基于代謝組學(xué)技術(shù)研究枸杞多糖對雛雞免疫抑制的拮抗機(jī)制

王建東 唐玉林 王 敏 張寶鎖 楊富強(qiáng) 高?；?于 洋 郭延生* 梁小軍**

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動物科學(xué)研究所，銀川 750002；2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；3.寧夏銀川市婦幼保健院，銀川 750001；4.寧夏順寶現(xiàn)代農(nóng)業(yè)股份有限公司，青銅峽 751600)

免疫抑制是指動物機(jī)體存在免疫功能障礙，導(dǎo)致免疫力下降，進(jìn)而更容易受到病原的侵害，這在很大程度上制約了畜禽業(yè)的健康發(fā)展[1]。因此，為消除或改善畜禽免疫抑制情況，尋找一種副作用小且無殘留的免疫增強(qiáng)劑來代替抗生素等化學(xué)藥物成為目前亟待解決的問題。枸杞(Lyciumbarbarum)是一種藥食同源中藥，具有滋肝補(bǔ)腎、益精明目之功效[2]?，F(xiàn)代大量藥理研究表明，枸杞具有增強(qiáng)免疫、促生長的作用，而枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharide，LBP)是其發(fā)揮功效的主要活性成分之一[3-4]。經(jīng)研究證實，LBP具有抗氧化[5-6]、抗炎[7-8]、保護(hù)神經(jīng)[9]、降血糖血脂[10]、調(diào)節(jié)免疫[11-12]等功能。Long等[13]研究表明,在肉雞飼糧中添加2 000 mg/kg LBP能顯著改善其生長性能，提高機(jī)體抗氧化能力，并增加血清中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和γ-干擾素(IFN-γ)的含量，從而達(dá)到增強(qiáng)免疫的作用。本課題組前期研究也證實，在肉雛雞飼糧中添加LBP有助于提高血清中IgG含量及促進(jìn)免疫器官脾臟和法氏囊的發(fā)育[14]；此外，通過飲水方式給予LBP能夠提高環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫抑制雛雞外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和脾臟生發(fā)中心數(shù)量[15]，但相關(guān)作用機(jī)制尚不明確。因此，本試驗采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿飛行時間質(zhì)譜(UHPLC-Triple-TOF-MS)代謝組學(xué)技術(shù)研究枸杞多糖對免疫抑制雛雞脾臟代謝物的影響，旨在揭示枸杞多糖干預(yù)免疫抑制雛雞的生物標(biāo)志物并探討其保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物分組與處理

將120羽1日齡海蘭褐蛋雞(購自北京市華都峪口禽業(yè)有限公司)適應(yīng)性飼養(yǎng)至7日齡后隨機(jī)分成3個組，即空白組(NC組)、環(huán)磷酰胺組(CY組)及枸杞多糖組(CYLbGp組)，每組40羽，除NC組外，其余2組連續(xù)3 d按照80 mg/(kg·d)的劑量胸肌注射環(huán)磷酰胺溶液(以生理鹽水為溶劑)進(jìn)行造模[16]，NC組胸肌注射等體積的生理鹽水，造模后CYLbGp組通過飲水的方式給予5 mg/(kg·d)枸杞多糖(購自于寧夏天某生物科技股份有限公司，純度>90%)，持續(xù)30 d，并觀察各組雞的外觀、狀態(tài)及飲食情況。

1.2 脾臟采集與預(yù)處理

在CYLbGp組給藥結(jié)束后第1天，每組隨機(jī)選取6只雞稱重，隨后取下脾臟稱重，記錄數(shù)據(jù)計算脾臟指數(shù)[脾臟指數(shù)(%)=100×脾重(g)/體重(g)]。隨后將脾臟置于凍存管中，-80 ℃超低溫冰箱保存。

取出脾臟樣品，在低溫環(huán)境下精確稱取50 mg樣品至2 mL離心管中，加入1顆直徑6 mm的研磨珠、400 μL提取液(甲醇和水體積比4∶1)和0.02 mg/mL的L-2-氯苯丙氨酸，放到冷凍組織研磨儀研磨6 min(-10 ℃，50 Hz)，低溫超聲提取30 min(5 ℃，40 kHz)，隨后將樣品置于-20 ℃靜置30 min，再離心15 min(13 000×g，4 ℃)，移取上清液至帶內(nèi)插管的進(jìn)樣小瓶中上機(jī)分析。

1.3 UHPLC-Triple-TOF-MS分析

色譜條件：采用AB SCIEX ExionLC AD System超高效液相色譜進(jìn)行色譜分析，色譜柱選擇美國Waters公司的ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，柱溫設(shè)置為40 ℃；流動相A為95%水+5%乙腈(含0.1%甲酸)，流動相B為47.5%乙腈+47.5%異丙醇+5%水(含0.1%甲酸)，梯度洗脫程序設(shè)置為：0～2.5 min，0～25%B；2.5～9 min，25%～100%B；9～13 min，100%B；13～13.1 min，100%～0 B；13.1～16 min，0 B；流速為0.40 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

質(zhì)譜條件：采用AB SCIEX-Triple TOF 5600+質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，電噴霧離子源溫度為550 ℃，正、負(fù)極電壓分別為5 000和-4 000 V，離子源氣體G1、G2和氣簾氣分別為50、50和30 psi，根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓(80 V)和碰撞能(40±20)對在三重四級桿(Qtrap)中的離子對進(jìn)行掃描檢測(范圍50～1 000，循環(huán)時間510 ms)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

將液相色譜質(zhì)譜(LC-MS)原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入ProgenesisQI(Waters公司，美國)軟件，按每組內(nèi)缺失值>20%去除特征值，缺失值采用極小值填補(bǔ)，并按總和進(jìn)行歸一化處理，再剔除質(zhì)控(QC)樣本中相對標(biāo)準(zhǔn)偏差>30%的變量，并進(jìn)行l(wèi)og10對數(shù)化處理，得到預(yù)處理完成后的數(shù)據(jù)，用于后續(xù)的分析。再進(jìn)行特征峰搜庫鑒定，將質(zhì)譜信息與代謝數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，質(zhì)譜質(zhì)量誤差設(shè)置為小于10 ppm，同時根據(jù)二級質(zhì)譜匹配得分鑒定代謝物[17]。將預(yù)處理得到的數(shù)據(jù)輸入ropls(R packages)軟件，進(jìn)行主成分分析(principal components analysis，PCA)、偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA)，根據(jù)t檢驗和OPLS-DA結(jié)果，進(jìn)行差異代謝物的篩選[變量投影重要度(VIP)>1，P<0.05]，再使用MetaboAnalyst 5.0單變量ROC曲線分析計算差異代謝物AUC值，篩選出AUC值>0.8的差異代謝物。

數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0軟件的one-way ANOVA程序進(jìn)行方差分析，采用LSD法分析組間的差異顯著性，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié) 果

2.1 免疫抑制雛雞模型判斷

CY組雛雞在注射環(huán)磷酰胺后，外觀可見精神萎靡、喜臥、羽毛凌亂、少食，體重和脾臟指數(shù)較NC組顯著下降(表1)。CYLbGp組雛雞體重、脾臟重和脾臟指數(shù)均顯著高于CY組(P<0.05)，而與NC組差異不顯著(P>0.05)。上述結(jié)果表明，免疫抑制雛雞模型建立成功，脾臟組織可用于代謝組學(xué)分析。

表1 3組雛雞體重、脾臟重和脾臟指數(shù)

2.2 樣本質(zhì)控分析

樣品經(jīng)色譜分離流出的組分不斷進(jìn)入質(zhì)譜，質(zhì)譜連續(xù)掃描進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，每一次掃描得到一張質(zhì)譜圖，將每一張質(zhì)譜圖中所有離子強(qiáng)度相加，得到一個總的離子流強(qiáng)度。圖1分別展示了正、負(fù)離子模式下，質(zhì)控樣品的總離子色譜圖，可見該檢測條件下，峰形良好，分布相對均勻，表明代謝組數(shù)據(jù)穩(wěn)定性好，可用于后續(xù)分析。

A:正離子模式 positive ion mode；B：負(fù)離子模式 negative ion mode。

2.3 脾臟代謝輪廓分析

采用PCA對NC組、CY組、CYLbGp組海蘭褐蛋雞脾臟組織樣本進(jìn)行代謝輪廓分析，從PCA的2D散點圖(圖2)可以看出，各組樣本均位于其95%可置信區(qū)間內(nèi)，表明每組樣本組內(nèi)差異小。CY組和NC組在用藥后30 d脾臟代謝輪廓發(fā)生了大幅度變動，說明環(huán)磷酰胺對雞脾臟代謝輪廓有較大影響。CY組和CYLbGp組脾臟代謝輪廓存在一定夾角，表明CYLbGp組與CY組脾臟代謝物輪廓也存在明顯差異。

圖2 3組脾臟樣本PCA模型得分圖

2.4 脾臟代謝物的PLS-DA和OPLS-DA

為了評價枸杞多糖改善免疫抑制雛雞脾臟代謝，對NC組、CY組和CYLbGp組脾臟代謝譜進(jìn)一步進(jìn)行PLS-DA及模型驗證，結(jié)果(圖3-A)顯示，CYLbGp組代謝輪廓介于NC組CY組之間，說明枸杞多糖對免疫抑制雛雞的脾臟代謝紊亂有一定的拮抗作用。模型結(jié)果(圖3-B)表明，隨著置換保留度的下降，R2和Q2下降，回歸線呈向上的趨勢，說明置換檢驗過關(guān)，模型不存在過擬合現(xiàn)象，所建PLS-DA模型對3組雛雞均具有較好的預(yù)測能力。OPLS-DA可以剔除不相關(guān)的差異變量，篩選出與藥物作用相關(guān)的差異變量。OPLS-DA得分圖(圖4)顯示，NC組和CY組能夠顯著分離，表明免疫抑制雛雞脾臟代謝輪廓發(fā)生了顯著改變，CY組和CYLbGp組顯著分離，表明枸杞多糖干預(yù)使免疫抑制雛雞脾臟代謝輪廓發(fā)生顯著改變。

圖3 3組脾臟樣本PLS-DA模型得分圖(A)及模型置換檢驗圖(B)

圖4 脾臟樣本OPLS-DA得分圖(左：NC組和CY組；右：CY組和CYLbGp組)

2.5 差異代謝物篩選

根據(jù)t檢驗P值(P<0.05)和OPLS-DA模型VIP(VIP>1)，進(jìn)行差異代謝物的篩選，篩選結(jié)果為，CY組和NC組共有114個差異代謝物，CY組和CYLbGp組共有116個差異代謝物，再篩選經(jīng)枸杞多糖干預(yù)后共有的發(fā)生顯著回調(diào)的差異代謝物，最終篩選出滿足條件的差異代謝物14種，采用MetaboAnalyst 5.0中經(jīng)典單變量ROC曲線分析對這14種差異代謝物進(jìn)行生物標(biāo)志物分析，篩選出AUC值>0.8的差異代謝物，結(jié)果顯示14種差異代謝物AUC值均大于0.8(表2)，因此可視為枸杞干預(yù)環(huán)磷酰胺的生物標(biāo)志物，這14種生物標(biāo)志物在3組中的豐度見圖5。

圖5 CYLbGp組脾臟樣本中顯著回調(diào)差異代謝物箱線圖

表2 CYLbGp組脾臟樣本中發(fā)生顯著回調(diào)差異代謝物

3 討 論

環(huán)磷酰胺是一種烷化劑類抗腫瘤藥物，對處于有絲分裂循環(huán)周期的細(xì)胞有破壞和殺滅的作用，對活化增殖的細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用[18]，尤其是對免疫相關(guān)細(xì)胞呈現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫抑制作用[19]，所以環(huán)磷酰胺常被用于動物免疫抑制模型的建立。師萱等[20]通過對環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠血清進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺對脂質(zhì)代謝相關(guān)代謝通路有明顯影響。

3.1 枸杞多糖對環(huán)磷酰胺所致脂質(zhì)代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用

脂肪酸氧化過程主要分為肉堿循環(huán)和脂肪酸β氧化2個階段，長鏈脂肪酸需在相關(guān)酶的作用下形成?；鈮A才可進(jìn)入線粒體內(nèi)進(jìn)行β氧化[21]。斯皮熱古麗·阿布都卡地等[22]對免疫抑制小鼠模型血清代謝組學(xué)結(jié)果表明，模型組小鼠血清中肉堿含量顯著增多，說明環(huán)磷酰胺可使機(jī)體脂肪酸氧化紊亂。本試驗中CY組多種肉堿(棕櫚酰肉堿、硬脂酰肉堿、3-羥基十四?；鈮A、反式十六烷基-2-烯醇肉堿、O-棕櫚酰肉堿)和脂質(zhì)代謝中間產(chǎn)物3-氧十四烷酸、甘油三酯(14∶0/18∶1/20∶5)含量均顯著高于NC組和CYLbGp組，提示枸杞多糖有助于恢復(fù)環(huán)磷酰胺所致的脂質(zhì)代謝紊亂。

前列腺素(PG)是由花生四烯酸經(jīng)包括環(huán)氧合酶-1(COX-1)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)在內(nèi)的多種酶作用形成，可調(diào)節(jié)多種生理反應(yīng)，包括炎癥、免疫反應(yīng)和細(xì)胞分化[23-25]。13,14-二氫-15-酮-前列腺素A2(13,14-dihydro-15-keto PGA2)是通過13,14-二氫-15-酮-前列腺素E2(13,14-dihydro-15-keto PGE2)的非酶促脫水產(chǎn)生的，是前列腺素E2(PGE2)代謝的中間產(chǎn)物。有研究表明，PGE2不僅是炎癥介質(zhì)，也被稱為免疫抑制分子[26]。PGE2能抑制T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，還可通過減少Th1細(xì)胞因子的產(chǎn)生和誘導(dǎo)免疫抑制分子程序性死亡配體1(PD-L1)的表達(dá)來抑制Th1免疫反應(yīng)[27]。在本研究中，CYLbGp組13,14-dihydro-15-keto-PGA2、前列腺素B2(PGB2)含量均較CY組顯著降低，這表明枸杞多糖可通過抑制PG產(chǎn)生發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)免疫作用。

有研究表明環(huán)磷酰胺可作用于細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞核DNA損傷、線粒體去極化等應(yīng)激信號作用于線粒體，導(dǎo)致線粒體受體蛋白，如Bcl-2同源拮抗劑(BAK)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(BAX)表達(dá)增加，促使線粒體通透性改變，釋放細(xì)胞色素C、線粒體膜間隙蛋白酶(Omi)和線粒體促凋亡蛋白(Smac)[28-29]等物質(zhì)到細(xì)胞質(zhì)中，啟動下游凋亡蛋白，如半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、半胱氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)等的表達(dá)[30-31]，從而引起細(xì)胞凋亡，尤其是T淋巴細(xì)胞[32]。1-磷酸鞘氨醇(S1P)是一種多效的細(xì)胞膜鞘脂的代謝產(chǎn)物，參與機(jī)體多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)[33]。Wang等[34]研究表明，S1P能顯著降低Caspase-3水平，進(jìn)而起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。本試驗中CYLbGp組和NC組S1P的含量均顯著高于CY組，表明枸杞多糖能夠通過提高S1P含量起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。本課題組前期研究也證實，枸杞多糖可以顯著提高雛雞外周血淋巴細(xì)胞的增殖率，緩解環(huán)磷酰胺對淋巴細(xì)胞凋亡的影響[15]。綜上可知，枸杞多糖可通過改善環(huán)磷酰胺所致的脂質(zhì)代謝紊亂而發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)免疫和抑制細(xì)胞凋亡作用。

有研究表明，升高的溶血磷脂酰乙醇胺(0∶0/22∶5)[LysoPE(0∶0/22∶5)]含量可能會導(dǎo)致機(jī)體炎癥加劇[35]。因此，脂質(zhì)代謝紊亂可能會在體內(nèi)誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生及加重其程度[36]。3-氧十四烷酸、甘油三酯(14∶0/18∶1/20∶5)是脂質(zhì)代謝過程中的重要代謝物，在本試驗中上述代謝物含量CY組均高于NC組，提示環(huán)磷酰胺可引起動物機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，給予枸杞多糖后，CYLbGp組上述代謝物含量均發(fā)生顯著回調(diào)，表明枸杞多糖有助于改善環(huán)磷酰胺引起的脂質(zhì)代謝紊亂現(xiàn)象。

3.2 枸杞多糖對環(huán)磷酰胺所致氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用

13′-羧基-α-生育酚是維生素E代謝的中間代謝產(chǎn)物，而維生素E是機(jī)體中一種有效的脂溶性抗氧化劑，且在免疫細(xì)胞中的含量更高[37]。此外，維生素E還可通過直接影響T細(xì)胞膜的完整性來調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能、增殖及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且能間接影響其他免疫細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)[38]，從而起到調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用。有研究表明，環(huán)磷酰胺可使機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)[39]。本試驗發(fā)現(xiàn)，CY組13′-羧基-α-生育酚含量較NC組增多且AUC值>0.8，提示13′-羧基-α-生育酚是表征氧化應(yīng)激反應(yīng)的生物標(biāo)志物，CYLbGp組13′-羧基-α-生育酚含量發(fā)生顯著回調(diào)，說明枸杞多糖能夠降低免疫抑制雛雞氧化應(yīng)激反應(yīng)。

3.3 枸杞多糖對環(huán)磷酰胺所致脾臟功能障礙的改善作用

亮氨酸腦啡肽(L-EK)是內(nèi)源性阿片類化合物的一種，主要由中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生，具有鎮(zhèn)痛、應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)及免疫調(diào)節(jié)的作用[40]。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，機(jī)體脾臟功能和神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)存在密切相關(guān)的關(guān)系[41]。李剛等[42]對脾虛證大鼠和正常大鼠各腦區(qū)L-EK含量變化進(jìn)行了研究，證實脾臟與各腦區(qū)L-EK的生成密切相關(guān)，脾臟功能出現(xiàn)障礙時，L-EK含量上升。而眾多研究證實，環(huán)磷酰胺可引起動物脾虛證[43]。本試驗結(jié)果顯示，CY組L-EK含量較NC組顯著上升，推測環(huán)磷酰胺可能引起脾臟功能障礙，進(jìn)而導(dǎo)致L-EK含量升高，而CYLbGp組上述代謝物較CY組均發(fā)生顯著回調(diào)，前期脾臟病理切片研究也表明枸杞多糖有助于緩解環(huán)磷酰胺帶來的脾臟損傷[15]，提示枸杞多糖可改善脾臟功能。

4 結(jié) 論

本試驗采用UHPLC-Triple-TOF-MS代謝組學(xué)技術(shù)研究了枸杞多糖對免疫抑制雛雞脾臟代謝的影響，分析了脾臟差異代謝物，最終確定了14種潛在生物標(biāo)志物，給用枸杞多糖后，其中13種差異代謝物含量降低，1種差異代謝物含量升高。上述研究結(jié)果提示枸杞多糖拮抗雛雞免疫抑制的作用機(jī)制可能與糾正脂質(zhì)代謝功能紊亂、抗氧化應(yīng)激和改善脾臟功能有關(guān)。