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    不同來源大豆寡糖的形態(tài)特征、功能組分含量和分子結構的比較研究

    2022-09-01 03:22:28付美業(yè)景寒松楊桂芹
    動物營養(yǎng)學報 2022年8期
    關鍵詞:分子結構呋喃波數(shù)

    徐 淼 付美業(yè) 景寒松 楊桂芹*

    (1.沈陽農(nóng)業(yè)大學,動物科學與醫(yī)學學院,沈陽 110866;2.沈陽豐美生物技術有限公司,沈陽 110179)

    大豆寡糖也稱大豆低聚糖,主要提取來源為大豆、脫脂豆粕、大豆乳清及大豆糖蜜等,且主要由蔗糖、棉子糖和水蘇糖等組成,能替代蔗糖應用在功能性食品或低能量食品中[1-2]。研究表明,大豆寡糖功能組分[3-4]和大豆寡糖添加水平[5]顯著影響肉仔雞盲腸糞臭素的產(chǎn)生,對平衡家禽腸道微生態(tài)具有重要調(diào)節(jié)作用,在一定程度上能夠替代抗生素[6],但大豆寡糖對動物生產(chǎn)性能和腸道菌群的作用效果與其來源、類型和濃度等有關[7]?!洞蠖沟途厶恰?GB/T 22491—2008)[8]中對大豆寡糖的質(zhì)量要求包括了色澤、外觀、氣味、雜質(zhì)、灰分及大豆寡糖的含量(粉末型大豆寡糖含量≥75%,其中水蘇糖、棉子糖含量大于≥30%)。由于大豆寡糖來源和加工工藝不同,其總糖、功能組分含量和分子結構會存在差異,進而影響其應用效果。已知化學結構是大豆寡糖生物活性的基礎,作為混合物,分子結構能直觀反映大豆寡糖的內(nèi)在空間結構特征。近年來,國內(nèi)外已有大量關于傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared reflection,F(xiàn)TIR)技術在飼料分子結構研究中的應用報道[9-10],它具有直接、快速并且不破壞樣品內(nèi)在結構的特點。紅外光譜能夠檢測飼料原料及混合飼料中碳水化合物內(nèi)在結構的差異[11-13],并用于分析牛蒡寡糖的分子結構[14]。目前,有關不同來源大豆寡糖的功能組分含量及分子結構等差異的研究鮮見報道。因此,本試驗選取5種不同來源的大豆寡糖,測定其微觀物理形態(tài)特征、總糖和功能組分含量的差異,并利用FTIR技術測定其分子結構差異,為建立大豆寡糖結構與功能的關系奠定基礎。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    本試驗所用大豆寡糖均為市售商品大豆寡糖,分別記為大豆寡糖Ⅰ、大豆寡糖Ⅱ、大豆寡糖Ⅲ、大豆寡糖Ⅳ和大豆寡糖Ⅴ,其產(chǎn)地及產(chǎn)品質(zhì)量標準見表1。

    表1 不同來源大豆寡糖的產(chǎn)地及產(chǎn)品質(zhì)量標準

    1.2 試驗方法

    1.2.1 大豆寡糖的形態(tài)特征

    利用掃描電子顯微鏡進行觀察大豆寡糖的形態(tài)特征。將5種不同來源的大豆寡糖顆粒用雙面膠固定在硅片上,通過噴金鍍膜處理后,用冷場掃描電鏡Regulus-8100(日立公司,日本)分別放大200×、800×、1 000×和1 500×等進行掃描,觀察5種不同來源大豆寡糖的微觀形態(tài)特征。

    1.2.2 大豆寡糖中總糖和功能組分含量

    1)總糖含量:采用蒽酮比色法[15]測定。主要儀器為UV-5500PC型紫外可見分光光度計,主要藥品為蒽酮試劑和硫脲(沈陽西隴化工有限公司)、濃硫酸(分析純)和葡萄糖標準品(分析純)。

    2)功能組分含量:采用紫外分光光度法,參照文獻[16-17]測定,主要儀器為Evolution-201/220紫外可見分光光度計(Thermo Scientific公司,美國),主要試劑為寡糖(蔗糖、棉子糖、水蘇糖)標準品(上海瑞永生物科技有限公司)和濃鹽酸(分析純)。

    3)分子結構:采用FTIR法[18-19]測定。主要儀器為Nicolet iS5 FTIR儀(Thermo公司,美國),將干燥的5種大豆寡糖樣本與溴化鉀粉末混合(按1∶100的比例)后在研缽中研磨5 min,將混合物用紅外壓片機(769YP-15A粉末壓片機)進行壓片(壓片厚度=0.25 mm,呈透明狀),恒溫箱中平衡5 min后置于FTIR儀上進行光譜掃描,掃描波段4 000~400 cm-1,檢測器為氘代硫酸三甘肽(DTGS)檢測器,以溴化鉀為背景,背景圖譜掃描256次,并對空氣(CO2和水蒸氣)進行校正,分辨率為4 cm-1,每個樣品3個重復,收集每個樣本的光譜圖。

    1.3 數(shù)據(jù)處理分析

    利用OMINIC 8.0軟件處理得到的FTIR圖譜,用Excel 2010表格記錄其峰高和峰面積。采用SPSS 20.0軟件中的單因素方差分析(one-way ANOVA)對紅外光譜數(shù)據(jù)、化學成分數(shù)據(jù)進行分析處理,當數(shù)據(jù)差異顯著時,采用Duncan氏法進行多重比較,P<0.01表示差異極顯著,P<0.05表示差異顯著,試驗結果用“平均值±標準誤”表示。

    2 結果與分析

    2.1 不同來源大豆寡糖的形態(tài)特征

    由圖1和表2可知,5種大豆寡糖在顆粒形態(tài)上有球形和多面體形,在顆粒結構上有單粒結構和復粒結構。大豆寡糖Ⅰ和大豆寡糖Ⅱ呈球體、顆粒尺寸較小、分布不均勻,顆粒表面較光滑;大豆寡糖Ⅲ、大豆寡糖Ⅳ和大豆寡糖Ⅴ呈多面體,且表面有褶皺、凹凸不平,顆粒尺寸較大且大小不一。

    從左至右放大倍數(shù)依次為:大豆寡糖Ⅰ,200×、800×和1 000×;大豆寡糖Ⅱ,200×、1 000×和1 500×;大豆寡糖Ⅲ,200×、1 000×和6 000×;大豆寡糖Ⅳ,200×、800×和2 000×;大豆寡糖Ⅴ,200×、1 500×和3 000×。

    表2 不同來源大豆寡糖顆粒超微結構形態(tài)特征

    2.2 不同來源大豆寡糖的總糖和功能組分含量

    由表3可知,5種大豆寡糖(Ⅰ~Ⅴ)中的總糖含量分別為66.50%、82.75%、75.73%、65.54%和70.39%。5種大豆寡糖中3種功能組分含量依次為,蔗糖含量:大豆寡糖Ⅴ>大豆寡糖Ⅲ>大豆寡糖Ⅰ>大豆寡糖Ⅱ>大豆寡糖Ⅳ;棉子糖含量:大豆寡糖Ⅱ>大豆寡糖Ⅳ>大豆寡糖Ⅰ>大豆寡糖Ⅲ>大豆寡糖Ⅴ;水蘇糖含量:大豆寡糖Ⅴ>大豆寡糖Ⅲ>大豆寡糖Ⅰ>大豆寡糖Ⅳ>大豆寡糖Ⅱ。

    表3 不同來源大豆寡糖的總糖和功能組分含量

    2.3 不同來源大豆寡糖的分子結構

    圖2為不同來源大豆寡糖的FTIR圖譜,已知波數(shù)為860 cm-1光譜區(qū)域特征吸收峰為由C—H的變角振動差異而構成的呋喃環(huán)C型結構,波數(shù)為928 cm-1光譜區(qū)域特征吸收峰為由呋喃環(huán)的對稱伸縮振動差異而構成的呋喃環(huán)A型結構,波數(shù)為1 000 cm-1光譜區(qū)域特征吸收峰為寡糖特征吸收峰。

    圖2 不同來源大豆寡糖的FTIR圖譜(波數(shù)1 200~800 cm-1)

    由表4可知,大豆寡糖Ⅱ在波數(shù)為860 cm-1位置的吸收峰面積(A_860值)極顯著低于其余4種大豆寡糖(P<0.01),由大到小依次為:大豆寡糖Ⅲ>大豆寡糖Ⅳ>大豆寡糖Ⅴ>大豆寡糖Ⅰ>大豆寡糖Ⅱ,即大豆寡糖Ⅲ在空間結構中所含呋喃環(huán)C型結構占比最大。5種大豆寡糖在波數(shù)為928 cm-1位置的吸收峰面積(A_928值)之間差異極顯著(P<0.01),由大到小依次為:大豆寡糖Ⅲ>大豆寡糖Ⅳ>大豆寡糖Ⅴ>大豆寡糖Ⅰ>大豆寡糖Ⅱ,說明大豆寡糖Ⅲ在空間分子結構中含呋喃環(huán)A型結構所占比例高于其余4種大豆寡糖。大豆寡糖Ⅰ和大豆寡糖Ⅲ在波數(shù)為1 024 cm-1位置的吸收峰面積(A_1 024值)與其余大豆寡糖相比差異極顯著(P<0.01),由大到小依次為:大豆寡糖Ⅲ>大豆寡糖Ⅰ>大豆寡糖Ⅳ>大豆寡糖Ⅴ>大豆寡糖Ⅱ。5種大豆寡糖在波數(shù)為1 151 cm-1位置的吸收峰面積(A_1 151值)之間差異極顯著(P<0.01),由大到小依次為:大豆寡糖Ⅲ>大豆寡糖Ⅳ>大豆寡糖Ⅰ>大豆寡糖Ⅴ>大豆寡糖Ⅱ,說明大豆寡糖Ⅲ在空間分子結構中含寡糖最多。

    表4 不同來源大豆寡糖的FTIR圖譜分析

    3 討 論

    3.1 不同來源大豆寡糖的形態(tài)特征

    利用掃描電子顯微鏡觀察分析多糖微觀形態(tài)結構是一種較為先進的技術方法[20-21]。掃描電子顯微鏡操作簡單,放大倍數(shù)和分辨率高,更容易進行超微結構形態(tài)觀察[22-23]。由于原料的來源、生產(chǎn)工藝和儲存條件等的不同,多糖顆粒的形態(tài)和大小尺寸各有不同,這種形態(tài)上的差異可能對多糖的理化性質(zhì)、生物學活性及營養(yǎng)特性有所影響[24-25]。

    徐鑫[26]通過對淀粉水解寡糖的研究發(fā)現(xiàn),溶液法結晶的樣本與標準樣品的電子顯微鏡掃描圖有差異,而不同的干燥方法也會導致電子顯微鏡掃描圖不同,且通過流化床噴霧干燥法可以得到外形圓整的多孔顆粒。本試驗研究表明,不同來源大豆寡糖樣品呈現(xiàn)規(guī)格不同的聚集緊密性,這可能是由于不同來源大豆寡糖的原料及加工工藝的差異,導致樣品呈現(xiàn)不同純化程度,進而導致大豆寡糖聚集性的緊密程度差異[27]。多糖的種屬不同不會影響多糖在空間結構上的相似性[28-29]。徐錚錚[24]研究表明,在不同掃描電子顯微鏡觀察下,不同草菇多糖的表面結構多呈不規(guī)則片狀,且差異較大,可能會導致兩者的生物學活性差異。本試驗研究表明,5種大豆寡糖的微觀顆粒結構差異較大,尺寸大小不一,顆粒形態(tài)上有球形和多面體形之分,顆粒表面的形態(tài)特征差異較大,有的表面光滑,有的較為褶皺。不同來源大豆寡糖的微觀表面結構的多樣性,可能會使大豆寡糖有多種生物活性。

    3.2 不同來源大豆寡糖的總糖和功能組分含量

    大豆寡糖是大豆及其制品中可溶性糖的總稱,包含蔗糖、棉子糖和水蘇糖等主要功能組分,適量大豆寡糖對人和動物腸道具有潛在的益生功能。王曙明等[30]采用碳水化合物分析儀對吉林省181份大豆品種資源中的大豆寡糖含量進行了分析,發(fā)現(xiàn)大豆寡糖(水蘇糖和棉子糖)的含量變異范圍不同,但不同地區(qū)間大豆寡糖含量沒有明顯的規(guī)律性。宋志峰等[31]采用高效液相色譜(HPLC)法對吉林省500份大豆種質(zhì)中的大豆寡糖含量進行分析,發(fā)現(xiàn)大豆寡糖(蔗糖、水蘇糖和棉子糖)含量品種間差異顯著。王瀟瀟等[19]采用近紅外反射光譜法測定了160份大豆制品(去皮豆粕、膨化豆粕、發(fā)酵豆粕和膨化大豆)中大豆寡糖(蔗糖、棉子糖及水蘇糖)的含量,結果表明大豆制品的來源、加工工藝和年份不同,寡糖的含量差異較大,其中發(fā)酵豆粕的各種寡糖含量較低。李俊茹[32]通過分析324份大豆籽粒中大豆寡糖及其組分含量,發(fā)現(xiàn)各品種間大豆寡糖及其組分含量均存在極顯著差異,以棉子糖含量的變異系數(shù)最大,各地區(qū)大豆寡糖的功能組分含量也存在差異。本試驗通過蒽酮比色法對不同來源的大豆寡糖產(chǎn)品的總糖含量進行了測定,用蒽酮比色法測定總糖含量應用比較普遍,其操作簡單、靈敏、快捷、準確且經(jīng)濟,適合大批量的樣品[33-35]。本試驗得出,5種大豆寡糖的功能組分含量也存在差異,大豆寡糖的總糖含量從高到低為大豆寡糖Ⅱ>大豆寡糖Ⅲ>大豆寡糖Ⅴ>大豆寡糖Ⅰ>大豆寡糖Ⅳ;通過利用紫外分光光度法對5種不同來源大豆寡糖的功能組分糖含量進行測定,結果顯示大豆寡糖Ⅴ和大豆寡糖Ⅲ中所含蔗糖和水蘇糖含量均高于大豆寡糖Ⅰ、大豆寡糖Ⅱ和大豆寡糖Ⅳ,棉子糖含量均低于大豆寡糖Ⅰ、大豆寡糖Ⅱ和大豆寡糖Ⅳ。不同來源大豆寡糖功能組分含量的差異可能與其提取來源、提取工藝等有關。

    3.3 不同來源大豆寡糖的分子結構

    利用FTIR技術分析大豆寡糖的化學成分是農(nóng)業(yè)和食品領域內(nèi)較為領先的技術方法之一。相比于傳統(tǒng)的評價飼料營養(yǎng)價值的方法,F(xiàn)TIR技術能夠分析飼料分子結構,飼料樣品中分子的化學鍵可吸收紅外光輻射,得出的FTIR圖譜主要用于鑒別化合物的化學鍵類型,進而對化合物分子結構進行推測,推測其組成不同物質(zhì)的各種分子基團(如O—H、N—H、C—H、S—H和CO等都有特定的吸收區(qū)域),具有簡單、快速等優(yōu)點,應用廣泛[36]。FTIR技術可幫助識別吡喃糖、呋喃糖的構型以及判別多糖的特征吸收峰[37],圖譜中的峰數(shù)、峰位和峰強與樣品中組分的分子結構有關,因此被測飼料樣品的光譜特征是多種組分吸收光譜的綜合表現(xiàn)。本試驗利用FTIR技術研究不同來源大豆寡糖的光譜圖中所含化學鍵、官能團的類型差異進而分析分子結構的不同,為后續(xù)分析大豆寡糖的理化特性及其功效提供參考。

    糖類即碳水化合物的光譜特征吸收峰為總碳水化合物(波數(shù)1 212~861 cm-1)、非結構性碳水化合物(波數(shù)946~813 cm-1)和結構性碳水化合物(波數(shù)1 486~1 186 cm-1)等。波數(shù)960~730 cm-1為多糖的特征吸收峰,是鑒定多糖的關鍵峰[38];寡糖的特征吸收峰集中在波數(shù)1 000 cm-1左右,其中光譜吸收峰為波數(shù)1 212~800 cm-1[39]。本試驗結果顯示,大豆寡糖Ⅰ和大豆寡糖Ⅲ的A_1 024值極顯著高于其余大豆寡糖,其中大豆寡糖Ⅲ的A_1 024值最高,說明大豆寡糖Ⅲ所含寡糖含量最高。張琳[18]研究發(fā)現(xiàn),在波數(shù)860 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰為C—O—C的對稱伸縮振動和C—H的變角振動。本試驗結果顯示,大豆寡糖Ⅱ在波數(shù)為860 cm-1位置的吸收峰面積極顯著的低于其余4種大豆寡糖,大豆寡糖Ⅲ在波數(shù)為860 cm-1位置的吸收峰面積最高,說明大豆寡糖Ⅲ在空間分子結構中C—O—C的對稱伸縮振動和C—H的變角振動的占比可能高于其余大豆寡糖。龔加順等[40]研究發(fā)現(xiàn),多糖在波數(shù)為894 cm-1位置附近出現(xiàn)的吸收峰為吡喃環(huán)。由于呋喃環(huán)的空間構型是對稱的,C—H在呋喃環(huán)上下的任意位置都是對等的,所以在光譜圖中α-和β-鍵的吸收峰差異較小,呋喃環(huán)衍生物具有A、B、C和D 4種類型特征吸收區(qū)域[41]。潘曉東[39]研究發(fā)現(xiàn),在波數(shù)(924±13)cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰為呋喃環(huán)A型,在波數(shù)(858±7)cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰為呋喃環(huán)C型。本試驗結果顯示,在FTIR圖譜中,波數(shù)928 cm-1的特征峰吸收面積最大的是大豆寡糖Ⅲ、最小的是大豆寡糖Ⅱ,說明大豆寡糖Ⅲ的呋喃環(huán)A型和呋喃環(huán)C型結構在空間分子結構分布可能高于其余大豆寡糖。呋喃環(huán)的對稱伸縮振動在空間結構上的差異,是造成這些現(xiàn)象的主要原因。上述測試吸收峰值不是完全套用,由于操作環(huán)境、儀器以及測試技術的差異導致試驗存在一定偏差,另外,樣品自身差異的不同會影響預測結果[19]。本試驗也存在這種偏差,但在波數(shù)1 200~800 cm-1區(qū)域吸收峰明顯。

    4 結 論

    ① 大豆寡糖Ⅰ和大豆寡糖Ⅱ顆粒較小,多呈多囊狀球體,表面光滑;大豆寡糖Ⅲ、大豆寡糖Ⅳ和大豆寡糖Ⅴ顆粒相對較大,多呈不規(guī)則多面體,表面凹凸不平。

    ② 大豆寡糖Ⅳ總糖含量最低,大豆寡糖Ⅱ總糖含量最高;大豆寡糖Ⅴ和大豆寡糖Ⅲ中的蔗糖和水蘇糖含量高于其余大豆寡糖,棉子糖含量低于其余大豆寡糖。

    ③ 大豆寡糖Ⅱ的A_860、A_928和A_1 151值均極顯著低于其余來源的大豆寡糖;大豆寡糖Ⅲ的A_860、A_928、A_1 024和A_1 151值均高于其余來源的大豆寡糖。

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