琥珀酸對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88感染小鼠腸道炎癥的影響及其機(jī)制研究

黃國文 張若凡 葉艷新 李 軒 朱偉云 余凱凡

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物研究室，江蘇省消化道營養(yǎng)與動物健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家動物消化道營養(yǎng)國際聯(lián)合研究中心，南京 210095)

在現(xiàn)代畜牧業(yè)集約化、規(guī)?；纳a(chǎn)環(huán)境下，很多細(xì)菌性感染疾病隨之發(fā)生，其中，大腸桿菌性腹瀉是畜牧業(yè)中發(fā)病率和傳染性較高的疾病之一[1]。產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)極易導(dǎo)致仔豬腹瀉，并引起腸道炎癥和腸道損傷[2]。ETEC主要通過糞口途徑傳播并侵入消化道內(nèi)，ETEC的菌毛黏附素可促進(jìn)仔豬腸上皮細(xì)胞的黏附，分泌的腸毒素導(dǎo)致液體電解質(zhì)紊亂和酸堿失衡[3-4]?？股豙5]和重金屬化合物[6]如氧化鋅和硫酸銅在養(yǎng)豬業(yè)中廣泛用于治療大腸桿菌感染。然而，抗生素耐藥性細(xì)菌和重金屬污染問題引起了人們的強(qiáng)烈關(guān)注。因此，尋找替代性抵抗與治療大腸桿菌的方法對畜牧生產(chǎn)至關(guān)重要。

琥珀酸是宿主細(xì)胞三羧酸循環(huán)的中間代謝物，在線粒體基質(zhì)[7]中參與細(xì)胞呼吸途徑，同時，也可由腸道微生物代謝產(chǎn)生。近年來對琥珀酸的研究發(fā)現(xiàn)，琥珀酸通過抑制脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase domain，PHD)的活性穩(wěn)定缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)，HIF-α介導(dǎo)炎癥因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的表達(dá)，從而影響炎癥的發(fā)生[8]。有研究表明，琥珀酸在小腸內(nèi)能夠通過促進(jìn)簇狀細(xì)胞和杯狀細(xì)胞增生，進(jìn)而激活Ⅱ型免疫來起到抗菌和抗寄生蟲感染的作用[9-10]。但琥珀酸對大腸桿菌誘導(dǎo)的腸道損傷的影響尚未見報(bào)道。因此，本研究通過在飲水中添加琥珀酸，從腸道形態(tài)、炎癥和腸道屏障等方面來評估琥珀酸對小鼠腸道炎癥的保護(hù)作用效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)動物為購自南京青龍山動物繁殖場的7周齡C57BL/6J雄性小鼠40只，隨機(jī)分為4組：正常對照組(NC組)、琥珀酸組(SUC組)、大腸桿菌組(ETEC組)和琥珀酸+大腸桿菌組(SUC+ETEC組)，每組10只小鼠，單籠飼養(yǎng)。4組小鼠均飲用去離子水，SUC和SUC+ETEC組小鼠在飲水中添加20 mmol/L的琥珀酸。試驗(yàn)第4天，ETEC和SUC+ETEC組每天灌胃濃度1×1010CFU/mL的ETEC K88菌液0.2 mL，持續(xù)3 d，恢復(fù)1 d。4組小鼠均飼喂常規(guī)飼糧，自由采食和飲水，適應(yīng)期7 d，試驗(yàn)期8 d。整個試驗(yàn)期每天稱小鼠的體重和觀察小鼠的狀態(tài)。

1.2 菌株及其培養(yǎng)方法

ETEC K88由本實(shí)驗(yàn)室前期從豬糞樣中分離得到，并保種儲存。從-20 ℃冰箱取出保存的ETEC K88，于37 ℃復(fù)蘇。用接種環(huán)蘸取復(fù)蘇的菌種到裝有液體LB培養(yǎng)基的試管中，37 ℃，120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)16 h得到菌種復(fù)蘇液。從菌種復(fù)蘇液中吸取10 μL到1 mL的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃，120 r/min條件下培養(yǎng)5 h，得到細(xì)菌懸液。然后再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，吸取200 μL的細(xì)菌懸液至40 mL的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4 h后，在4 ℃，3 500×g條件下離心15 min，再用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至一定濃度，最后根據(jù)小鼠體重計(jì)算出菌液添加量。

1.3 空腸組織切片和蘇木精-伊紅(HE)染色

截取1 cm左右無食糜的空腸組織，放入4%多聚甲醛固定。再經(jīng)過脫水、浸蠟、切片、脫蠟、染色、脫水和封固之后得到完整的切片。最后使用虛擬顯微鏡(Simon-01，Olympus Corporation，日本)觀察切片和拍照，并記錄絨毛高度和隱窩深度。

1.4 炎癥因子濃度的測定

血漿和空腸中促炎因子[腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)]和抗炎因子[白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)和白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)]濃度采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定，試劑盒購自南京建成生物工程研究所，具體的試驗(yàn)步驟參照試劑盒說明書?？漳c組織中炎癥因子濃度需先測定其中蛋白質(zhì)的濃度，然后用炎癥因子濃度值與蛋白質(zhì)濃度比值表示。

1.5 血漿中內(nèi)毒素、二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)和D-乳酸(D-lactic acid，D-LA)濃度的測定

血漿中內(nèi)毒素、DAO和D-LA濃度采用試劑盒測定，試劑盒購自南京建成生物工程研究所，根據(jù)試劑盒的說明書步驟，稀釋成合適的濃度進(jìn)行檢測，通過酶標(biāo)儀(Spark 10M，TECAN公司，瑞士)檢測相應(yīng)的光密度(optical density，OD)值，最后計(jì)算出最終的濃度。

1.6 腸上皮屏障相關(guān)蛋白表達(dá)水平的測定

腸上皮屏障相關(guān)蛋白表達(dá)水平通過免疫組化分析緊密連接蛋白閉鎖小帶蛋白(zonula occludens-1，ZO-1)、密封蛋白-1(Claudin-1)和咬合蛋白(Occludin)的平均OD值來反映。所有的試驗(yàn)操作均在武漢賽維爾生物科技有限公司進(jìn)行，具體的試驗(yàn)步驟如下：首先經(jīng)過切片、脫蠟和抗原修復(fù)步驟，再經(jīng)過血清封閉、一抗孵育和二抗孵育，然后經(jīng)過PBS洗滌后進(jìn)行染色和復(fù)染，最后通過脫水和封片成型。使用虛擬顯微鏡(Simon-01，Olympus Corporation，日本)進(jìn)行觀察和拍照。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用LSD法分析各組間的差異顯著性，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05為差異顯著。使用GraphPad Prism 8.0軟件制作數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié) 果

2.1 琥珀酸對ETEC K88感染小鼠體重和器官指數(shù)的影響

由表1可見，各組之間初始體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。與NC組相比，ETEC組小鼠造模后體重顯著降低(P<0.05)；與ETEC組相比，SUC+ETEC組造模后體重顯著升高(P<0.05)。各組之間肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)無顯著差異(P>0.05)。與NC組相比，SUC組和SUC+ETEC組小腸長度顯著增加(P<0.05)。

表1 琥珀酸對ETEC K88感染小鼠體重和器官指數(shù)的影響

2.2 琥珀酸對ETEC K88感染小鼠空腸組織形態(tài)的影響

空腸組織切片HE染色結(jié)果顯示，ETEC K88感染對空腸組織中黏膜、上皮細(xì)胞的損傷不明顯(圖1)。由表2可見，與NC組相比，ETEC組空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度降低，但差異不顯著(P>0.05)。與ETEC組相比，SUC+ETEC組空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度顯著升高(P<0.05)。各組之間空腸隱窩深度無顯著差異(P>0.05)。

圖1 小鼠的空腸組織形態(tài)

表2 琥珀酸對ETEC K88感染小鼠空腸組織形態(tài)的影響

2.3 琥珀酸對ETEC K88感染小鼠血漿炎癥因子濃度的影響

由表3可見，與NC組相比，ETEC組血漿中促炎因子TNF-α和IL-6濃度顯著提高(P<0.05)，抗炎因子IL-10和IL-4濃度顯著降低(P<0.05)；與ETEC組相比，SUC+ETEC組血漿中促炎因子IL-6濃度顯著降低(P<0.05)，但抗炎因子IL-10和IL-4濃度無顯著差異(P>0.05)。

2.4 琥珀酸對ETEC K88感染小鼠空腸炎癥因子濃度的影響

由表4可見，NC組、SUC組和SUC+ETEC組空腸中促炎因子TNF-α和IL-6濃度顯著低于ETEC組(P<0.05)，而抗炎因子IL-10濃度顯著高于ETEC組(P<0.05)。NC組和SUC組空腸中抗炎因子IL-4濃度顯著高于ETEC組和SUC+ETEC組(P<0.05)；SUC+ETEC組IL-4濃度高于ETEC組，但差異不顯著(P>0.05)。

表4 琥珀酸對ETEC K88感染小鼠空腸炎癥因子濃度的影響

2.5 琥珀酸對ETEC K88感染小鼠血漿內(nèi)毒素、DAO和D-LA濃度的影響

由表5可見，與NC組相比，ETEC組血漿中內(nèi)毒素、DAO和D-LA濃度顯著升高(P<0.05)；與ETEC組相比，SUC+ETEC組血漿中內(nèi)毒素和D-LA濃度顯著降低(P<0.05)。

表5 琥珀酸對ETEC K88感染小鼠血漿內(nèi)毒素、DAO和D-LA濃度的影響

2.6 琥珀酸對ETEC K88感染小鼠的腸道屏障相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

ZO-1、Claudin-1與Occludin免疫組化染色圖如圖2所示。由表6可見，與NC組相比，ETEC組空腸組織中緊密連接蛋白Claudin-1和Occludin的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與ETEC組相比，SUC+ETEC組空腸組織中緊密連接蛋白Claudin-1和Occludin的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。各組之間空腸組織中緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)。

圖2 ZO-1、Claudin-1與Occludin免疫組化染色圖

表6 琥珀酸對ETEC K88感染小鼠空腸緊密連接蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

3.1 琥珀酸對ETEC K88感染小鼠生長狀況的影響

ETEC是畜牧生產(chǎn)中主要的病原菌之一，其在仔豬上致病性的產(chǎn)生依賴于宿主特異性的菌毛黏附素和分泌的腸毒素。有研究表明，在小鼠模型上，ETEC K88感染主要通過激活Toll樣受體2/4(Toll-like receptor 2/4，TLR2/4)信號通路，促進(jìn)腸道炎癥因子的分泌和表達(dá)，引起小鼠腸道損傷和腹瀉的產(chǎn)生[11]。ETEC K88感染小鼠的特征主要是改變緊密連接蛋白的完整性和破壞細(xì)胞旁離子通道，導(dǎo)致體重下降和腹瀉[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，ETEC K88感染降低了小鼠的體重，表明ETEC K88感染小鼠造模成功。Han等[13]研究表明，灌胃乳桿菌能夠降低ETEC誘導(dǎo)的小鼠體重下降，改善腸道炎癥和微生物失調(diào)。本研究中，菌群代謝產(chǎn)物與宿主代謝中間體——琥珀酸對腸道炎癥的影響結(jié)果表明，飲水添加琥珀酸能夠緩解ETEC K88感染引起的體重下降。

3.2 琥珀酸對ETEC K88感染小鼠腸道組織形態(tài)的影響

琥珀酸作為微生物代謝產(chǎn)物，參與調(diào)節(jié)腸道與機(jī)體代謝。有研究表明，給肥胖小鼠灌胃琥珀酸產(chǎn)生菌狄氏副擬桿菌，可增加腸道中琥珀酸濃度，減少體重的增加，并調(diào)節(jié)膽汁酸代謝，緩解機(jī)體代謝紊亂[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，飲水添加琥珀酸緩解了ETEC K88感染引起的小鼠體重下降，并且添加琥珀酸改善了小鼠空腸組織形態(tài)，提高了空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度。而腸道形態(tài)的完整性對腸道物理屏障功能的發(fā)揮起到至關(guān)重要的作用，與營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收息息相關(guān)[15]，絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度作為評估腸道形態(tài)完整性的重要組成部分，是衡量腸道發(fā)育和吸收功能的重要指標(biāo)[16]。絨毛高度升高，單位面積的細(xì)胞數(shù)增加，則消化吸收功能增強(qiáng)；隱窩深度反映了隱窩干細(xì)胞的分化程度，隱窩變淺，相應(yīng)細(xì)胞分化增強(qiáng)，消化吸收能力增強(qiáng)[17]。我們前期在豬上的研究也發(fā)現(xiàn)了一致的結(jié)果，飼糧添加1%琥珀酸顯著提高了空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度，并降低了隱窩深度[18]。類似地，其他菌群代謝物也被證明可以改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能，如灌胃短鏈脂肪酸增加了仔豬小腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度，降低了細(xì)胞凋亡的百分比，進(jìn)而促進(jìn)了仔豬腸道發(fā)育[19-20]。

3.3 琥珀酸對ETEC K88感染小鼠腸道免疫功能的影響

琥珀酸緩解ETEC K88感染引起的小鼠腸道損傷可能是其調(diào)節(jié)了免疫應(yīng)答反應(yīng)。研究表明，琥珀酸在炎癥區(qū)域積聚，通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)來調(diào)節(jié)腸道炎癥和纖維化[21]。并且，琥珀酸通過激活簇狀細(xì)胞上化學(xué)信號元件，導(dǎo)致簇狀細(xì)胞和杯狀細(xì)胞增生，激活Ⅱ型免疫反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[9]。在小腸上皮細(xì)胞中，簇狀細(xì)胞可以調(diào)節(jié)腸道Ⅱ型先天性淋巴細(xì)胞(ILC2)-上皮反應(yīng)回路，參與宿主抵抗病原體感染，進(jìn)一步介導(dǎo)免疫反應(yīng)[22]。本研究中，飲水添加琥珀酸有效地降低了血漿和腸道組織中促炎因子TNF-α和IL-6濃度，增加了抗炎因子IL-10和IL-4濃度，緩解了大腸桿菌感染導(dǎo)致的腸道炎癥的發(fā)生。IL-10在胃腸道中也可以由ILC2產(chǎn)生[23]，促進(jìn)機(jī)體的免疫應(yīng)答和組織修復(fù)。IL-4作為2型免疫特征細(xì)胞因子，在寄生蟲感染情況下促進(jìn)腸道簇狀細(xì)胞和杯狀細(xì)胞增生，進(jìn)一步增強(qiáng)腸道免疫應(yīng)答[24]。類似地，在巨噬細(xì)胞中琥珀酸也可能通過琥珀酸受體(succinate receptor 1，SUCNR1)的方式調(diào)節(jié)機(jī)體抗炎反應(yīng)[25]。Keiran等[26]研究發(fā)現(xiàn)，琥珀酸-SUCNR1軸促進(jìn)了巨噬細(xì)胞的抗炎表型，并增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞對包括IL-4在內(nèi)的2型細(xì)胞因子的反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)肥胖相關(guān)的代謝反應(yīng)。

3.4 琥珀酸對ETEC K88感染小鼠腸道屏障相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

腸上皮細(xì)胞暴露于促炎細(xì)胞因子如TNF-α，會影響?zhàn)さ鞍椎姆置?，并?dǎo)致上皮屏障的損傷[27]。腸道屏障的完整性能維持腸腔內(nèi)外的物理平衡。在健康的小鼠體內(nèi)，血漿中內(nèi)毒素、DAO和D-LA濃度處于較低狀態(tài)；當(dāng)腸道受損時，大量的內(nèi)毒素、DAO和D-LA在血漿中累積。本研究中，反映腸道通透性的指標(biāo)如內(nèi)毒素、DAO和D-LA在血漿中的濃度均因ETEC K88感染增加，而飲水添加琥珀酸能降低它們的濃度。雖然已有文獻(xiàn)表明，在肥胖患者中，血漿內(nèi)琥珀酸的循環(huán)水平與腸道通透性呈正相關(guān)[28]。但Osuna-Prieto等[29]研究發(fā)現(xiàn)，這種相關(guān)性與琥珀酸產(chǎn)生菌和利用菌種類之間沒有關(guān)聯(lián)，可能更多與細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)。而本研究通過飲水添加琥珀酸增強(qiáng)腸道通透性可能是通過直接作用影響腸道上皮屏障功能。此外，細(xì)胞間的緊密連接蛋白在維持腸道屏障完整性和腸道通透性中發(fā)揮了重要作用[30]。例如，ZO-1有利于腸道黏膜損傷的修復(fù)[31]；Claudin-1的表達(dá)能夠以Notch依賴的方式誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞增殖，從而增強(qiáng)腸道屏障的功能[32]；Occludin則被認(rèn)為是緊密連接組裝和發(fā)揮功能的調(diào)節(jié)因子[33]。因此，上調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)能夠增強(qiáng)腸道上皮的功能。本研究發(fā)現(xiàn)，在ETEC K88感染的情況下，飲水添加琥珀酸上調(diào)了緊密連接蛋白Claudin-1和Occludin的表達(dá)?？偟膩碚f，飲水添加琥珀酸降低了腸道通透性，提高了腸上皮之間的緊密連接蛋白的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)了腸上皮屏障的功能。

4 結(jié) 論

飲水中添加琥珀酸可顯著改善ETEC K88感染引發(fā)的小鼠空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)血漿和腸道組織炎癥因子的分泌和表達(dá)，降低腸道通透性，并促進(jìn)腸道組織緊密連接蛋白的表達(dá)，從而緩解ETEC K88感染引起的腸道炎癥。