶活性最高。

2.5 飼料中肌醇的添加水平對施氏鱘腸道消化組織形態(tài)的影響（見表5～表6、圖2）

圖2 肝胰腺和腸道組織切片（10×）

由表5和表6可知，隨著飼料中肌醇含量的增加，對施氏鱘消化組織形態(tài)具有不同程度的影響。其中，前腸絨毛高度在G5 組達(dá)到最大值，且顯著高于其他組（P＜0.05）。中腸絨毛高度隨著肌醇添加量的增加而增加，在G5 組達(dá)到最大值。瓣腸絨毛高度隨著肌醇添加量的增加呈現(xiàn)先快速增長然后趨于平穩(wěn)的趨勢，在G3 組達(dá)到最大值并顯著高于G1 組（P＜0.05）。瓣腸的皺壁厚度均隨肌醇添加量的增加而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，瓣腸的作用效果比較明顯，G2～G6各組皺壁厚度均高于G1組（P＜0.05）。

表5 飼料中肌醇的添加水平對施氏鱘腸道絨毛高度的影響（n=3，μm）

表6 飼料中肌醇的添加水平對施氏鱘腸道皺襞厚度的影響（n=3，μm）

通過肝組織切片可以發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞間存在明顯界限，細(xì)胞核明顯（圖A、圖B）。隨著飼料中肌醇含量的增加，細(xì)胞間輪廓變得清晰（圖C、圖D）。肝細(xì)胞內(nèi)空泡化現(xiàn)在逐漸改善，細(xì)胞變得飽滿。

通過對前腸、中腸和瓣腸的組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，肌醇添加量較多的試驗(yàn)組絨毛發(fā)達(dá)，腸道絨毛明顯密集且沒有空泡，上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完成，排列整齊，G2、G3、G5、G6 組的前腸絨毛高度明顯高于G1 組（P＜0.05），且排列較為整齊。

3 討論

3.1 飼料中肌醇的添加水平對施氏鱘消化酶活性的影響

肌醇是動物細(xì)胞內(nèi)磷脂的構(gòu)成成分，能夠在脂肪代謝中起到促進(jìn)肝脂肪酶分解的作用，并能對蛋白酶、淀粉酶的分解產(chǎn)生積極影響[15-16]。本試驗(yàn)中，隨著飼料中肌醇添加水平的增加，中腸、肝胰腺脂肪酶活性、蛋白酶活性、淀粉酶活性均有較不同程度的提高，這一結(jié)果與Jiang 等[17]和馮琳等[18]對幼建鯉（Cyprinus carpio var.Jian）的研究結(jié)果一致，王雅平[19]在大菱鲆（Scophthalmus maximus）的研究中也取得了類似的結(jié)果，但肌醇添加量不同對本試驗(yàn)中施氏鱘前腸脂肪酶和蛋白酶活性影響并不明顯，這可能與肌醇對不同魚類的作用器官不同有關(guān)。張美彥[20]在哲羅鮭（Hucho taimen）的研究中發(fā)現(xiàn)肌醇缺乏導(dǎo)致胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等酶的活性顯著降低，缺乏肌醇的處理組魚體重和體長明顯降低，因此我們推測消化酶活性降低可能與肝胰臟的發(fā)育不良有關(guān)[21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加肌醇有效促進(jìn)了肝胰腺和腸道中淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶的分泌，進(jìn)而提高了施氏鱘對體內(nèi)脂肪和蛋白的分解效率。這可能與肌醇改變了腸黏膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)，改善了腸道脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)的過程有關(guān)[22]。哲羅鮭脂肪酶的含量也伴隨肌醇的增加而顯著升高。也有研究表明飼料中添加肌醇能夠促進(jìn)幽門盲囊和腸道中蛋白酶和脂肪酶的分泌，從而有助于哲羅鮭對蛋白質(zhì)和脂肪的分解，提高其對飼料的消化吸收能力[23]。Yone[24]報(bào)道，紅鯛（Red snapper）血清中肌醇儲存提高膽堿酯酶的活性，進(jìn)而提高了淀粉酶的活性。與其他試驗(yàn)結(jié)果不同的是，在對大西洋鮭[25]（Salmo salar）的研究中發(fā)現(xiàn)，肌醇的添加量并不影響大西洋鮭的消化酶活性，這可能是由于大西洋鮭中存在L-肌醇-1-磷酸合成酶和L-肌醇-3-磷酸合成酶，自身合成肌醇的能力已經(jīng)足夠，不需要進(jìn)行外源添加[26]，這在Burtle 等[27]對斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）和Boonyaratpalin等[28]對黑鱸（Micropterus salmoide）研究結(jié)果一致。綜上，日糧中適量的肌醇有助于施氏鱘體內(nèi)消化酶的分泌，對施氏鱘體內(nèi)消化具有促進(jìn)作用。

3.2 飼料中肌醇的添加水平對施氏鱘消化系統(tǒng)組織的影響

肌醇能夠改善魚類腸道健康，促進(jìn)魚類消化系統(tǒng)的發(fā)育[29]。腸道是魚類進(jìn)食后消化吸收的重要器官，其絨毛形態(tài)和肌層厚度將影響魚類的消化吸收能力[30-31]。腸道消化吸收能力通過腸組織絨毛的增長、上皮細(xì)胞的數(shù)量增多、增加消化和吸收的面積來提高[32]。飼料中添加肌醇后，腸道絨毛高度升高，但是隨著肌醇含量的增加，絨毛的高度呈現(xiàn)平穩(wěn)的趨勢，這可能是由于肌醇的含量達(dá)到飽和，多余的肌醇并不能對腸道絨毛的生長起到作用導(dǎo)致。已有研究表明，肌醇缺乏會導(dǎo)致幼建鯉肝胰臟重量和肝胰臟蛋白質(zhì)含量的降低，從而降低了幼建鯉的消化能力[33]。這可能與肌醇含量降低時(shí)幼建鯉腸道中嗜水氣單胞菌數(shù)量上升、有益乳酸桿菌含量降低有關(guān)[34]。也有報(bào)道稱，飼料中添加不同水平的肌醇后，建鯉的腸、肝胰臟功能得到了明顯的改善，這與本試驗(yàn)產(chǎn)生的結(jié)果具有相似的特征[35]。張旭等[36]在尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）飼料中添加維生素E后發(fā)現(xiàn)，其顯著改善了雌性尼羅羅非魚腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，絨毛寬度顯著提高，對雄性尼羅羅非魚的生長和消化也具有明顯的促進(jìn)作用。在團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）以及軍曹魚（Rachycentron canadum）的研究中也得到了相似的結(jié)論，適量的肌醇添加量可降低脂肪含量，從而能夠有效防止脂肪肝的發(fā)生，飼料中肌醇含量對軍曹魚的肝臟肌醇儲存產(chǎn)生了顯著影響，隨著飼料中肌醇含量的降低，肝臟蓄積量也呈現(xiàn)明顯降低的趨勢[37]，當(dāng)飼料中肌醇缺乏時(shí)，軍曹魚肝臟脂肪代謝會受阻，提高肌醇含量后，其肝臟的脂肪會逐漸減少到正常水平。綜上，飼料中添加適量肌醇可改善施氏鱘絨毛形態(tài)和皺襞高度，進(jìn)而提高施氏鱘的消化能力。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，飼料中添加適量肌醇[（501.36～729.72）mg/kg]可促進(jìn)施氏鱘腸道絨毛和皺襞的發(fā)育，提高施氏鱘蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，并能減少施氏鱘肝臟的空泡化現(xiàn)象，促進(jìn)細(xì)胞核發(fā)育，進(jìn)而改善腸道和肝臟健康。