蛋氨酸對HepG2細胞和鴨原代肝細胞生長和脂質(zhì)代謝的影響

吳永保 唐 靜 聞治國 曹俊婷 張 博 邢光楠 謝 明 胡海峰 崔德福 侯水生*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193；2.中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點實驗室，北京 100081；3.河北樂壽鴨業(yè)有限責任公司，滄州 062250)

蛋氨酸(Met)是家禽飼糧中第一限制性氨基酸，對生長發(fā)育起著重要的作用。在飼糧中添加適宜水平的Met可提高家禽生長性能、繁殖性能、免疫能力和抗氧化能力，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等生理過程[1-4]。肝臟是家禽機體脂質(zhì)代謝的主要器官，約90%脂質(zhì)代謝發(fā)生在肝臟中，肝細胞生長狀況直接影響家禽機體脂質(zhì)代謝的能力。研究表明，體外培養(yǎng)的肝細胞系或分離的原代肝細胞能夠表現(xiàn)機體肝臟絕大部分的生理功能，保留和維持機體肝細胞的特性，反映體內(nèi)機體的生理代謝狀態(tài)[5]，另外，利用體外肝細胞模型可以克服在體內(nèi)難以排除無關(guān)因素對脂質(zhì)代謝調(diào)控作用的不足。Qi等[6]研究表明，Met通過鈉離子依賴的中性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白2(sodium-coupled neutral amino acid transporter 2，SNAT2)-磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信號通路調(diào)控奶牛乳腺上皮細胞乳脂肪合成和細胞增殖；申曉婷[7]研究表明，Met限制可能是通過減弱腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)對肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)磷酸化肌球蛋白輕鏈(phosphorylation of myosin light chain，p-MLC)信號通路的激活作用來保護腸上皮屏障功能；左方瑞[8]研究了不同形式的Met源在豬不同細胞系中的代謝特征以及對細胞功能的影響。眾多研究均主要集中在利用腸道細胞和乳腺上皮細胞模型研究Met調(diào)控豬和反芻動物腸道健康和乳腺中乳脂肪分泌的分子機制研究，然而關(guān)于Met調(diào)控體外肝細胞系和鴨原代肝細胞脂質(zhì)代謝方面的研究尚未見報道。因此，本研究選用了HepG2細胞和鴨原代肝細胞2種肝細胞模型，研究Met對肝細胞的生長和脂質(zhì)代謝的影響，以期為Met調(diào)控肝細胞生長和脂質(zhì)代謝方面提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗細胞

HepG2細胞購自中國科學院細胞庫。鴨原代肝細胞由鴨胚分離并提純制備，具體步驟如下：選用14胚齡的鴨胚，消毒后取胚體肝臟組織置于磷酸鹽緩沖液(PBS)的培養(yǎng)皿中，清洗2～3次，手術(shù)刀切碎，加入37 ℃預熱的0.25%胰蛋白酶(約1 mL/鴨胚)，用槍頭用力吹打1～2 min，加入等量含有胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基終止消化，100 μm細胞過濾篩過濾，700 r/min離心10 min，棄上清，培養(yǎng)基重懸細胞，重復離心2～3次，去除死細胞及雜細胞。加入2 mL無Met添加的培養(yǎng)基，細胞計數(shù)，制備成細胞接種儲備液。取一定量的儲備液加入5 mL正常培養(yǎng)基中，把細胞接種到細胞瓶中，培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)糖原染色試驗。

1.1.2 試驗試劑

DMEM培養(yǎng)基(不含Met)定制于大連美倫生物科技有限公司；CCK-8試劑盒(cell counting kit-8)、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉購自于大連美倫生物科技有限公司；FBS、青霉素-鏈霉素(雙抗，10 000 U/mL)購自于美國Gibco公司；L-蛋氨酸(L-Met)、油酸(oleic acid)、十二烷基硫酸鈉(SDS)購自于美國Sigma公司；PBS購自美國HyClone公司；RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量PCR(RT-PCR)反應相應試劑盒均購自于日本TaKaRa公司；甘氨酸、Tris、0.25%胰蛋白酶、20×Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBS緩沖液)、吐溫-20、油紅O染色試劑盒(細胞專用)、RIPA蛋白裂解液(強)、糖原過碘酸-雪夫(PAS)染色液試劑盒購自于北京索萊寶生物公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(0.45 μm)購自于美國Pall公司；96(384)孔熒光定量PCR板購自于美國Axygen公司；超敏電化學發(fā)光(ECL)化學發(fā)光試劑盒購自于北京蘭易科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、Western blot Stripping Buffer購自于美國Thermo公司；甲醇、乙二胺四乙酸(EDTA)購自國藥集團化學試劑有限公司；Western blot預制膠購自于金斯瑞生物科技股份有限公司。

1.2 試驗設計

1.2.1 HepG2細胞試驗

1.2.1.1 培養(yǎng)基中添加Met對HepG2細胞存活率的影響

采用單因素試驗設計，在細胞培養(yǎng)基中添加不同劑量Met儲備液(100 mmol/L)，使培養(yǎng)基中Met終濃度分別為0、12.5、25、50、100、200 μmol/L，共設置6個處理，每個處理5個重復。按照5 000個細胞/孔置于96孔板中，培養(yǎng)24 h，利用CCK-8細胞計數(shù)說明書測定細胞存活率。

1.2.1.2 培養(yǎng)基中添加Met對HepG2細胞脂質(zhì)沉積的影響

采用單因素試驗設計，在細胞培養(yǎng)基中添加不同劑量Met儲備液(100 mmol/L)，使培養(yǎng)基中Met終濃度分別為0、25、200 μmol/L，且添加0.25 mmol/L油酸誘導細胞高脂模型。共設置3個處理，每個處理3個重復。將饑餓12 h的HepG2細胞按照8×105個細胞/孔置于6孔板中，不同Met濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，按照CCK-8法測定細胞數(shù)目以及油紅O染色，評價細胞脂質(zhì)沉積狀況。

1.2.1.3 培養(yǎng)基中添加Met對HepG2細胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因和蛋白表達的影響

采用單因素試驗設計，在細胞培養(yǎng)基中添加不同劑量Met儲備液(100 mmol/L)，使培養(yǎng)基中Met終濃度分別為0、25、200 μmol/L，共設置3個處理，每個處理3個重復。將饑餓12 h的HepG2細胞按照8×105個細胞/孔置于6孔板中，不同Met濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，2個孔合并為1個重復，提取其總RNA或蛋白，用于后續(xù)RT-PCR和Western blot試驗，檢測HepG2細胞生長代謝相關(guān)基因和蛋白表達量。

1.2.2 鴨原代肝細胞試驗

1.2.2.1 培養(yǎng)基中添加Met對鴨原代肝細胞存活率的影響

采用單因素試驗設計，在細胞培養(yǎng)基中添加不同劑量Met儲備液(100 mmol/L)，使培養(yǎng)基中Met終濃度分別為0、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L，共7設置個處理，每個處理8個重復。按照8 000細胞/孔置于96孔板中，培養(yǎng)24 h，利用CCK-8細胞計數(shù)說明書測定細胞存活率。

1.2.2.2 培養(yǎng)基中添加Met對鴨原代肝細胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因和蛋白表達的影響

采用單因素試驗設計，在細胞培養(yǎng)基中添加不同劑量Met儲備液(100 mmol/L)，使培養(yǎng)基中Met終濃度分別為0、25、100和200 μmol/L，共設置4個處理，每個處理5個重復。將分離出的鴨原代肝細胞按照2×106個細胞/孔置于6孔板中，在不同Met濃度培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，提取其總RNA和蛋白并測定其濃度，用于后續(xù)RT-PCR和Western blot試驗，檢測鴨原代肝細胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因和蛋白表達量。

1.3 測定方法

1.3.1 細胞增殖活性試驗

利用CCK-8試劑盒檢測培養(yǎng)基中不同濃度Met對HepG2細胞或鴨原代肝細胞存活率的影響。流程如下：培養(yǎng)HepG2細胞或鴨原代肝細胞至70%～80%融合，利用無FBS添加的培養(yǎng)基饑餓細胞12 h，消化計數(shù)，以5 000個/孔的密度接種至96孔板中，利用不同Met濃度的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，然后每孔加入10 μL CCK-8增強液，孵育0.5～2.0 h，在450 nm處測定吸光度(OD)值，通過OD值計算細胞的存活率，具體參照細胞增殖及毒性檢測試劑盒(CCK-8)說明書。

1.3.2 細胞油紅O染色和OD值測定

利用油紅O染色試劑盒評價培養(yǎng)基Met濃度對HepG2細胞脂質(zhì)沉積的影響。詳細步驟及注意事項參照油紅O染色試劑盒說明書。在顯微鏡下觀察拍照后，棄去蒸餾水，加入1 mL 100%異丙醇，孵育10 min，將油紅洗脫到異丙醇中，充分吹打，混合均勻，吸取200 μL加入至96孔板中，每個樣品3個重復孔，用酶標儀在520 nm波長測定其OD值，以100%異丙醇作為空白對照。根據(jù)測定的細胞存活率，計算單位細胞數(shù)目油紅O的吸光度(OD520 nm/細胞存活率)來表示細胞脂質(zhì)沉積狀況。

1.3.3 細胞mRNA提取及RT-PCR

利用不同Met濃度的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2或鴨原代肝細胞24 h，然后棄去上層培養(yǎng)基，PBS沖洗1～2次，加入RNAiso Plus提取總RNA，RNAase-free水復溶，測定每個樣品總RNA濃度和質(zhì)量，保證各樣品OD260/280在1.8～2.0之間，OD260/230大于2.0，并用焦碳酸二乙酯(DEPC)水稀釋總RNA濃度。按照TaKaRa Super RT Kit說明，把總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物采用Primer 6.0軟件設計(表1)，由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。以β-肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參，采用SYBR Green熒光定量PCR對相關(guān)基因進行定量分析。RT-PCR反應體系為10 μL：2×TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 5 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL，引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，RNase-free ddH2O 3 μL。反應條件：95 ℃ 30 s預變性；隨后95 ℃ 5 s變性，60 ℃ 34 s退火，95 ℃ 15 s延伸，進行40個循環(huán)；然后95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。根據(jù)熔解曲線得出的待測樣品Ct值，采用2-ΔΔCt法計算基因表達量。

表1 HepG2細胞和鴨原代肝細胞RT-PCR引物序列

1.3.4 細胞Western blot試驗

利用不同Met濃度的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細胞或鴨原代肝細胞24 h，棄去上層培養(yǎng)基，PBS沖洗1～2次，加入裂解液提取蛋白，利用BCA法測定各樣品的蛋白濃度，各樣品加入相同劑量(20～30 mg)蛋白進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(80 V恒壓10 min，然后140 V恒壓35～45 min)，電泳分離蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上(130 mA恒流60 min)，5%脫脂奶粉4 ℃封閉2 h，然后4 ℃孵育一抗過夜，用洗膜緩沖液(TBST)洗膜3～5次，每次5～7 min，室溫孵育二抗2 h(1∶5 000稀釋)，利用TBST洗膜。然后孵育發(fā)光液1～3 min后，利用全自動化學發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)儀器(Tanon 5200 Multi多功能成像系統(tǒng))收集條帶曝光信號，最終使用圖象處理系統(tǒng)(Tanon Gis系列數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng))分析蛋白條帶的灰度值。以β-微管蛋白(β-tubulin)作為內(nèi)參，計算目的蛋白表達量。目的蛋白及內(nèi)參蛋白一抗信息如下：泛醌還原型酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶Fe-S蛋白1(NDUFS1，b169540，1∶5 000)購自美國Abcam公司，β-微管蛋白(HX1829，1∶5 000)購自北京華興博創(chuàng)公司。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)過整理后，利用SAS 9.4統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，當方差分析顯著時，采用Duncan氏法進行多重比較。P<0.05為差異顯著，數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨原代肝細胞PAS染色

PAS染色可以把糖原或多糖等陽性物質(zhì)染成紅色或紫紅色，肝細胞中含有大量的肝糖原，因此PAS染色可以把肝細胞染成紅色，蘇木素可以把細胞核染成藍色，而成纖維細胞、血細胞以及其他雜細胞不會被染色。鴨原代肝細胞PAS染色如圖1所示，陽性染色細胞占絕大部分，肝細胞比例較大，表明分離的原代肝細胞純度較高，按照此方法分離純化可用于后續(xù)試驗。

圖1 鴨原代肝細胞PAS染色

2.2 HepG2細胞和鴨原代肝細胞存活率

由圖2-A可知，細胞培養(yǎng)基中Met濃度為0 μmol/L時HepG2細胞存活率顯著低于其他Met濃度(P<0.05)，隨著細胞培養(yǎng)基中Met濃度升高，HepG2細胞存活率先增加后降低，在Met濃度為25 μmol/L時達到平臺，但培養(yǎng)基中Met濃度為25、50、100和200 μmol/L時HepG2細胞存活率無顯著差異(P>0.05)。因此，選擇0、25和200 μmol/L Met濃度進行后續(xù)試驗。

由圖2-B可知，細胞培養(yǎng)基中Met濃度為0、6.25、12.5和25 μmol/L時鴨原代肝細胞存活率顯著低于濃度為100和200 μmol/L時(P<0.05)，隨著細胞培養(yǎng)基中Met濃度升高，鴨原代肝細胞存活率逐漸增加，在Met濃度為100 μmol/L時達到平臺。因此，選擇0、25、100和200 μmol/L Met濃度進行后續(xù)試驗。

A：HepG2細胞 HepG2 cells；B：鴨原代肝細胞 duck primary hepatocytes。

2.3 HepG2細胞油紅O染色和OD520 nm

由圖3-A可知，與200 μmol/L Met組相比，0、25 μmol/L Met組脂滴數(shù)量明顯增加。由圖3-B和圖3-C可知，0、25 μmol/L Met組HepG2細胞增殖速率下降，與25、200 μmol/L Met組相比，0 μmol/L Met組細胞存活率顯著降低(P<0.05)，但25、200 μmol/L組細胞存活率無顯著差異(P>0.05)，這與上述的試驗結(jié)果一致。由圖3-D可知，25 μmol Met組OD520 nm顯著高于0、200 μmol/L Met組(P<0.05)。由圖3-E可知，200 μmol/L Met組OD520 nm/細胞存活率顯著低于0、25 μmol/L Met組(P<0.05)，且0、25 μmol/L Met組之間無顯著差異(P>0.05)。

A：細胞油紅O染色圖 image of cells oil red O staining；B：細胞存活狀態(tài)圖 image of cells growth condition；C：細胞存活率 cell viability；D：油紅520 nm吸光度 OD520 nm of oil red；E：520 nm吸光度/細胞存活率OD520 nm/cell viability。

2.4 HepG2細胞和鴨原代肝細胞脂質(zhì)代謝mRNA和蛋白表達量

由圖4可知，與200 μmol/L Met組相比，0、25 μmol/L Met組HepG2細胞脂肪酸β-氧化[(中鏈?；o酶A脫氫酶(ACADM)]、三羧酸循環(huán)[(二氫硫辛酸脫氫酶(DLD)]、呼吸鏈電子傳遞(NDUFS1)過程相關(guān)的基因表達量顯著下調(diào)(P<0.05)，且0 μmol/L Met組HepG2細胞中NDUFS1蛋白表達量顯著下調(diào)(P<0.05)。

由圖5可知，與200 μmol/L Met組相比，0、25、100 μmol/L Met組鴨原代肝細胞三羧酸循環(huán)[蘋果酸脫氫酶(MDH)1、MDH2、DLD]和酮體生成[3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶2(HMGCS2)]過程相關(guān)的基因表達量顯著下調(diào)(P<0.05)。

圖5 培養(yǎng)基Met缺乏對鴨原代肝細胞三羧酸循環(huán)和酮體生成相關(guān)基因的影響

由圖6可知，與200 μmol/L Met組相比，0、25、100 μmol/L Met組鴨原代肝細胞呼吸鏈電子傳遞過程的相關(guān)基因[電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白α亞基(ETFA)、電子傳遞黃素蛋白脫氫酶(ETFED)和NDUFS1]表達量顯著下調(diào)(P<0.05)，且0、25 μmol/L Met組鴨原代肝細胞NDUFS1蛋白表達量顯著下調(diào)(P<0.05)。

圖6 培養(yǎng)基Met缺乏對鴨原代肝細胞呼吸鏈電子傳遞相關(guān)基因和蛋白的影響

3 討 論

本試驗在不含Met的培養(yǎng)基中添加不同濃度Met培養(yǎng)HepG2細胞和鴨原代肝細胞24 h后，與正常Met濃度(200 μmol/L)培養(yǎng)基相比，不添加Met或添加低濃度Met組的細胞存活率下降，機體生長代謝相關(guān)基因和蛋白表達量下調(diào)，表明成功構(gòu)建HepG2細胞和鴨原代肝細胞Met缺乏模型。隨著在培養(yǎng)基中添加Met，HepG2細胞存活率在添加25 μmol/L Met時達到平臺，而鴨原代肝細胞存活率在添加100 μmol/L Met時達到平臺，其原因有可能是由于鴨原代肝細胞比HepG2細胞對培養(yǎng)基中Met更加敏感，鴨原代肝細胞需要更高濃度的Met來維持細胞的正常生長。

利用體外細胞模型來研究Met對不同細胞生長和增殖的影響均有所報道。體外奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)試驗表明，與Met缺乏組相比，添加0.6 mmol/L Met顯著提高乳腺上皮細胞的增殖[9-10]。培養(yǎng)基中添加Met(0.2、0.5、1.0 mmol/L)可顯著提高豬血管內(nèi)皮細胞的活力、形成管腔數(shù)目、總的節(jié)點數(shù)目以及總分支長度，表明Met可促進血管的生成[11]。Met缺乏在家禽組織細胞中也有些報道，體外試驗表明Met缺乏導致肉雞肝細胞G2M期阻滯，細胞增殖受到阻礙[12]。本試驗中，HepG2細胞和鴨原代肝細胞在不添加Met或添加低濃度Met培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，其細胞增殖均顯著受到抑制，HepG2細胞脂質(zhì)沉積量顯著增加，表明培養(yǎng)基中Met濃度顯著影響肝細胞生長及脂質(zhì)沉積狀況。

Met是動物機體重要的必需氨基酸，是肉鴨飼糧中第一限制氨基酸，對機體生長及各代謝過程起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。我們之前的研究表明，飼糧中Met缺乏可導致北京鴨體重顯著下降，脂肪沉積顯著增加[13-14]，且肝臟蛋白組學研究表明Met缺乏導致北京鴨肝臟脂肪酸β氧化(ACADM、HADH、ACOX1)、三羧酸循環(huán)(DLD、MDH1、MDH2)、呼吸鏈電子傳遞(NDUFS1、ETFA、ETFDH)、糖酵解/糖異生(GAPDH、PGK1、TPI1)、酮體生成(HMGCS2)等過程受阻[15]。DLD是丙酮酸脫氫酶復合物的組成成分，可以將二氫硫辛酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)轉(zhuǎn)化為硫辛酸和還原型酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)[16]，丙酮酸脫氫酶催化丙酮酸氧化脫羧生成乙酰CoA，將糖酵解與三羧酸循環(huán)和脂肪酸合成聯(lián)系起來[17]。MDH1和MDH2是蘋果酸脫氫酶的2種同工酶，分別位于細胞質(zhì)和線粒體中，催化蘋果酸和草酰乙酸的可逆互相轉(zhuǎn)化[18]。ACADM是脂肪酸?；鵆oA脫氫酶家族成員之一，β-氧化過程起初階段重要的限速酶[19]。ETFA、ETFDH和NDUFS1是在呼吸鏈電子傳遞鏈過程中3種重要的催化酶，ETFA編碼電子傳遞黃素蛋白(ETF)的α亞基，ETF可以把電子對轉(zhuǎn)移給線粒體電子傳遞鏈，ETFDH接收脂?；鵆oA脫氫酶的電子傳遞至呼吸鏈[20-21]。NDUFS1是線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ的亞基，在呼吸鏈復合體Ⅰ的裝配中起著至關(guān)重要的作用[22]。HMGCS2是肝臟線粒體酮體生成過程的關(guān)鍵酶，生成的酮體可經(jīng)血液進入肝外組織(腦、心臟等)，為肝外組織提供能量[21]。研究表明，Met對脂質(zhì)沉積的影響可能主要是通過調(diào)控機體脂質(zhì)代謝相關(guān)基因和蛋白表達來實現(xiàn)的[4]。利用體外細胞模型可以更準確地驗證Met與相關(guān)基因和蛋白表達之間的關(guān)系。在本研究中，HepG2細胞和鴨原代肝細胞試驗中均發(fā)現(xiàn)Met缺乏導致上述關(guān)鍵蛋白表達量和基因表達量嚴重下調(diào)，表明Met缺乏導致細胞體內(nèi)多種代謝過程受阻，導致細胞產(chǎn)生ATP不足，表現(xiàn)出生長受阻，體外細胞模型的研究結(jié)果與北京鴨肝臟體內(nèi)試驗結(jié)果[15]一致。

4 結(jié) 論

① Met缺乏導致HepG2細胞和鴨原代肝細胞存活率降低。

② Met缺乏導致HepG2細胞脂質(zhì)沉積增加。

③ Met缺乏導致HepG2細胞和鴨原代肝細胞脂肪酸β-氧化、三羧酸循環(huán)、呼吸鏈電子傳遞和酮體生成等過程受阻。