金絲桃苷-環(huán)糊精包合物的制備及其抗氧化活性研究

張馨予 蘇建青 褚秀玲

(聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，聊城 252000)

黃酮類物質(zhì)具有很強的抗氧化和抗炎活性，作為飼料添加劑可以提高飼料的營養(yǎng)價值。Muqier等[1]研究發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)飼糧中添加11～33 mg/kg的黃酮類化合物對肉羊的生長性能和神經(jīng)內(nèi)分泌激素水平有顯著影響，且呈時間依賴性，飼喂30 d后效果尤為明顯。Yuan等[2]研究發(fā)現(xiàn)，杜仲葉黃酮可以緩解敵草快誘導(dǎo)引起的仔豬炎癥和氧化應(yīng)激，還可以改善腸道損傷。金絲桃苷(hyperoside，Hyp)是天然黃酮醇苷類化合物的一種，現(xiàn)代藥理研究表明，Hyp具有抗炎、抗氧化、抗血栓、抗纖維化和鎮(zhèn)痛等多種藥理作用[3-5]，對心腦缺血、肝纖維化和心力衰竭等疾病有治療效果[6-7]。但目前并未有報道關(guān)于Hyp作為飼料添加劑用于畜禽生產(chǎn)及疾病預(yù)防等方面的研究。這可能是由于Hyp低水溶性、低滲透性和不穩(wěn)定性等特點極大程度地影響了其應(yīng)用[8]?，F(xiàn)階段通過包合等技術(shù)改善難溶藥物的溶解度、調(diào)節(jié)藥物的釋放是常用的解決方法，如共晶混合物[9]、微膠囊技術(shù)[10]、納米技術(shù)[11]等。其中，環(huán)糊精(cyclodextrins，CDs)包合是價格便宜、操作簡單、技術(shù)成熟、前景良好的方法[12-13]。

環(huán)糊精的分子結(jié)構(gòu)為具有疏水腔的截錐狀寡糖[14],能與眾多有機或無機分子通過多種非共價相互作用，如范德華力、氫鍵作用、疏水作用等形成水溶性的主-客體包合物；或組裝成復(fù)雜的超分子體系[15]，稱為水溶性環(huán)糊精包合物。研究表明，黃酮是一類具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物，其尺寸形狀與環(huán)糊精空腔大小的匹配程度以及二者間氫鍵形成的難易程度對于包合起著至關(guān)重要的作用[16]。因此，選用分子中帶有羥基的β-環(huán)糊精(β-cyclodextrin，β-CD)或帶有氨基的環(huán)糊精衍生物進行包合的效果較好[17]，更有利于二者之間氫鍵的形成。本研究選擇了3種天然或被修飾的環(huán)糊精。其中，β-CD應(yīng)用范圍比較廣，并且毒性小，是最為常用的一種[18]。甲基-β-環(huán)糊精(methyl-β-cyclodextrin，M-β-CD)的溶解度比不加修飾的β-CD溶解度大，環(huán)糊精甲基化之后，封閉了環(huán)糊精的分子內(nèi)羥基，提高了與藥物包合的穩(wěn)定性，對難溶性藥物有很好的增溶效果[19]。羥乙基-β-環(huán)糊精(hydroxyethyl-β-cyclodextrin，HE-β-CD)在醫(yī)藥中可以提高藥物溶解度和生物利用度，使藥劑的療效增加，還可以調(diào)整或控制藥物的釋放速度[20]。另外，藥物包合后不僅溶解度[21]、穩(wěn)定性及生物利用度[22]得到了顯著提高，其藥理活性也較未包合時增強[23-24]。Corina等[25]制備蘆丁與β-CD和羥丙基-β-環(huán)糊精的包合物，結(jié)果顯示，包合后的蘆丁包合物抗氧化活性增強。Arya等[26]以β-CD包合姜黃素，姜黃素包合物的水溶性和抗氧化活性均顯著提高，并發(fā)現(xiàn)β-CD包合物對姜黃素具有5 h的緩釋特性。Hsu等[27]將大黃的乙醇提取物與2-羥丙基-β-環(huán)糊精絡(luò)合，得到的包合物的水溶性和生物利用度明顯增加，進而增強了對抗肝癌細胞的作用。目前，關(guān)于Hyp與環(huán)糊精包合的研究文獻較少?？讜札埖萚28]將Hyp與β-CD進行包合，發(fā)現(xiàn)Hyp包合物的溶出速度顯著提高，但未對其進行全面的表征分析及藥效評價。因此，本研究對Hyp包合物進行系統(tǒng)的評估，以拓展其將來在畜禽養(yǎng)殖等方面的應(yīng)用。

包合物制備方法包括飽和溶液法、溶液攪拌法、研磨法、超聲波法和冷凍干燥法等。超聲波法利用超聲的機械效應(yīng)、空化作用和熱效應(yīng)，提高物質(zhì)的分子運動速度，增大介質(zhì)分子的穿透率；并且利用超聲波在液體中傳播時產(chǎn)生的沖擊波，釋放能量，促進環(huán)糊精與Hyp包合過程的進行[29]。因此，本研究選用超聲波法制備Hyp與3種環(huán)糊精(HE-β-CD、β-CD和M-β-CD)的包合物，并通過溶解度測定和物理化學(xué)表征，包括形貌觀察、熱重分析(thermogravimetric analysis，TGA)、薄層色譜及X-射線衍射(X-ray diffraction，XRD)等，綜合分析不同包合物的包合效果，并從中選擇增溶效果最好的包合物，通過抗氧化性試驗評價包合作用對其抗氧化性能的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

Hyp(高效液相色譜級)購自上海源葉生物技術(shù)有限公司。β-CD、M-β-CD、HE-β-CD均購自上海麥克林生化有限公司。2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)、2,2′氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽(ABTS)均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。GF254硅膠板購自青島海洋化工有限公司。RAW 264.7細胞購于中國科學(xué)院干細胞庫。1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒、脂質(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

主要儀器包括超顯微分光光度計(F-1100型，杭州遂真生物技術(shù)有限公司)、薄層色譜儀(SB-2型，天津市天分分析儀器廠)、熱重分析儀(Q-500型，美國TA公司)、差示掃描量熱儀(Q-20型，美國TA公司)、X射線衍射儀(D-8 Advance型，德國布魯克衍射熒光事業(yè)部)、掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)(JSM-840型，日本電子株式會社)。

1.2 化學(xué)計量(連續(xù)變分法)

Hyp含量測定根據(jù)Arya等[26]的方法略加調(diào)整后測定。制備濃度梯度為2.5、5.0、10.0、20.0和40.0 μg/mL的Hyp無水乙醇溶液，用紫外-可見分光光度法在360 nm波長下對制備的樣品進行分析，通過Hyp溶液的吸光度值與其濃度作圖建立標準曲線。

運用Job法[30]確定HyP分別與HE-β-CD、β-CD和M-β-CD形成包合物的化學(xué)計量比。維持Hyp和環(huán)糊精的總濃度不變(1 mmol/L)，配制一系列濃度的Hyp和環(huán)糊精混合液，使兩者的物質(zhì)的量之比在0.1～0.9，在25 ℃的條件下超聲包合60 min，在360 nm測定吸光度值。以有無環(huán)糊精時Hyp的吸光度差值(△ABS)為縱坐標，并以Hyp在混合液中所占比例為橫坐標作圖。

1.3 物理混合物和包合物的制備

每種物理混合物按主客體摩爾比1∶1混合，準確稱取Hyp和3種環(huán)糊精，分別在陶瓷砂漿中充分混合均勻，室溫儲存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)Job曲線結(jié)果，按摩爾比1∶1制備Hyp和環(huán)糊精的復(fù)合物。取Hyp 1.0 g，加適量無水乙醇微熱溶解，另取HE-β-CD 3.1 g，加水500 mL，攪拌溶解。將Hyp乙醇溶液逐滴加入攪拌中的HE-β-CD溶液中，在超聲波功率300 W，超聲溫度50 ℃的條件下混合1 h，并振搖72 h。放冷至室溫后，未溶解的固體通過0.2 μm纖維素膜過濾，濾液先在-80 ℃冰箱中冷凍，然后轉(zhuǎn)入冷凍干燥機中凍干，即得到呈黃色的Hyp-HE-β-CD包合物。其他包合物的制備與Hyp-HE-β-CD相似。以下所有的表征分析都使用凍干產(chǎn)品。

1.4 包合物的表征分析

1.4.1 SEM觀察形態(tài)差異

SEM觀察是測定材料表面形貌和結(jié)構(gòu)的常用手段。在SEM中，利用電子束掃描樣品表面，獲得三維空間信息[31]。將樣品粉末均勻地黏附在導(dǎo)電膠上并安裝至鋁柱上，并噴金鍍膜。在10 kV加速電壓和600倍、2 000倍或5 000倍放大率下通過SEM進行成像。

1.4.2 熱重分析和差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry，DSC)分析

使用熱重分析儀進行熱重分析，在氮氣氣氛下(流速為50 mL/min)，按升溫速率5 ℃/min從30 ℃升高到500 ℃，檢測過程在鉑皿中進行。

用Dai等[32]描述的方法，用差示掃描量熱儀對Hyp和包合物進行了DSC分析，并進行了一些修改。將凍干樣品(約5.0 mg)裝入密封良好的鋁鍋中，然后在氮氣下以10 ℃/min的速率從50 ℃加熱到300 ℃。

1.4.3 薄層色譜分析

4種樣液(Hyp乙醇溶液、環(huán)糊精水溶液、包合物水溶液和物理混合物水溶液)分別點于硅膠板的同側(cè)，其下端浸入展開劑(乙酸乙酯/甲酸/水=30/3/2，體積比)中，當展開劑距板的上端1 cm時取出。晾干后，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液顯影，并在紫外光燈(365 nm)下檢視。

1.4.4 XRD分析

采用X射線衍射儀在銅激發(fā)α射線(Cu-Kα)輻射下，以5°/min的掃描速率獲得了Hyp、Hyp-HE-β-CD及其他包合物的XRD光譜。將粉末樣品安裝在玻璃樣品架上，掃描步長為2θ=0.02°，在5°～90°(θ～2θ)處獲得了衍射圖形。

1.5 溶解性研究

在25 °C、5 mL水中加入過量的Hyp(10 mg)或其包合物(250 mg)，每5 min對上清中Hyp含量進行1次測定，持續(xù)到200 min做最后1次測量。每個樣品重復(fù)3次，繪制Hyp及其3種包合物隨時間的溶解度變化曲線。

1.6 溫度對Hyp/HE-β-CD絡(luò)合反應(yīng)的影響

參照Liu等[33]的方法，適當調(diào)整后進行溫度對溶解度影響的研究。配制體積為5 mL的一系列摩爾濃度(0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mmol/L)的HE-β-CD溶液，過量的Hyp(10 mg)加到以上溶液的離心管中。在300 W的功率下包合60 min，然后在恒溫振蕩器中振蕩72 h?；旌衔锏钠胶鉁囟确謩e為30、40和50 ℃。離心后取上清，再用0.2 μm親水性纖維素膜過濾器過濾，去除未溶解的Hyp。用超微分光光度計測定紫外-可見吸收光譜，得到Hyp-HE-β-CD包合物的紫外-可見光譜滴定圖。通過繪制Hyp溶解度隨環(huán)糊精濃度的變化曲線，得到在不同溫度、不同環(huán)糊精濃度下的Hyp溶解度圖。根據(jù)溶解度數(shù)據(jù)計算表觀穩(wěn)定常數(shù)(Ks)，并分析Hyp與HE-β-CD的相互作用熱力學(xué)，得到Ks的對數(shù)與溫度倒數(shù)的關(guān)系圖。所有試驗平行測定3次。Ks的公式如下：

Ks=slope/[S(1-slope)]。

式中：S指在不同溫度下無環(huán)糊精條件下Hyp的溶解度；slope為相溶解度圖對應(yīng)的斜率。

根據(jù)Van’t Hoff方程計算包合物的吉布斯自由能(ΔG)：

lnKs=-(ΔH/RT)+ΔS/R；ΔG=ΔH-TΔS。

式中：ΔH為焓變(kJ/mol)；R為通用氣體常數(shù)[J/(mol·K)]；T為絕對溫度(K)；ΔS為熵變[J/(mol·K)]。

1.7 抗氧化活性

以DPPH、ABTS、羥基自由基清除率、超氧陰離子清除率和還原能力為指標，比較Hyp包合前后的抗氧化能力。DPPH清除試驗參考Andrade等[34]的方法，ABTS自由基清除試驗參考Aarland等[35]的方法，羥基自由基清除試驗參考Dai等[36]的方法，超氧陰離子清除率采用鄰苯三酚自氧化法[37]進行測定，還原能力測定參考Chen等[38]的方法。試驗使用蒸餾水和維生素C分別作空白對照和陽性對照[39]。

1.8 細胞抗氧化試驗

1.8.1 藥物安全性評價

采用CCK-8法進行安全性評價。將對數(shù)生長期細胞密度調(diào)整為5×104個/mL，以每孔200 μL接種于96孔板，待細胞生長至80%～90%時，棄上清，并使用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗1遍。加入200 μL含有不同濃度(75、100、125、150、175、200 μg/mL)Hyp和Hyp-HE-β-CD包合物的培養(yǎng)基，作用24 h后棄上清。每孔加入含有10% CCK-8溶液的1640培養(yǎng)基，37 ℃孵育30 min，使用酶標儀在450 nm出測吸光度值，并計算細胞存活率。

1.8.2 過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)RAW264.7細胞氧化損傷模型的建立

重復(fù)1.8.1的操作步驟，使用PBS清洗后，加入200 μL含有不同濃度H2O2(100、200、400、600、800、1 000 μmol/L)的無血清1640培養(yǎng)基，孵育2 h后計算細胞存活率。

1.8.3 Hyp及其包合物對H2O2-RAW264.7細胞氧化應(yīng)激的保護作用

按1.8.1步驟進行操作，并設(shè)立空白組、H2O2組、維生素C對照組(100 μg/mL)、Hyp組(100 μg/mL)和Hyp-HE-β-CD包合物組(50、100、150 μg/mL)?？瞻捉M和H2O2組以無血清1640培養(yǎng)基代替樣品。藥物作用24 h后去除培養(yǎng)基，清洗后再加入含有400 μmol/L H2O2的無血清1640培養(yǎng)基作用2 h，計算細胞存活率。

1.8.4 細胞內(nèi)MDA含量及SOD活性檢測

將6孔板中細胞密度調(diào)整為2×105個/mL，待密度達到80%～90%時，棄上清并使用PBS清洗1遍，參照1.8.3的方法進行培養(yǎng)并分組。根據(jù)免疫沉淀(immunol precipitation,IP)裂解液說明書裂解細胞并收集上清液，采用BCA法檢測蛋白濃度，嚴格按照試劑盒說明書檢測細胞內(nèi)MDA含量和SOD活性。

1.9 數(shù)據(jù)分析

使用OriginPro 9.1軟件進行作圖，使用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用LSD法進行多重比較，P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著。結(jié)果用“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 絡(luò)合化學(xué)計量的測定

Hyp含量測定的標準曲線如下：y=0.037 3x+0.047 8(R2=0.996 6)。通過Job法[30]測定3種環(huán)糊精與Hyp之間的包合比。圖1為HE-β-CD、β-CD和M-β-CD與Hyp在乙醇與水的混合溶液中的Job曲線圖，圖中曲線的最高點在Hyp比例為0.5時出現(xiàn)，可以判斷出HE-β-CD與Hyp的最佳包合比為1∶1。β-CD和M-β-CD與Hyp進行包合也得到類似結(jié)果，表明本研究中選擇的3種環(huán)糊精類型與Hyp之間均為1∶1包合。

Hyp：金絲桃苷 hyperoside；HE-β-CD：羥乙基-β-環(huán)糊精 hydroxyethyl-β-cyclodextrin；β-CD：β-環(huán)糊精 β-cyclodextrin；M-β-CD：甲基-β-環(huán)糊精 methyl-β-cyclodextrin。下圖同 the same as below。

2.2 表征分析結(jié)果

2.2.1 SEM分析結(jié)果

由Hyp、3種包合物及3種物理混合物的SEM圖和包合物的實物圖(圖2)可見，Hyp呈大小不同的塊狀晶體，HE-β-CD為中空球狀結(jié)構(gòu)，β-CD為小型塊狀結(jié)構(gòu)，M-β-CD雖結(jié)構(gòu)不完整但仍能看出其自身為球形，3種包合物都是表面附著一些疏松細小顆粒的塊狀晶體。但不同主體環(huán)糊精的包合物又具有不同的形貌特征，其中Hyp-HE-β-CD包合物中HE-β-CD本身的球狀結(jié)構(gòu)已經(jīng)完全消失，呈不規(guī)則塊狀且光滑平面上嵌入類似細小晶體的形態(tài)，并呈現(xiàn)明顯主客體環(huán)抱形；Hyp-β-CD包合物的表面較為粗糙且有明顯裂痕；Hyp-M-β-CD包合物表面只觀察到少量客體嵌入且表面無裂痕。另外，各物理混合物仍保留其主客體自身的結(jié)構(gòu)特征，均可觀察到單獨的Hyp晶體和單獨的環(huán)糊精形態(tài)，因此不能將其理解為是一種新物質(zhì)的合成[40]。

圖2 Hyp(a)(2 000×和5 000×)、Hyp/HE-β-CD包合體系(b)Hyp/β-CD包合體系(c)Hyp/M-β-CD包合體系(d)的SEM及粉末圖

2.2.2 熱重分析和DSC分析結(jié)果

Hyp及其包合物的熱重分析見圖3-a。Hyp-HE-β-CD包合物有2個失重過程，分別對應(yīng)于空腔內(nèi)水分子的脫水和大環(huán)的分解。Hyp-HE-β-CD包合物在310 ℃下的降解損失了77.5%的重量[41]。Hyp在100、170、250和420 ℃分別發(fā)生了失重。

各包合物的DSC分析見圖3-b。HE-β-CD、β-CD和M-β-CD包合物分別在232、219和250 ℃出現(xiàn)明顯的峰，這些特征峰的出現(xiàn)可歸因于聚合物中結(jié)合水的蒸發(fā)。對Hyp的DSC分析結(jié)果顯示，在123和190 ℃有2個明顯的吸熱峰，在123 ℃時的吸熱峰可能是由于Hyp中水分的去除，而在190 ℃時的吸熱峰可能是由于Hyp晶體的熔化，說明Hyp以結(jié)晶狀態(tài)存在[42]。

圖3 Hyp和3種包合物的熱重分析和DSC分析

2.2.3 薄層色譜分析結(jié)果

薄層色譜是一種用于分離混合物的色譜技術(shù)。由于對固定相的吸引力和在溶劑中的溶解度不同，樣品混合物中的不同化合物以不同的移動速率移動。Hyp、HE-β-CD、β-CD、M-β-CD及它們的包合物和物理混合物的薄層色譜結(jié)果在紫外光下的可視化如圖4所示。因為環(huán)糊精沒有熒光部分，在紫外光照射下均沒有觀察到斑點，而3種包合物和物理混合物均顯示了來自Hyp的熒光點。其中，Hyp和Hyp-HE-β-CD物理混合物與Hyp-HE-β-CD包合物相比有較快的速度移動(圖4-a)，類似現(xiàn)象也出現(xiàn)在Hyp-β-CD包合體系中(圖4-b)。Hyp-HE-β-CD物理混合物和Hyp-β-CD包合物的移動速度略慢于Hyp，而Hyp-M-β-CD包合物與Hyp的移動速度相近(圖4-c)。

圖4 在紫外光下Hyp、環(huán)糊精及其包合物和物理混合物的薄層色譜圖

2.2.4 XRD分析結(jié)果

特征峰在光譜中出現(xiàn)、特征峰的升高或降低都是包合物形成的證據(jù)[43]。Hyp及Hyp-HE-β-CD、Hyp-β-CD和Hyp-M-β-CD包合物的XRD分析結(jié)果如圖5所示。Hyp在10°～40°具有特征性的高能衍射峰，說明藥物具有典型的晶體結(jié)構(gòu)特征。Hyp-HE-β-CD包合物的衍射圖可以看到Hyp的某些衍射峰減弱，并在30°～45°處出現(xiàn)了一些寬的衍射峰，這些峰的變化說明Hyp被包合到環(huán)糊精中[40,44]。Hyp-β-CD和Hyp-M-β-CD包合物的衍射圖仍具有Hyp客體結(jié)晶型的特征衍生峰，但強度和數(shù)目明顯減少。

圖5 Hyp及Hyp-HE-β-CD、Hyp-β-CD和Hyp-M-β-CD包合物的XRD分析

2.3 溶解度試驗

藥物與環(huán)糊精絡(luò)合后，包合物的水溶性較包合前普遍有不同程度的提高，尤其對自身難溶于水甚至不溶于水的物質(zhì)[45]。如圖6所示，Hyp在水中的溶解速率極為緩慢，溶解60 min后速溶解率趨于平緩；3種包合物均表現(xiàn)出良好的水溶性，其中Hyp-HE-β-CD包合物在前15 min內(nèi)迅速溶解，隨后溶解速率降低趨于穩(wěn)定，15 min時其溶解度約占飽和狀態(tài)下總?cè)芙舛鹊?4.51%，而Hyp-β-CD和Hyp-M-β-CD包合物的溶解度分別約占飽和狀態(tài)下總?cè)芙舛鹊?0.70%和84.06%，故Hyp-HE-β-CD包合物比其他2種包合物具有更快的溶解速率。HE-β-CD、β-CD和M-β-CD包合物的增溶作用使Hyp的水溶性分別提高到1 255.62、1 138.01和1 040.42 μg/mL，顯著高于Hyp單體(約153.09 μg/mL)。其中Hyp-HE-β-CD包合物的增溶效果最佳，可達8.2倍。

圖6 Hyp及Hyp-HE-β-CD、Hyp-β-CD和Hyp-M-β-CD包合物在水中的溶解度特性

2.4 溫度對Hyp與Hyp-HE-β-CD絡(luò)合反應(yīng)的影響

如圖7所示，隨著主體HE-β-CD濃度不斷增加，Hyp的吸光值不斷增大，肉眼可見形成的包合物顏色逐漸加深。此外，隨著HE-β-CD濃度的增加，Hyp的溶解度呈線性增加，再次驗證了Hyp與HE-β-CD在溶液中形成了包合物且兩者摩爾比為1∶1。

a～g：HE-β-CD濃度分別為0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mmol/L。

表1為不同溫度下Hyp和HE-β-CD溶解度直線圖的截距、斜率和Ks。溫度越高，線性曲線的截距越大，表明Hyp溶解度隨溫度的升高而增大。另外Ks隨溫度升高而顯著降低，意味著Hyp加入HE-β-CD后伴隨著放熱。

表1 從Hyp和HE-β-CD溶解度圖中得到的不同溫度下的截距、斜率和Ks

通過對不同溫度下溶解度的研究，可以計算出焓值和熵值的變化。Hyp-HE-β-CD包合物形成的Van’t Hoff圖如圖8所示，Ks與絕對溫度的倒數(shù)(1/T)呈線性關(guān)系(R2=0.992)。根據(jù)這條線性曲線的斜率和截距可以計算出熱力學(xué)參數(shù)：焓變=-67.55 kJ/mol和熵變=-172.52 J/(mol·K)。進一步計算出絡(luò)合相互作用的不同溫度下的ΔG的變化，ΔG30 ℃=-15.28 kJ/mol，ΔG40 ℃=-13.55 kJ/mol，ΔG50 ℃=-11.83 kJ/mol。

圖8 Hyp-HE-β-CD包合物的Van’t Hoff圖

2.5 抗氧化活性的測定結(jié)果

目前基于化學(xué)氧化還原反應(yīng)已經(jīng)開發(fā)出多種檢測方法用于評估中藥中黃酮類成分的抗氧化活性，這些檢測方法按照機理大致可以分為2類：通過單電子轉(zhuǎn)移或氫原子轉(zhuǎn)移達到抗氧化的目的[46]。本研究中采用的5種檢測方法的反應(yīng)原理有差異，基于氫原子轉(zhuǎn)移的DPPH方法是通過檢測抗氧化劑提供1個氫原子淬滅自由基的能力[47]，ABTS、還原力、羥基自由基和超氧陰離子清除試驗則是通過檢測抗氧化劑轉(zhuǎn)移1個電子以減少自由基或金屬離子的氧化性[48]。另外，本試驗既檢測疏水化合物的清除能力(DPPH法)，又檢測親水化合物的清除能力(ABTS法)，多種測定方法相輔相成，可以充分評價包合前后Hyp的抗氧化能力。

DPPH試驗結(jié)果表明(圖9-a)，在2.5～15.0 μg/mL的樣品濃度范圍內(nèi)，DPPH自由基清除率隨著Hyp、Hyp-HE-β-CD包合物和維生素C濃度的增加均增加，并表現(xiàn)出濃度依賴性。當樣品濃度增加到20 μg/mL時，DPPH自由基清除率分別達到91.14%、92.05%和94.05%；然而隨樣品濃度繼續(xù)增加，DPPH自由基清除率均趨于平緩。Hyp、Hyp-HE-β-CD包合物和維生素C的半抑制濃度(IC50)分別為7.136、6.500和8.194 μg/mL?？偟膩碚f，Hyp-HE-β-CD包合物的DPPH清除能力強于未被包合的Hyp，這可能是由于Hyp-HE-β-CD包合物在水中能釋放出更多與DPPH自由基結(jié)合的氫原子，導(dǎo)致DPPH自由基的還原激進[49]。

在ABTS清除試驗中(圖9-b)，Hyp、Hyp-HE-β-CD包合物和維生素C的IC50分別為8.251、6.362和7.495 μg/mL。隨著樣本濃度增大，Hyp-HE-β-CD包合物和Hyp對ABTS自由基清除能力隨之提高，并且前者始終優(yōu)于后者。當濃度為25 μg/mL時，Hyp和Hyp-HE-β-CD包合物對ABTS自由基的最大清除率分別達到82.68%和88.67%。

考慮到羥基自由基作為生物體內(nèi)最活躍的氧物質(zhì)容易與其他如脂質(zhì)或蛋白質(zhì)等分子反應(yīng)進而引起病變[50]，因此評價藥物對羥基自由基清除能力至關(guān)重要。由于Hyp在水中的溶解度僅能達到50 μg/mL，因此本研究僅對此濃度范圍內(nèi)的Hyp和Hyp-HE-β-CD包合物的羥基自由基清除能力進行比較，結(jié)果如圖9-c所示。雖然在最高樣本濃度下，Hyp-HE-β-CD包合物和Hyp的羥基自由基清除率僅為28.01%和19.41%，但Hyp-HE-β-CD包合物對羥基自由基清除率明顯強于未包合的Hyp。

從圖9-d可以看出，3種樣品對超氧陰離子均具有一定的清除作用，且作用效果均與樣品濃度呈正相關(guān)。在最大濃度500 μg/mL時，Hyp-HE-β-CD包合物的超氧陰離子清除率雖不及維生素C，但明顯高于Hyp；Hyp-HE-β-CD包合物、維生素C和Hyp對超氧陰離子清除率清除率分別為57.27%、98.47%和41.46%。

另外，通過檢測鐵氰化鉀中三價鐵離子(Fe3+)被還原為二價鐵離子(Fe2+)的含量來評估藥物的另一個衡量抗氧化能力的潛在指標——還原能力[51]，結(jié)果表示吸光值越高其還原能力越強。從圖9-e可以看出，Hyp-HE-β-CD包合物和Hyp的還原能力均略低于維生素C，雖然Hyp-HE-β-CD包合物比未包合的Hyp表現(xiàn)出更強的還原能力，但包合前后對該指標的影響不大。

圖9 Hyp和Hyp-HE-β-CD包合物的抗氧化試驗結(jié)果

2.6 Hyp-HE-β-CD包合物對H2O2誘導(dǎo)RAW264.7細胞氧化應(yīng)激的保護作用

Hyp和Hyp-HE-β-CD包合物對RAW264.7細胞存活率的影響見圖10-a，兩者分別在50～125 μg/mL和50～150 Μg/mL區(qū)間內(nèi)對細胞的增殖具有促進作用，且隨濃度升高促增殖效果呈先增大后減小的趨勢；當Hyp濃度達到150 μg/mL，細胞存活率顯著低于空白組(P<0.05)；而Hyp-HE-β-CD包合物濃度達175 μg/mL，細胞存活率才顯著低于空白組(P<0.05)。因此，選擇Hyp-HE-β-CD包合物的低、中、高濃度(50、100、150 μg/mL)進行后續(xù)試驗，并與促增殖效果最強的100 μg/mL Hyp做對比。

H2O2刺激對RAW264.7細胞存活率的影響見圖10-b，隨著H2O2濃度的增加，細胞存活率逐漸下降，當H2O2濃度達到1 000 μmol/L時，細胞存活率僅為15.61%，獲得IC50為493.21 μmol/L。

Hyp和Hyp-HE-β-CD包合物對H2O2誘導(dǎo)的RAW264.7細胞氧化應(yīng)激的保護作用見圖10-c，50 μg/mL Hyp-HE-β-CD包合物組的細胞存活率極顯著高于100 μg/mL Hyp組(P<0.01)，意味著Hyp被HE-β-CD包和后對H2O2刺激RAW264.7細胞具有更高的保護效果。另外，100 μg/mL Hyp-HE-β-CD包合物組的存活率極顯著高于空白組(P<0.01)，進一步肯定了包合作用的重要意義。

MDA由多不飽和脂肪酸被氧代謝產(chǎn)生的活性自由基降解而形成，是細胞中氧化應(yīng)激的指標[52]。SOD可催化有毒的超氧陰離子(·O2-)分解為氧氣(O2)和H2O2，防止超氧陰離子的毒性作用對細胞造成損傷[53]，是氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)中一種重要的抗氧化酶。由圖10-d可知，空白組細胞MDA含量與模型組有極顯著差異(P<0.01)，表明模型組細胞受到刺激后出現(xiàn)嚴重脂質(zhì)過氧化；維生素C組細胞MDA含量極顯著低于模型組(P<0.01)，而與Hyp組和Hyp-HE-β-CD包合物組無顯著差異(P>0.05)，說明Hyp與維生素C具有類似的治療效果；與Hyp組相比，中濃度Hyp-HE-β-CD包合物組細胞MDA含量極顯著降低(P<0.01)。另外，由圖10-e可知，模型組細胞SOD活性極顯著低于其他各組(P<0.01)，中濃度Hyp-HE-β-CD包合物組細胞SOD活性顯著高于Hyp組(P<0.05)，且低濃度Hyp-HE-β-CD包合物組細胞SOD活性顯著高于空白組(P<0.05)。

圖a、b中，與空白組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)，#表示差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)。圖c、d、e中，2組間比較，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)；與模型組比較，##表示差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

將Hyp和HE-β-CD、β-CD、M-β-CD均按最佳包合比1∶1包合后干燥，得到淡黃色粉末。在各包合物SEM圖中可以看出新物質(zhì)體積明顯大于包合前的單體，且其中Hyp的特殊形態(tài)特征已不存在，這些明顯的變化說明了Hyp和HE-β-CD、β-CD和M-β-CD均有效形成了包合物，并且形成包合物后，其表面晶形結(jié)構(gòu)都發(fā)生了變化，而物理混合物不具備以上特征。根據(jù)熱重分析結(jié)果，各包合物均比Hyp發(fā)生失重的溫度更晚，因此包合物的熱穩(wěn)定性更高。DSC分析結(jié)果中Hyp-HE-β-CD、Hyp-M-β-CD和Hyp-β-CD包合物的吸熱峰消失，表明包合的Hyp以無定型存在于環(huán)糊精中，與晶體分子不同，無定型分子的溶解不需要任何能量來打破晶體，因此它們能夠作為聚合物基質(zhì)的易擴散體，從而使封裝的Hyp有可能持續(xù)釋放。薄層色譜結(jié)果中，Hyp與包合物(Hyp-HE-β-CD和Hyp-β-CD包合物)和物理混合物的移動速度差異表明，Hyp被包封在環(huán)糊精腔內(nèi)，包合物中的Hyp與固定相和展開溶劑的相互作用與未被包合的Hyp不同，而物理混合物中Hyp沒有很好的被環(huán)糊精包封，并且Hyp-M-β-CD包合物中Hyp和M-β-CD的包合作用相對較弱。XRD結(jié)果的差異均是因為包合物的制備過程使Hyp進入環(huán)糊精中，表現(xiàn)出非晶型或以無定型的形式存在[54]。Zheng等[55]在對α-硫辛酸與2-羥丙基-β-CD形成的包合物研究中得出了相似的結(jié)論。

Hyp-HE-β-CD包合物的增溶效果優(yōu)于其他2種包合物，其水溶性是Hyp的8.2倍，這可能與HE-β-CD的自身性質(zhì)有關(guān)，其內(nèi)疏水、外親水的特性能使難溶性藥物分子進入其內(nèi)腔而形成包合物，從而極大地提高Hyp在水中的溶解度，有研究也證實了該環(huán)糊精是一種極具應(yīng)用潛力的難溶性藥物的增溶劑[56]。為實現(xiàn)在臨床醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛價值，故選擇增溶效果最佳的Hyp-HE-β-CD包合物進行后續(xù)試驗，并探究了溫度對兩者包合作用的影響。隨著溫度升高，Hyp-HE-β-CD包合物的溶解度直線的截距增大且Ks降低，說明該絡(luò)合過程伴隨放熱。其他絡(luò)合物也表現(xiàn)出類似的性質(zhì)，Mazzobre等[57]采用共同沉淀法制備了α-松油醇與β-CD的包合物，Mourtzinos等[58]將百里香酚和香葉醇分別與β-CD包合，溶解度研究結(jié)果均顯示以上絡(luò)合過程均是自發(fā)放熱的。由于焓變?yōu)樨撝?，也說明Hyp與HE-β-CD絡(luò)合為放熱過程，并且該絡(luò)合作用為低能型。Liu等[33]研究發(fā)現(xiàn)，這些絡(luò)合作用的發(fā)生主要取決于黃酮的空間效應(yīng)和疏水性，可能為絡(luò)合時疏水性更強的黃酮分子將環(huán)糊精空腔中的水分子替代，同時與腔內(nèi)的側(cè)基形成氫鍵，從而進一步穩(wěn)定包合結(jié)構(gòu)。另外，熵變?yōu)樨撝当砻饔捎诮j(luò)合分子的平動和轉(zhuǎn)動自由度比自由分子的低，使系統(tǒng)變得更加穩(wěn)定[58]。ΔG均為負值表示Hyp與HE-β-CD的絡(luò)合作用是自發(fā)進行的。

通過檢測抗氧化試驗中5項抗氧化指標可以得到結(jié)論，三者的抗氧化能力順序為維生素C>Hyp-HE-β-CD包合物>Hyp。因此，被HE-β-CD包和后的Hyp比包合前的Hyp具有更好的抗氧化性能，為其在細胞水平上的抗氧化活性探究奠定基礎(chǔ)。另外，在應(yīng)對H2O2誘導(dǎo)RAW264.7細胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激中，中濃度Hyp-HE-β-CD包合物組表現(xiàn)出良好的保護作用，在降低MDA含量和提高SOD活性方面的作用效果顯著強于Hyp。由此再次說明Hyp被HE-β-CD包合后，其抗氧化性能有較大程度地提高，可以更好地提高RAW264.7細胞中抗氧化酶的活性，從而抑制H2O2累積造成的脂質(zhì)過氧化，減輕細胞的氧化應(yīng)激，更有利于維持和改善細胞生理活性。這可能是由于環(huán)糊精具有特殊的分子結(jié)構(gòu)、良好的穩(wěn)定性和易于化學(xué)修飾等特性，在藥物遞送中表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢，HE-β-CD與Hyp形成的主-客體復(fù)合結(jié)構(gòu)對內(nèi)部的Hyp起一定保護作用，保證其溶于水后可以更好地進入細胞內(nèi)發(fā)揮作用。該試驗結(jié)果對制備Hyp的環(huán)糊精包合物具有肯定和推動作用。

4 結(jié) 論

Hyp具有一系列的藥理活性，但由于其水溶性差、生物利用度低而限制了其應(yīng)用。本文采用1∶1的化學(xué)計量學(xué)方法成功制備了Hyp和環(huán)糊精的包合物。與Hyp-β-CD和Hyp-M-β-CD包合物相比，Hyp-HE-β-CD包合物具有更高的水溶性。熱力學(xué)研究表明，3種包合物的熱穩(wěn)定性均明顯強于Hyp，并且Hyp分子進入HE-β-CD內(nèi)部是一個自發(fā)放熱過程。根據(jù)SEM圖像，Hyp分子被插入到HE-β-CD空腔中形成絡(luò)合物結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能保護內(nèi)部Hyp分子更好地發(fā)揮抗氧化作用。本研究對于擴大Hyp在醫(yī)藥產(chǎn)品、飼料添加劑等領(lǐng)域中的應(yīng)用具有重大意義。