仿生型低溫保護(hù)劑研究進(jìn)展

陳曦 ，李維杰 ，劉寶林*

(1-上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所，上海 200093；2-上海市腫瘤能量治療技術(shù)與器械協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200093；3-上海市生物資源低溫保存技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200093)

0 引言

在生物和醫(yī)學(xué)中，“低溫”是指低于正常體溫（37 ℃）直至低于4 K的溫度范圍[1]。低溫生物學(xué)是一門研究低溫條件下（0 ℃以下或接近0 ℃）生命現(xiàn)象以及生物體低溫保存的科學(xué)[2]。低溫保存技術(shù)是指將活的生物體采用特殊的方法冷卻至低溫（一般為-80 ℃或-196 ℃），并長期保存；待需要時，將生物體按特殊的方法加熱至正常溫度，仍可獲得活的生物體[3]。

在此項技術(shù)之中，低溫保護(hù)劑是必不可少的一個環(huán)節(jié)。1949年，英國生物學(xué)家POLGE等[4]偶然發(fā)現(xiàn)在低溫條件下，利用慢速冷凍甘油對精子具有保護(hù)特性，引起極大的反響，“低溫保存”一詞由此誕生。緊接著1959年，由于二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）比甘油滲透細(xì)胞速度更快，成為具有普適性的保護(hù)劑[5]。低溫保存技術(shù)已經(jīng)逐漸發(fā)展為細(xì)胞療法、組織工程、血液保存、輔助生殖和疫苗儲藏、生物樣本庫等生物醫(yī)學(xué)方面的基礎(chǔ)和保障[6]。隨著材料和化學(xué)的發(fā)展與進(jìn)步，天然無毒的低溫保護(hù)劑研發(fā)成為當(dāng)今的研究熱點。

本文從低溫冷凍保存機(jī)制、低溫保護(hù)劑種類作用、新型保護(hù)劑以及應(yīng)用幾方面來綜合講述低溫保護(hù)劑的研究現(xiàn)狀。

1 低溫保存冷凍損傷機(jī)制

細(xì)胞處于深低溫（-80 ℃或-196 ℃）時，絕大多數(shù)會失去活性甚至死亡。1972年，首次提出凍傷的“兩因素假說”[7]，一種是由于慢速冷卻，長時間暴露在溶液中的水轉(zhuǎn)化為冰，引起細(xì)胞內(nèi)外溶液的變化，細(xì)胞內(nèi)的滲透壓增加，細(xì)胞脫水死亡，為“溶液損傷”；另一種是由于快速冷卻，細(xì)胞內(nèi)形成冰晶以及緩慢升溫過程的重結(jié)晶增加，為“胞內(nèi)冰損傷”[8]。為了緩解低溫保存對生物材料造成的損傷，添加低溫保護(hù)劑尤為重要。

2 傳統(tǒng)低溫保護(hù)劑

如果細(xì)胞凍存時不加保護(hù)劑，復(fù)溫后細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，生理和生化功能受阻，復(fù)蘇存活率只有1%左右，甚至更低，因此添加低溫保護(hù)劑成為冷凍保存過程中必不可少的一個環(huán)節(jié)[9-10]。主要通過縮短相變時間、降低共熔點溫度和減少對細(xì)胞滲透膜的破環(huán)三個方面對細(xì)胞起到保護(hù)作用[11]。低溫保護(hù)劑根據(jù)是否能夠滲入細(xì)胞分為滲透性保護(hù)劑和非滲透性保護(hù)劑。

2.1 滲透性保護(hù)劑

常見的滲透性保護(hù)劑有醇類（甲醇、甘油、甘露醇、山梨醇、丙二醇、乙二醇和甲酰胺等[12]）、氨基酸類（天冬氨酸、谷氨酸和l-脯氨酸）、天然兩性離子分子（甜菜堿[13]和左旋肉堿[14]）和含硫有機(jī)化合物（DMSO）。此類物質(zhì)相對分子質(zhì)量較小，可以滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，改善細(xì)胞內(nèi)過冷的情況。同時由于它的分子結(jié)構(gòu)小容易與水結(jié)合，發(fā)生水合作用，形成氫鍵，弱化水的結(jié)晶過程，使細(xì)胞內(nèi)外滲透壓減少，溶液黏性增大，對“溶液損傷”起到緩解效果，起到了保護(hù)細(xì)胞的作用[15-16]。目前使用最為廣泛的是DMSO和甘油，但由于其毒性較大、不易洗脫，因此對天然無毒、具有生物相容性的低溫保護(hù)劑需求迫切。

2.2 非滲透性保護(hù)劑

常見的非滲透性保護(hù)劑有單糖（葡萄糖、果糖）、雙糖（海藻糖、蔗糖和乳糖）、多糖（棉子糖）以及相對分子質(zhì)量較大的高分子聚合物（羥乙基淀粉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇等）[17]。此類物質(zhì)具有較高的相對分子質(zhì)量，不能自由進(jìn)出細(xì)胞但溶于水，加入溶液之后出現(xiàn)過冷狀態(tài)，冰晶形成受到抑制。同時可以降低細(xì)胞外液的電解質(zhì)濃度，從而減少了陽離子進(jìn)入細(xì)胞的數(shù)量，減少胞內(nèi)冰的形成，從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用[8]。非滲透性保護(hù)劑使用的同時經(jīng)常需要搭配滲透性保護(hù)劑聯(lián)合使用，避免濃度過高對細(xì)胞造成毒性損傷的同時促進(jìn)細(xì)胞脫水。

3 仿生型低溫保護(hù)劑

3.1 抗凍蛋白

為了適應(yīng)冰點以下低溫環(huán)境，生物從生理、生化與基因等層面進(jìn)化出多種生存策略和機(jī)制，其中一種重要的生存策略便是合成抗凍蛋白（Antifreeze Protein，AFP）[18]。隨著研究的進(jìn)展，對抗凍蛋白有了更多的認(rèn)識。AFP的主要作用有熱滯活性、誘導(dǎo)結(jié)晶形態(tài)變化和抑制冰重結(jié)晶特性，從而保護(hù)細(xì)胞內(nèi)蛋白和細(xì)胞膜[19]。一方面熱滯活性指AFP可抑制冰晶生長，降低溶液的凍結(jié)溫度，且依數(shù)效應(yīng)的效果好。AFP的親水側(cè)鏈通過氫鍵結(jié)合到冰晶的棱柱面（優(yōu)先生長面）上，允許暴露的蛋白質(zhì)疏水側(cè)鏈以增加的表面自由能阻止冰的進(jìn)一步生長，產(chǎn)生雙錐或針狀冰晶[20]（如圖1）。此外，升溫過程中AFP抑制冰重結(jié)晶，使之形成細(xì)小均勻的冰晶。

圖1 AFPs控制冰晶生長

3.2 天然深共晶溶劑

深共晶溶劑為兩種或兩種以上組分的混合物，既可以是固體也可以是液體，并且在特定成分下，室溫熔點降低，原因是氫受體和氫鍵供體之間的絡(luò)合作用產(chǎn)生離域電子[21]。天然深共晶溶劑（Natural Deep Eutectic Solvents，NADES）的組成物主要是代謝物，存在于極端溫度環(huán)境下動物體內(nèi)[22]。脯氨酸與海藻糖組合的深共晶溶劑，在-50 ℃左右仍能保持液態(tài)，相較于純水結(jié)晶和熔融溫度降低，抑制冰晶生長，可作為低溫保護(hù)劑的替代品[23-24]。GERTRUDES等[23]研究發(fā)現(xiàn)海藻糖和甘油組合的天然深共晶溶劑對于L929細(xì)胞系具有保護(hù)作用（圖2）。NADES是一種無毒綠色替代品，可以代替冷凍保存過程中傳統(tǒng)低溫保護(hù)劑。

圖2 NADES低溫保存工藝

3.3 納米材料

與傳統(tǒng)的保護(hù)劑相比，納米材料保護(hù)劑由于其卓越的滲透性從而表現(xiàn)出更高的冷凍保護(hù)和有效性[25]。納米顆粒介導(dǎo)是胞內(nèi)遞送的一種新興的冷凍保存方法，依靠胞吞胞吐完成。刺激性響應(yīng)材料因為低毒性、快速響應(yīng)和容易制造等優(yōu)點，在凍存過程中發(fā)揮著極大的作用[26]。冷響應(yīng)聚合物（聚N-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸丁酯共聚物）[27]、殼聚糖三聚磷酸鈉納米顆粒用來輸送海藻糖[28]，提高解凍后的細(xì)胞存活率。

3.4 聚電解質(zhì)

聚電解質(zhì)是一類既帶正電荷又帶負(fù)電荷的特殊聚合物，它們可以是中性電荷，也可以是凈電荷；兩性離子聚合物，在正常pH條件下，凈電荷通常為零。在凍存過程中需要玻璃化，使細(xì)胞適當(dāng)脫水，減少冰晶尺寸，不僅重結(jié)晶抑制能力高且對細(xì)胞膜有保護(hù)作用[29]（圖3）。

圖3 聚電解質(zhì)與細(xì)胞膜相互作用

甲基丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸共聚物、聚羧甲基甜菜堿[30]和各種二元共聚物可作為新型保護(hù)劑。

4 仿生型低溫保護(hù)劑的應(yīng)用

4.1 生殖細(xì)胞的應(yīng)用

低溫保護(hù)劑在生殖細(xì)胞方面的應(yīng)用起源于20世紀(jì)40年代首次發(fā)現(xiàn)甘油對保存精子具有顯著效果。既甘油的發(fā)現(xiàn)之后，相繼研究出許多小分子和大分子保護(hù)劑，脫脂奶粉在冷凍保存中對斑馬魚精子細(xì)胞質(zhì)膜完整性，氧化損傷和DNA都具有一定的保護(hù)作用[31]。羧甲基纖維素因含有羧甲基基團(tuán)，能增強(qiáng)水溶性，PAUL等[32]將其用于公羊精液的保存。TAKEUCHI等[33]發(fā)現(xiàn)兩性高分子化合物羧化聚賴氨酸（Carboxylated Poly-l-Lysine，CPLL）作為大分子冷凍保護(hù)劑，采用0.3%CPLL+7%甘油配比對冷凍保存人類精子有顯著效果。

抗凍蛋白的加入能提高鯛魚精子存活率、運動性和直線速度[34]，由于L-脯氨酸低聚物具有與抗凍糖蛋白相同的PPII螺旋結(jié)構(gòu)，QIN等[35]將L-脯氨酸低聚物低溫保存卵母細(xì)胞明顯提高存活率和穩(wěn)定性。蛋黃是精液儲存和冷凍保存補(bǔ)充劑的主要成分，F(xiàn)OROUZANFAR等[36]研究表明大豆卵磷脂可以作為蛋黃的替代品進(jìn)行細(xì)胞冷凍，1%大豆卵磷脂和7%甘油作為保護(hù)劑之后，細(xì)胞存活率最高。隨著近些年的研究，應(yīng)用于生殖細(xì)胞和胚胎方面的低溫保護(hù)劑越來越多。

4.2 體細(xì)胞的應(yīng)用

我國對紅細(xì)胞的低溫冷凍保存研究中，甘油是目前使用最廣泛的低溫保護(hù)劑，但由于濃度較大、洗脫步驟繁瑣，尋找天然相容性較好的保護(hù)劑尤為重要[37-38]。L-脯氨酸和改性γ-聚谷氨酸和海藻糖的天然保護(hù)劑組合[39-40]、天然兩性離子分子甜菜堿、左旋肉堿抑制冰晶生長[14,41]，解凍后溶血率降低；由于天然兩性離子分子的出現(xiàn)，BAILEY等[42]合成聚兩性電解質(zhì)聚（甲基乙烯醚-馬來酸酐）通過保護(hù)細(xì)胞膜，解凍后存活率可達(dá)80%。基于糖肽和海藻糖的膜穩(wěn)定作用合成的生物相容性糖肽，LIU等[43]將綿羊紅細(xì)胞冷凍活力提高到75%，緊接著發(fā)現(xiàn)紅景天苷的加入減輕了冷凍保存之后綿羊紅細(xì)胞的氧化損傷[44]。STOLL等[45]發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體、海藻糖和羥乙基淀粉對紅細(xì)胞具有協(xié)同保護(hù)作用，MITCHELL等[46]首次提出高羥基化嵌段共聚物蠕蟲被證明是羥乙基淀粉的合適替代品。金屬有機(jī)骨架納米粒子[47]、硫基糖苷、芳基糖苷[48-49]和聚乙烯醇[50]可以輔助紅細(xì)胞的冷凍保存。

低溫保護(hù)劑在其他小尺寸細(xì)胞中也有很豐富的應(yīng)用，OGAWA等[51]研究發(fā)現(xiàn)果聚糖可以作為胎牛血清的替代冷凍保護(hù)劑，凍存小鼠雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞存活率可達(dá)97.1%，首次發(fā)現(xiàn)蠶繭中的絲素蛋白冷凍人骨源性間充質(zhì)干細(xì)胞，不僅調(diào)節(jié)冰晶尺寸還具有抑制重結(jié)晶的作用，存活率達(dá)到81.28%[52]。JOCHMANS等[53]發(fā)現(xiàn)改良過的6-羥基氯丙醇衍生物對造血干細(xì)胞、脂肪組織衍生干細(xì)胞能避免凍存中細(xì)胞死亡的情況。MATSUMURA等[54]利用具有7%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氨基和羧基混合而成的聚兩性電解質(zhì)ε-聚賴氨酸凍保存鼠L929細(xì)胞。RAJAN等[30]的實驗室設(shè)計了其他多聚兩性電解質(zhì)保護(hù)劑，如DMAEMA-MAA（1:1）和右旋糖酐聚兩性電解質(zhì)，實現(xiàn)解凍后L929細(xì)胞存活率高達(dá)95%以上，且毒性低、解凍后無需去除。KURODA等[55]發(fā)現(xiàn)一種含有組氨酸類物質(zhì)的兩性離子液體對質(zhì)膜有親和力，防止出現(xiàn)胞內(nèi)冰，作用機(jī)制與聚電解質(zhì)相同。睢曉潔等[56]利用天然滲透壓調(diào)節(jié)劑氯化三甲胺采用超速冷凍方法對人肺癌細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行超低溫保存。NK細(xì)胞和T細(xì)胞系在免疫治療具有巨大潛力。ASSAL等[57]使用葡聚糖和聚賴氨酸對NK細(xì)胞慢速凍存，效果與DMSO相當(dāng)；T細(xì)胞系在蔗糖、甘油和異亮氨酸的組合保護(hù)劑下胞內(nèi)冰有所減少[58]。

4.3 組織切片、器官的應(yīng)用

針對于組織工程、器官移植的冷凍保存也是研究熱點之一，包括軟骨、血管、角膜和腎臟等，冷凍方法和低溫保護(hù)劑的種類越來越多。二甲基亞砜對于人小口徑動脈凍存效果好于甘油、丙二醇和乙二醇[59]。MANUCHEHRABADI等[60]利用磁性氧化鐵納米顆粒，提高了生物相容性，并成功實現(xiàn)了大規(guī)模生物樣品（80 mL）的超低溫保存。

腎臟移植過程不經(jīng)過冷凍保存血管腔室會受到損傷，需要低溫保護(hù)劑灌注，選擇特定濃度的灌注液配方，溫度和緩沖液極為重要[61]。MULLER等[62]提出，在循環(huán)死亡和腦死亡后，低溫含氧灌注下的器官均比原始移植方法移植的器官在功能維持的情況下有更高的移植成活率。

5 結(jié)論

本文研究了仿生型低溫保護(hù)劑的研究進(jìn)展及其在生物領(lǐng)域的應(yīng)用，得出如下結(jié)論：

1）低溫保護(hù)劑在低溫生物學(xué)合低溫保存過程的應(yīng)用已經(jīng)相對成熟，在更復(fù)雜的組織和器官仍需要進(jìn)一步研究更有效的保護(hù)劑；

2）將來臨床需求將推動低溫保存向更高水平發(fā)展，即細(xì)胞的大規(guī)模體積保存、組織和器官保存甚至人體保存的探索；

3）仿生型低溫保護(hù)劑由于生物安全性高，保存效果好，必將應(yīng)用于更多的領(lǐng)域，同時隨著材料科學(xué)和生命科學(xué)的持續(xù)發(fā)展，必將有更多的新型仿生型保護(hù)劑應(yīng)用于低溫生物領(lǐng)域。