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    甘草甜素對人急性髓系白血病細胞增殖、凋亡及AMPK/MTOR信號通路的影響▲

    2022-09-01 03:05:16朱春霞李成龍
    廣西醫(yī)學 2022年13期
    關鍵詞:貨號甘草低劑量

    蔣 鑫 王 希 朱春霞 李成龍

    (都江堰市人民醫(yī)院1 血液科,2 檢驗科,四川省都江堰市 611830;3 四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院血液內(nèi)科,四川省成都市 610031)

    急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是由髓樣祖細胞引起的致死性血液惡性腫瘤,是成人最常見的急性白血病類型,其特征是處在不同階段的髓樣祖細胞成熟停滯而惡性增殖,同時白血病細胞凋亡受損,這是一種異質(zhì)性疾病,可導致人類造血細胞的整體減少[1-3]?;熃Y合造血干細胞移植是AML的首選治療方法,也是其主要治療方法[4]。雖然目前治療技術取得了很大進步,但治療后AML患者的復發(fā)率很高,總生存率仍然很低[5]。因此,尋找新的治療方法以降低復發(fā)率,對于提高AML患者的生存率極為重要。甘草甜素也稱為甘草酸,是甘草的有效成分,它具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤和保肝等多種藥理特性[6]。Hibasami等[7]研究發(fā)現(xiàn),甘草甜素可誘導人AML細胞 HL-60發(fā)生凋亡。腺苷單磷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,MTOR)信號通路在細胞生長、增殖、凋亡、遷移等過程中具有重要作用[8]。抑制MTOR并激活AMPK的藥物在治療AML方面具有很好的應用前景[9]。目前關于甘草甜素對AMPK/MTOR信號通路的作用鮮見報告。因此,本研究探究甘草甜素對AML細胞HL-60增殖和凋亡的影響,并分析其是否通過AMPK/MTOR通路發(fā)揮作用。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑 HL-60細胞購自中國科學院細胞庫。CCK-8試劑盒購自美國Abcam公司(貨號:ab228554)。Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(貨號:C1062)、Hoechst 33342染色液(貨號:C1025)均購自上海碧云天生物有限公司。B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)一抗(貨號:15071)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)一抗(貨號:89477)、MTOR一抗(貨號:2983)、磷酸化MTOR(phosphorylated MTOR,p-MTOR)一抗(貨號:5536)、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)一抗(貨號:13110)、細胞周期蛋白D1(cyclin D1)一抗(貨號:55506)、活化型Caspase3(cleaved Caspase-3)一抗(貨號:9664)、羊抗兔二抗(貨號:7074)、β-actin一抗(貨號:4970)均購自美國Cell Signaling Technology公司。AMPK一抗(貨號:MA5-15815)、磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK,p-AMPK)一抗(貨號:44-1150G)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。RPMI 1640完全培養(yǎng)基(貨號:31800022)、胎牛血清(貨號:S9020)均購自北京索萊寶科技有限公司。甘草甜素[純度≥98%(高效液相色譜法);貨號:IG0730]和二甲基亞砜(純度>99.5%;貨號:D8371)均購自北京索萊寶科技有限公司。碘化丙啶(純度≥94.0%;產(chǎn)品編號:ST1569)購自上海碧云天生物有限公司。

    1.2 實驗儀器 Forma CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司,ZS-AE7S型中生流式細胞儀購自中生(蘇州)醫(yī)療科技有限公司,BX53型電子熒光顯微鏡購自日本Olympus公司,GelDoc XR型凝膠成像儀、550型全自動酶標儀均購自美國Bio-Rad公司。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 細胞培養(yǎng)與分組干預:復蘇HL-60細胞后,使用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基,置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),連續(xù)傳代,培養(yǎng)至生長對數(shù)期備用。將處于生長對數(shù)期的細胞分為對照組、甘草甜素低劑量組、甘草甜素中劑量組、甘草甜素高劑量組,在甘草甜素低、中、高劑量組細胞中分別加入終濃度為0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL的甘草甜素,在對照組細胞中加入等體積的二甲基亞砜。

    1.3.2 CCK-8法評估細胞增殖情況:將HL-60細胞接種于96孔板中,接種密度為2×104個/孔,按1.3.1方法處理各組細胞,48 h后每孔分別加入10 μL的CCK-8溶液,設3個復孔。在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育4 h后,使用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度值。計算存活率(%)=實驗組單個樣本吸光度值/對照組所有樣本平均吸光度值×100。實驗重復6次。

    1.3.3 細胞克隆實驗:將細胞以400個/孔接種于6孔板,使其均勻分布。按照1.3.1方法處理細胞,24 h后取出細胞制成細胞懸液,再將細胞懸液置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1周后,使用多聚甲醛固定細胞,1%結晶紫染色。計數(shù)每組的細胞克隆數(shù),以>25個細胞聚集時設定為1個有效細胞克隆。實驗重復6次。

    1.3.4 流式細胞術分析細胞凋亡情況:將HL-60細胞以5×104個/mL、2 mL/孔接種于6孔板中,按照1.3.1方法處理各組細胞,設3個復孔,48 h后收集細胞并用預冷的PBS洗滌細胞3次,30 s/次,然后將細胞重懸于含有Annexin Ⅴ的FITC和碘化丙啶結合的緩沖液中,在室溫下孵育15 min,使用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。實驗重復6次。

    1.3.5 Hoechst 33342染色法檢測細胞凋亡情況:將HL-60細胞以2×105個/mL、2 mL/孔接種于6孔板中,按照1.3.1方法處理各組細胞,設3個復孔,48 h后收集細胞,使用PBS清洗30 s后,用4%多聚甲醛固定細胞10 min,再用PBS清洗30 s,隨后在室溫下用Hoechst 33342避光染色細胞10 min,再次使用PBS清洗后置于熒光顯微鏡下觀察拍照。隨機選取5個視野,在400倍鏡下進行觀察。若觀察到細胞核碎裂或細胞皺縮,則判定為凋亡的細胞。實驗重復6次。

    1.3.6 Western blot分析蛋白表達水平:將HL-60細胞以2×105個/mL、2 mL/孔接種于6孔板中,按照1.3.1方法處理各組細胞,設3個復孔,48 h后收集細胞。用預冷的PBS洗滌細胞3次,30 s/次,加入蛋白酶抑制劑和細胞裂解液提取細胞總蛋白并檢測蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白后,將蛋白轉移到PVDF膜上。使用5%脫脂奶粉在室溫下封閉PVDF膜2 h,然后4 ℃孵一抗(PCNA、cyclin D1、Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、AMPK、p-AMPK、MTOR、p-MTOR的稀釋倍數(shù)為1 ∶500,β-actin的稀釋倍數(shù)為(1 ∶1 000)過夜,用TBST洗膜3次,10 min/次,然后在室溫下孵育二抗(稀釋倍數(shù)為1 ∶2 000)2 h,再次用TBST洗膜3次,10 min/次,通過增強化學發(fā)光檢測試劑曝光顯色,以β-actin為內(nèi)參蛋白,使用凝膠成像系統(tǒng)進行分析灰度值,以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為目的蛋白相對表達水平。實驗重復6次。

    1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

    2 結 果

    2.1 甘草甜素對HL-60細胞增殖的影響 4組HL-60細胞存活率差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),對照組、甘草甜素低劑量組、甘草甜素中劑量組、甘草甜素高劑量組的HL-60細胞存活率依次降低(均P<0.05)。見表1。

    表1 4組HL-60細胞存活率的比較(x±s,%)

    2.2 甘草甜素對HL-60細胞克隆形成的影響 4組的HL-60細胞有效克隆數(shù)差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),對照組、甘草甜素低劑量組、甘草甜素中劑量組、甘草甜素高劑量組的HL-60細胞有效克隆數(shù)依次減少(均P<0.05)。見表2。

    表2 4組HL-60細胞有效克隆數(shù)的比較(x±s,個)

    2.3 甘草甜素對HL-60細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測結果顯示,4組HL-60細胞的凋亡率差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),對照組、甘草甜素低劑量組、甘草甜素中劑量組、甘草甜素高劑量組HL-60細胞的凋亡率依次升高(均P<0.05),見圖1和表3。Hoechst 33342染色結果顯示,與對照組相比,甘草甜素各劑量組中核碎片和凝結的HL-60細胞比例明顯增加,HL-60細胞凋亡率升高,見圖2。

    圖1 流式細胞儀檢測結果

    表3 4組HL-60細胞凋亡率的比較(x±s,%)

    圖2 Hoechst 33342染色結果(×400)

    2.4 甘草甜素對HL-60細胞增殖相關蛋白表達水平的影響 4組HL-60細胞的PCNA、cyclin D1蛋白表達水平差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),對照組、甘草甜素低劑量組、甘草甜素中劑量組、甘草甜素高劑量組HL-60細胞的PCNA、cyclin D1蛋白表達水平依次降低(均P<0.05)。見圖3和表4。

    圖3 4組增殖相關蛋白的表達情況

    表4 4組細胞增殖相關蛋白相對表達水平的比較(x±s)

    2.5 甘草甜素對HL-60細胞凋亡相關蛋白表達水平的影響 4組HL-60細胞Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達水平差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),對照組、甘草甜素低劑量組、甘草甜素中劑量組、甘草甜素高劑量組的HL-60細胞Bcl-2蛋白表達水平依次降低,Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達水平依次升高(均P<0.05)。見圖4和表5。

    圖4 4組凋亡相關蛋白的表達情況

    表5 4組細胞凋亡相關蛋白相對表達水平的比較(x±s)

    2.6 甘草甜素對HL-60細胞AMPK/MTOR通路相關蛋白表達水平的影響 4組HL-60細胞的p-AMPK、p-MTOR蛋白表達水平差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),對照組、甘草甜素低劑量組、甘草甜素中劑量組、甘草甜素高劑量組的HL-60細胞p-AMPK蛋白表達水平依次升高(均P<0.05),p-MTOR蛋白表達水平依次降低(均P<0.05)。但4組HL-60細胞的AMPK和MTOR蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見圖5和表6。

    圖5 4組 AMPK/MTOR通路相關蛋白的表達情況

    表6 4組均AMPK/MTOR通路相關蛋白相對表達水平的比較(x±s)

    3 討 論

    AML是一組異質(zhì)性造血系統(tǒng)疾病,其特征為多種遺傳/表觀遺傳變異,以及造血干細胞和髓系祖細胞分化、增殖和自我更新的改變[10]?;熓侵委烝ML最常用的方法,但它也會殺死正常細胞,從而引起多種不良反應[11]。研發(fā)替代治療策略以降低化療引起的不良反應,具有重要意義。甘草甜素是甘草根的成分,是一種三萜皂苷[12]。已知甘草甜素的抗癌機制包括抑制細胞增殖、轉移,以及誘導細胞周期停滯、凋亡[13]。研究表明,甘草甜素可抑制人食管癌細胞ECA109和肝癌細胞MHCC97-H的增殖[14-15],并能夠以時間和劑量依賴性的方式抑制前列腺癌細胞的增殖[16]。本研究結果顯示,給予甘草甜素干預后,HL-60細胞生長受到抑制,與增殖相關的PCNA、cyclin D1蛋白表達水平均降低(均P<0.05),且具有一定的劑量依賴性,表明甘草甜素可抑制HL-60的細胞增殖,對AML具有一定的治療作用。

    凋亡是一種細胞死亡過程,受不同分子機制的調(diào)節(jié),其中Caspase在凋亡的激活中起著至關重要的作用。人類癌癥細胞的基本特征之一是逃避凋亡,這使得腫瘤進一步發(fā)展并對治療產(chǎn)生抵抗性[17]。有學者發(fā)現(xiàn),甘草甜素可以促進口腔鱗狀細胞癌細胞、肝癌細胞的凋亡[18-19]。Bcl-2蛋白家族包括促凋亡蛋白Bad、Bid、Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x、Mcl-1。Bcl-2可通過介導線粒體釋放細胞色素C至細胞質(zhì)來調(diào)控細胞凋亡,從而激活下游無活性的Caspase-9并使Caspase-3和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶活化,進而誘導細胞凋亡[20-21]。本研究結果顯示,與對照組相比,甘草甜素各劑量組的HL-60細胞凋亡率升高,Bcl-2蛋白表達水平下調(diào),cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達水平上調(diào),且呈劑量依賴關系,表明甘草甜素可調(diào)控凋亡相關蛋白的表達,促進HL-60細胞凋亡。

    AML細胞的增殖與AMPK/MTOR信號通路密切相關。AMPK是一種細胞能量傳感器,是調(diào)節(jié)細胞能量和代謝的關鍵因子,可通過調(diào)節(jié)多個下游信號分子促進細胞凋亡,在髓系惡性腫瘤的促分化中發(fā)揮重要作用[22]。MTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶,激活AMPK可抑制MTOR信號傳導并促進細胞凋亡,從而發(fā)揮抗腫瘤效應[23]。有研究顯示,辛伐他汀對鼻咽癌CNE-2細胞增殖的抑制作用和細胞凋亡的促進作用與AMPK/MTOR信號通路有關[24];而亞硒酸鈉可激活AMPK,抑制MTOR活化,從而促進結直腸癌HT-29細胞凋亡[25]。本研究結果顯示,在甘草甜素作用下,HL-60細胞的p-AMPK蛋白表達水平升高,p-MTOR蛋白水表達平降低,表明甘草甜素可促進AMPK磷酸化,抑制MTOR磷酸化水平,進而誘導細胞凋亡。

    綜上所述,甘草甜素有效抑制HL-60細胞增殖、促進細胞凋亡,且呈一定的劑量依賴性,其機制可能與促進AMPK的磷酸化水平、抑制MTOR磷酸化有關。

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