巖藻多糖對大鼠腎臟氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡的緩解作用

蒯云逸 蔣和浩 紅 雷 徐元慶

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

正常生理狀態(tài)下機(jī)體會產(chǎn)生少量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)參與機(jī)體正常代謝，同時(shí)體內(nèi)也存在抑制和清除ROS反應(yīng)的機(jī)制，當(dāng)這一機(jī)制遭到破壞，細(xì)胞內(nèi)ROS的生成過度或生物體抗氧化系統(tǒng)清除過多ROS的能力受損，會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)失衡，進(jìn)而導(dǎo)致代謝失常[1]。過多的ROS可直接作用于細(xì)胞誘導(dǎo)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA/RNA等各種生物分子損傷，造成細(xì)胞損傷，甚至引起細(xì)胞死亡，導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生[2]。許多類型的腎臟疾病如糖尿病腎病[3]、高同型半胱氨酸血癥腎損傷[4]、膿毒癥急性腎損傷[5]、尿酸性腎病[6]及腎細(xì)胞癌[7]等都與ROS的代謝失常所致的氧化應(yīng)激有關(guān)，且常伴隨炎癥反應(yīng)和過度細(xì)胞凋亡。因此，通過減少腎臟組織中ROS的產(chǎn)生進(jìn)而緩解氧化應(yīng)激，減輕炎癥反應(yīng)是防治腎臟損傷的有效途徑。已有研究表明，天然來源的抗氧化劑有助于減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷，改善細(xì)胞內(nèi)酶促和非酶促抗氧化系統(tǒng)[2,8]。大多數(shù)抗氧化劑是從陸生植物中分離出來的，近些年來從幾種海洋生物(如褐藻)中分離出來的巖藻多糖也具有潛在抗氧化活性[9-10]。

巖藻多糖又稱褐藻糖膠、巖藻多糖硫酸酯、褐藻多糖硫酸酯等，主要存在于褐藻和一些海洋無脊椎動物如海膽、海參中[9,11]。巖藻多糖主要為含有L-巖藻糖單元和硫酸鹽基團(tuán)，以及少量的中性單糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)和酚類化合物組成的水溶性多糖[12]。大量研究表明，巖藻多糖在體外和體內(nèi)都具有多種生物學(xué)功能，例如抗炎[13]、抗病毒感染[14]、增強(qiáng)免疫功能[15]和抗腫瘤[16]活性。此外，巖藻多糖已顯示出對幾種天然和異生物質(zhì)毒性的細(xì)胞保護(hù)作用，例如酒精[17]、四氯化碳[18]、對乙酰氨基酚[19]、微囊藻毒素-LR[20]誘導(dǎo)的肝臟損傷和異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟毒性[21]。巖藻多糖還在改善急性腎損傷[22]、慢性腎病[23]和糖尿病腎病[24]方面具有預(yù)防功效。巖藻多糖的這些作用可能是通過抗氧化作用、抗炎和抗細(xì)胞凋亡以及抗纖維化機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的[17,19,25-26]。

綜上所述，作為機(jī)體內(nèi)外環(huán)境物質(zhì)交換的主要場所，腎臟易受到ROS的攻擊而出現(xiàn)損傷，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和功能受損。有研究表明，巖藻多糖在體內(nèi)和體外都具有抗氧化活性[27-28]，是一種天然的抗氧化劑，具有預(yù)防ROS介導(dǎo)的疾病的巨大潛力。但巖藻多糖緩解腎臟氧化損傷的研究鮮見報(bào)道，且其是否通過調(diào)控抗氧化酶的基因表達(dá)而增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶活性，下調(diào)促炎基因表達(dá)緩解機(jī)體炎癥反應(yīng)，以及調(diào)控細(xì)胞凋亡調(diào)控因子的基因表達(dá)緩解細(xì)胞凋亡而發(fā)揮其作用的機(jī)制也未明確。因此，本試驗(yàn)以氧化應(yīng)激所引起的氧化損傷、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡為切入點(diǎn)，通過大鼠腹腔注射Diquat誘導(dǎo)腎臟氧化損傷模型，并飼喂巖藻多糖探索其能否緩解腎臟的氧化損傷、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，以期為將巖藻多糖開發(fā)為保健食品或膳食補(bǔ)充劑以預(yù)防或延遲慢性疾病，或在畜牧生產(chǎn)中用作促進(jìn)畜禽生長和健康的飼料添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和儀器

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始試驗(yàn)，將28只大鼠隨機(jī)分為3個(gè)組單籠飼養(yǎng)，分別為對照組(CT，10只)、氧化應(yīng)激組(OS，9只)以及氧化應(yīng)激與巖藻多糖聯(lián)合處理組(OS+Fuc，9只)，試驗(yàn)期為20 d。整個(gè)試驗(yàn)期，對照組和氧化應(yīng)激組飼喂基礎(chǔ)飼糧，氧化應(yīng)激與巖藻多糖聯(lián)合處理組飼喂試驗(yàn)飼糧(在基礎(chǔ)飼糧中添加250 mg/kg巖藻多糖)。試驗(yàn)第12天，氧化應(yīng)激組和氧化應(yīng)激與巖藻多糖聯(lián)合處理組分別通過腹腔注射10 mg/kg BW的Diquat，建立氧化應(yīng)激模型，對照組注射等量的生理鹽水。之后繼續(xù)飼喂8 d，試驗(yàn)期間，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(22±2)℃，相對濕度為(55±5)%，光暗循環(huán)為12 h。試驗(yàn)結(jié)束后記錄大鼠體重，并采集血液和腎臟組織樣品，用于后續(xù)指標(biāo)測定。

1.3 樣品采集與指標(biāo)測定

1.3.1 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，末次禁食不禁水12 h。將大鼠用麻醉后迅速剖開胸腔，進(jìn)行心臟采血，取血清于-20 ℃冰箱中保存。之后剖開腹腔，分離完整的腎臟組織，并用生理鹽水洗凈2～3次，用濾紙吸干水后稱重，用于計(jì)算腎臟相對重量(腎臟重量/活體重量)，之后于-80 ℃中冷凍保存。

1.3.2 指標(biāo)測定及方法

1.3.2.1 大鼠血清尿素氮和肌酐含量的測定

采用全自動生化分析儀(Hitachi 7020)檢測大鼠血清尿素氮和肌酐含量，測定試劑盒由樂普(北京)診斷技術(shù)股份有限公司提供。

1.3.2.2 大鼠腎臟抗氧化能力的測定

取大鼠腎臟組織，按照試劑盒說明制備組織勻漿液，腎臟總抗氧化能力(T-AOC)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性以及谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量的測定均按照商用試劑盒(南京建成生物工程研究所)，根據(jù)試劑盒說明用分光光度計(jì)進(jìn)行測定。

1.3.2.3 大鼠腎臟抗氧化酶、炎性細(xì)胞因子以及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的測定

根據(jù)試劑盒制造商的說明，使用商業(yè)TRIzol試劑盒從腎臟組織樣品中提取細(xì)胞總RNA，并使用瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop ND-1000紫外分光光度計(jì)對其完整性、純度和濃度進(jìn)行測定。之后使用商業(yè)PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa)，將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。PCR反應(yīng)混合物由2.0 μL cDNA模板、0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物、10.0 μL SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)、0.4 μL ROX參比染料(TaKaRa)和6.8 μL雙蒸水組成。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)熱變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用GraphPad Prism 8分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用單因素進(jìn)行方差分析(one-way ANOVA)，之后采用LSD多重比較用于進(jìn)行確定方差分析后的組間差異顯著性比較，并使用GraphPad Prism 8進(jìn)行繪圖。試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)”，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示差異趨于顯著。

2 結(jié) 果

2.1 巖藻多糖對大鼠體重和腎臟重量的影響

如圖1所示，各組大鼠中，對照組大鼠終末體重和腎臟重量最高，且均極顯著高于氧化應(yīng)激組和氧化應(yīng)激與巖藻多糖聯(lián)合處理組(P<0.01)，但氧化應(yīng)激與巖藻多糖聯(lián)合處理組和氧化應(yīng)激組大鼠終末體重和腎臟重量無顯著差異(P>0.05)；3組之間腎臟相對重量無顯著差異(P>0.05)。

CT：對照組；OS：氧化應(yīng)激組；OS+Fuc：氧化應(yīng)激與巖藻多糖聯(lián)合處理組。數(shù)據(jù)柱標(biāo)注*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。下圖同。

2.2 巖藻多糖對大鼠血清尿素氮和肌酐含量的影響

如圖2所示，氧化應(yīng)激組大鼠血清尿素氮和肌酐含量均顯著高于對照組(P<0.05)；氧化應(yīng)激與巖藻多糖聯(lián)合處理組大鼠血清尿素氮含量低于氧化應(yīng)激組(P=0.061)，血清肌酐含量顯著低于氧化應(yīng)激組(P<0.05)。

圖2 巖藻多糖對大鼠血清尿素氮和肌酐含量的影響

2.3 巖藻多糖對大鼠腎臟抗氧化能力的影響

如圖3所示，與對照組相比，氧化應(yīng)激組大鼠腎臟MDA含量顯著升高(P<0.05)，而腎臟T-AOC以及CAT和SOD活性均極顯著降低(P<0.01)。與氧化應(yīng)激組相比，飼喂巖藻多糖降低了大鼠腎臟MDA含量(P=0.052)，并提高了腎臟CAT(P<0.05)、SOD(P=0.068)和GPx(P=0.085)活性，但對腎臟T-AOC沒有顯著影響(P>0.05)。對照組、氧化應(yīng)激組和氧化應(yīng)激與巖藻多糖聯(lián)合處理組大鼠腎臟GSH含量無顯著差異(P>0.05)。

圖3 巖藻多糖對大鼠腎臟抗氧化能力的影響

2.4 巖藻多糖對大鼠腎臟抗氧化酶基因表達(dá)的影響

如圖4所示，與對照組相比，氧化應(yīng)激下調(diào)了大鼠腎臟CAT(P<0.05)、超氧化物歧化酶2(SOD2)(P=0.061)及核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)(P<0.05)的基因表達(dá)，而飼喂巖藻多糖上調(diào)了腎臟CAT(P=0.064)、SOD2(P<0.05)及Nrf2(P<0.01)的基因表達(dá)。對照組、氧化應(yīng)激組和氧化應(yīng)激與巖藻多糖聯(lián)合處理組大鼠腎臟超氧化物歧化酶1(SOD1)、GPx及血紅素加氧酶-1(HO-1)基因表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。

圖4 巖藻多糖對大鼠腎臟抗氧化酶基因表達(dá)的影響

2.5 巖藻多糖對大鼠腎臟炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響

如圖5所示，與對照組相比，氧化應(yīng)激顯著上調(diào)了大鼠腎臟白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的基因表達(dá)(P<0.05)，而飼喂巖藻多糖下調(diào)了大鼠腎臟IL-1(P<0.01)、TNF-α(P=0.079)及NF-κB(P<0.05)的基因表達(dá)，但對腎臟IL-6的基因表達(dá)沒有顯著影響(P>0.05)。

圖5 巖藻多糖對大鼠腎臟組織炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響

2.6 巖藻多糖對大鼠腎臟細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖6所示，與對照組相比，氧化應(yīng)激顯著下調(diào)了大鼠腎臟B淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2(Bcl-2)的基因表達(dá)(P<0.05)，顯著上調(diào)了腎臟B淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)以及凋亡相關(guān)因子配體(FasL)的基因表達(dá)(P<0.05)。與氧化應(yīng)激組相比，飼喂巖藻多糖極顯著上調(diào)了大鼠腎臟Bcl-2的基因表達(dá)(P<0.01)，下調(diào)了腎臟Bax(P<0.01)、Caspase-8(P<0.01)、凋亡相關(guān)因子(Fas)(P<0.01)以及FasL(P=0.064)的基因表達(dá)，并極顯著提高了Bcl-2與Bax的基因表達(dá)比值(P<0.01)。此外，與對照組相比，氧化應(yīng)激與巖藻多糖聯(lián)合處理極顯著上調(diào)了大鼠腎臟Bcl-2的基因表達(dá)(P<0.01)，顯著下調(diào)了腎臟Bax(P<0.01)、Caspase-9(P<0.05)和Fas(P<0.05)的基因表達(dá)，并極顯著提高了Bcl-2與Bax的基因表達(dá)比值(P<0.01)。

圖6 巖藻多糖對大鼠腎臟細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討 論

氧化應(yīng)激是Diquat誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的主要方式。當(dāng)Diquat進(jìn)入機(jī)體后，在還原型輔酶Ⅱ和細(xì)胞色素還原酶作用下，其氧化還原循環(huán)導(dǎo)致高度不穩(wěn)定的Diquat自由基將電子轉(zhuǎn)移到分子氧上，形成超氧陰離子，引起機(jī)體產(chǎn)生過量的ROS，ROS會與細(xì)胞大分子相互作用，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、酶功能障礙和基因毒性，從而導(dǎo)致線粒體功能障礙，進(jìn)一步造成廣泛的細(xì)胞損傷和死亡[29-30]。此外，Diquat通過抑制GPx、SOD和CAT等關(guān)鍵抗氧化酶來降低細(xì)胞的T-AOC。所以Diquat作為常用的試驗(yàn)用氧化應(yīng)激原，在多種模式動物中均可成功建立氧化應(yīng)激模型。腎臟是Diquat的主要排泄器官，81%急性Diquat中毒患者會出現(xiàn)急性腎臟損傷[31]，腎臟存在著明顯的腎小管壞死[32]。研究表明，巖藻多糖在體外試驗(yàn)中具有顯著的抗氧化活性，對羥基自由基和超氧陰離子的形成具有抑制作用，對ROS的清除率達(dá)到14%～26%[33]，是一種極好的天然抗氧化劑，具有預(yù)防ROS導(dǎo)致的疾病的巨大潛力。本試驗(yàn)通過給大鼠腹腔注射10 mg/kg BW的Diquat，導(dǎo)致其腎臟組織中超氧陰離子的產(chǎn)生，能攻擊生物膜上的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，從而導(dǎo)致大鼠腎臟組織中MDA含量的升高以及T-AOC、SOD和CAT活性的降低。本試驗(yàn)中，氧化應(yīng)激組大鼠血清尿素氮和肌酐含量相比于對照組顯著提高，而且大鼠的終末體重和腎臟重量均極顯著下降，顯示大鼠的腎臟受到了氧化應(yīng)激損傷，表明本試驗(yàn)成功建立了大鼠腎臟氧化損傷的模型。飼喂巖藻多糖能降低受到氧化損傷的大鼠腎臟組織的MDA含量，而且主要通過提高腎臟SOD2和CAT基因的表達(dá)使得腎臟SOD和CAT的活性有所提高，并能夠提高腎臟GPx的活性。SOD將超氧陰離子轉(zhuǎn)化為過氧化氫，之后主要通過CAT和GPx將其轉(zhuǎn)化為分子氧和水，從而緩解大鼠腎臟組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)。此外，飼喂巖藻多糖降低了氧化應(yīng)激大鼠血清尿素氮和肌酐含量，這也證明巖藻多糖緩解了腎臟氧化損傷。這些結(jié)果與之前巖藻多糖對二嗪酮誘導(dǎo)大鼠腎臟組織損傷[34]、微囊藻毒素-LR誘導(dǎo)的腎臟損傷[20]和低蛋白質(zhì)飲食誘導(dǎo)老年小鼠腎臟損傷[35]的緩解作用的研究一致。

巖藻多糖的抗氧化活性可能由直接的自由基清除活性和細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制2個(gè)主要因素共同決定。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，巖藻多糖對表現(xiàn)出不同程度的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基和羥基自由基清除活性[36-37]。這可能與巖藻多糖的分子質(zhì)量和硫酸鹽含量有關(guān)，如巖藻多糖中的低分子質(zhì)量和高硫酸鹽含量呈現(xiàn)更強(qiáng)的自由基清除活性[12]。動物體內(nèi)試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，巖藻多糖可明顯提高輻射小鼠體內(nèi)[38]和低蛋白質(zhì)飲食老年小鼠腎臟[35]中GSH含量，降低MDA含量，說明巖藻多糖可提高清除機(jī)體內(nèi)的自由基能力。本研究并未發(fā)現(xiàn)巖藻多糖對大鼠腎臟組織中GSH含量的影響。因此，巖藻多糖可能主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)發(fā)揮積極作用。Hong等[39]也證實(shí)巖藻多糖可以在轉(zhuǎn)錄的基因水平上直接相互作用，并誘導(dǎo)參與抗氧化防御系統(tǒng)的酶如GPx、SOD和CAT的增加。同時(shí)，飼喂巖藻多糖大鼠腎臟組織中Nrf2基因表達(dá)相比于受到氧化損傷的大鼠顯著上調(diào)，提示巖藻多糖可能激活了Nrf2信號通路，抑制了大鼠腎臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)。Nrf2是調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)也是維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的中樞調(diào)節(jié)因子。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，可以引起Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核，上調(diào)Nrf2下游抗氧化酶如SOD、CAT和GPx的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化作用，以維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原的穩(wěn)定性。本研究中，飼喂巖藻多糖可顯著上調(diào)大鼠腎臟組織中SOD、CAT和Nrf2的基因表達(dá)也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。體外研究也發(fā)現(xiàn)，巖藻多糖可以顯著提高Nrf2的表達(dá)水平，并促進(jìn)Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核，從而降低高脂引起的神經(jīng)前體細(xì)胞C17.2細(xì)胞中ROS水平的提高[40]，這與本研究結(jié)論一致?？傊瑤r藻多糖可以通過Nrf2途徑上調(diào)抗氧化酶的基因表達(dá)增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，從而緩解腎臟的氧化損傷。

另外，ROS可以作為細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號激活細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB，引起核內(nèi)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，上調(diào)炎癥介質(zhì)的表達(dá)來誘導(dǎo)炎癥，是諸多急、慢性及免疫失調(diào)疾病發(fā)生的分子基礎(chǔ)。ROS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是由促炎細(xì)胞因子如IL-1、IL-6和TNF-α的作用介導(dǎo)的，這些細(xì)胞因子具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，其中IL-1失調(diào)會導(dǎo)致自身炎癥、自身免疫和感染的產(chǎn)生和發(fā)展；IL-6具有調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生長與分化的功能，同時(shí)也是自身免疫性和慢性炎癥疾病的主要致病介質(zhì)；而TNF-α除了可以殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞之外，還可以刺激機(jī)體局部炎癥反應(yīng)。文獻(xiàn)記錄了氧化應(yīng)激與促炎因子表達(dá)之間的相互關(guān)系，即氧化應(yīng)激增加促炎因子表達(dá)，而促炎因子又促進(jìn)氧化應(yīng)激[41-42]。所以，氧化應(yīng)激促進(jìn)炎癥因子參與大鼠腎臟的炎癥，可能進(jìn)一步加重腎臟氧化損傷。因此，我們研究了巖藻多糖是否對Diquat引起的腎臟損傷具有抗炎作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠腎臟受到氧化損傷時(shí)NF-κB表達(dá)顯著上調(diào)，這說明Diquat誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)了炎癥通路NF-κB的激活，并顯著上調(diào)了大鼠腎臟組織中促炎因子IL-1、IL-6和TNF-α的表達(dá)；飼喂巖藻多糖則降低了氧化應(yīng)激引起的促炎因子IL-1、TNF-α及NF-κB表達(dá)的上調(diào)，其主要途徑可能是通過調(diào)控NF-κB通路，并下調(diào)下游促炎因子IL-1和TNF-α基因表達(dá)，進(jìn)而減輕腎臟炎癥。這些結(jié)果與之前巖藻多糖降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量以及腎臟中IL-6的表達(dá)[24,43-44]，巖藻多糖緩解二嗪酮誘導(dǎo)的腎臟組織損傷大鼠血清IL-6和TNF-α含量上升[34]，以及巖藻多糖降低微囊藻毒素-LR誘導(dǎo)的腎臟損傷小鼠血清白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和TNF-α含量[20]的研究結(jié)果一致。這表明巖藻多糖能夠通過NF-κB途徑下調(diào)促炎因子的表達(dá)，從而緩解腎臟的氧化損傷。

巖藻多糖對腎臟氧化損傷的保護(hù)作用可能也與其抗細(xì)胞凋亡機(jī)制有關(guān)[17,19,26]。細(xì)胞凋亡是由基因所決定的細(xì)胞自動結(jié)束生命的程序性死亡過程，凋亡通路包括死亡受體和線粒體凋亡通路。其中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)依賴途徑可以通過內(nèi)在發(fā)生線粒體途徑和外源性死亡受體途徑，分別以Caspase-9和Caspase-8的激活為標(biāo)志[45]。Bcl-2基因家族，是與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切的原基因之一，其中Bcl-2是凋亡抑制因子，Bax為促凋亡因子，Bax通過插入線粒體外膜并通過寡聚化形成孔來促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而誘導(dǎo)促凋亡因子的釋放[46]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，氧化應(yīng)激上調(diào)了大鼠腎臟組織中Bax基因表達(dá)，并下調(diào)了Bcl-2基因表達(dá)，飼喂巖藻多糖能夠有效扭轉(zhuǎn)Bax表達(dá)的上調(diào)和Bcl-2表達(dá)的下調(diào)。Bcl-2和Bax作為Caspase-3的上游調(diào)控機(jī)制，可調(diào)節(jié)線粒體的通透性，Bcl-2過表達(dá)后可阻斷細(xì)胞色素C(Cyt-C)的釋放，抑制Caspase的活性[47]，從而抑制大鼠腎臟細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞收到凋亡信號后，Bid被激活為t-Bid。t-Bid與Bax結(jié)合并導(dǎo)致其構(gòu)象變化被激活，促進(jìn)Cyt-C釋放到細(xì)胞質(zhì)中并激活Caspase-9，然后裂解Caspase-3導(dǎo)致線粒體凋亡[48]。此外，本研究中，飼喂巖藻多糖還下調(diào)了氧化應(yīng)激大鼠腎臟組織中Fas和FasL的基因表達(dá)，這可能是由于減少了死亡受體途徑Fas受體與FasL三聚體結(jié)合，抑制了Caspase-8的激活，最終抑制了大鼠腎臟細(xì)胞的凋亡。與本研究結(jié)果相似，一項(xiàng)關(guān)于巖藻多糖對對乙酰氨基酚引起的大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用的研究表明，巖藻多糖降低了大鼠肝臟細(xì)胞Bax和活化Caspase-3的增強(qiáng)表達(dá)，以及增加了被對乙酰氨基酚下調(diào)的Bcl-2的蛋白表達(dá)，發(fā)揮了對對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝臟細(xì)胞凋亡的有效保護(hù)[19]。Zhu等[49]對雄性小鼠灌服巖藻多糖，結(jié)果顯示巖藻多糖可以有效緩解高脂高糖飼糧誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞Bax、Caspase-9和Caspase-3等線粒體凋亡通路關(guān)鍵基因表達(dá)的上調(diào)，但對Fas/FasL通路中的Fas和FasL等關(guān)鍵基因的表達(dá)沒有影響。這與本研究結(jié)果略有不同，這可能與試驗(yàn)所使用的巖藻多糖的劑量和分子量不同有關(guān)，但具體的機(jī)制還需進(jìn)一步研究?？傮w而言，巖藻多糖能夠通過調(diào)控死亡受體和線粒體凋亡通路細(xì)胞凋亡調(diào)控因子的基因表達(dá)來緩解細(xì)胞凋亡，從而緩解腎臟損傷。

4 結(jié) 論

巖藻多糖可以通過Nrf2途徑上調(diào)氧化應(yīng)激大鼠腎臟抗氧化酶基因表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力；也可通過NF-κB途徑下調(diào)促炎因子的基因表達(dá)，緩解腎臟炎癥反應(yīng)，并通過調(diào)控細(xì)胞凋亡調(diào)控因子的基因表達(dá)來緩解腎臟細(xì)胞凋亡?？傊瑤r藻多糖對于大鼠腎臟氧化損傷有一定的緩解作用，其保護(hù)機(jī)制可能與巖藻多糖的抗氧化活性、抑制炎癥反應(yīng)和抗細(xì)胞凋亡作用有關(guān)。