楊乾龍 吳 炎 張鐵濤 郭肖蘭 趙德輝 崔學(xué)哲 王凱英
(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所,長(zhǎng)春 130112)
梅花鹿全身是寶,多種鹿產(chǎn)品具有較高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益,因其養(yǎng)殖歷史較短,多項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)有待深入和系統(tǒng)研究。飼糧氨基酸平衡是營(yíng)養(yǎng)調(diào)控的重要手段,黃健[1]、李仁德[2]和范玉潔[3]相繼就仔鹿飼糧賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、精氨酸等限制性氨基酸進(jìn)行了系統(tǒng)研究,發(fā)現(xiàn)適宜氨基酸水平對(duì)促進(jìn)仔鹿生長(zhǎng)發(fā)育、降低飼養(yǎng)成本及環(huán)境保護(hù)至關(guān)重要。研究表明,寒冷應(yīng)激會(huì)降低幼齡動(dòng)物生長(zhǎng)性能,同時(shí)對(duì)機(jī)體抗氧化能力和免疫功能造成損傷[4-6]。越冬期梅花鹿仔鹿會(huì)受到寒冷環(huán)境和生理變化的雙重脅迫。半胱氨酸(Cys)作為一種重要的功能性氨基酸,具有抗氧化、抗菌消炎、創(chuàng)傷修復(fù)和解毒等多種生物學(xué)功能[4],但其在梅花鹿上的研究尚屬空白。研究表明,飼糧添加半胱氨酸能夠提高肉仔雞和獺兔的平均日增重[7-9],提高獺兔和大鼠的抗氧化能力[8,10-11]。因此,本試驗(yàn)旨在研究飼糧半胱氨酸水平對(duì)越冬期梅花鹿仔鹿生長(zhǎng)性能、氨基酸表觀消化率和血清生化指標(biāo)的影響,以期為半胱氨酸在梅花鹿生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。
采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì),選擇16頭5月齡健康雄性梅花鹿,平均體重(27.53±0.96)kg,隨機(jī)分為4組,每組4個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)1只,組間初始體重差異不顯著(P<0.05)。對(duì)照組(Ⅰ組)飼喂半胱氨酸水平為2.8 g/kg的基礎(chǔ)飼糧,試驗(yàn)組分別飼喂半胱氨酸水平為4.8(Ⅱ組,基礎(chǔ)飼糧+2.0 g/kg半胱氨酸)、6.8(Ⅲ組,基礎(chǔ)飼糧+4.0 g/kg半胱氨酸)和10.8 g/kg(Ⅳ組,基礎(chǔ)飼糧+8.0 g/kg半胱氨酸)的試驗(yàn)飼糧。飼糧經(jīng)蒸汽調(diào)質(zhì)后制粒(直徑0.4 cm,長(zhǎng)1.2 cm),基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1,基礎(chǔ)飼糧中氨基酸含量見表2。試驗(yàn)動(dòng)物選自農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)白山野生生物資源重點(diǎn)野外科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站。半胱氨酸添加形式為L(zhǎng)-半胱氨酸(L-Cys),購(gòu)自安徽某生物科技有限公司,有效純度>99.8%。試驗(yàn)時(shí)間為2020年11月5日至2021年1月4日,試驗(yàn)期60 d,其中預(yù)試期15 d,正試期45 d。
表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))
表2 基礎(chǔ)飼糧中氨基酸含量(風(fēng)干基礎(chǔ))
動(dòng)物試驗(yàn)在農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)白山野生生物資源重點(diǎn)野外科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站進(jìn)行。試驗(yàn)前對(duì)梅花鹿進(jìn)行疾病檢測(cè)。每天07:30和15:30定量飼喂,自由飲水。
1.3.1 糞樣采集
試驗(yàn)結(jié)束前連續(xù)3 d晨飼前收集部分糞樣,每組收集4袋新鮮糞樣,每袋大約收集100 g。去除鹿毛和沙礫,將收集的糞樣混勻分成2份,一份噴灑10%稀硫酸固氮,65 ℃烘干至恒重,粉碎后過40目篩,制成風(fēng)干基礎(chǔ)樣品備用;另一份85 ℃烘箱內(nèi)滅菌2 h后,65 ℃烘干恒重后粉碎過18目篩,制成風(fēng)干基礎(chǔ)樣品備用。
1.3.2 血樣采集
試驗(yàn)最后1天晨飼前對(duì)梅花鹿麻醉并進(jìn)行頸靜脈采血,血樣在帶有分離膠的促凝管中靜置至血清析出,3 500 r/min離心10 min,血清分裝入1.5 mL Eppendorf管中,-80 ℃低溫保存,待測(cè)。
1.4.1 生長(zhǎng)性能
試驗(yàn)開始第1天和最后1天晨飼前麻醉,空腹稱重,計(jì)算初重、末重和平均日增重;記錄每天采食量,計(jì)算平均日采食量和料重比。
1.4.2 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率
干物質(zhì)(DM)、有機(jī)物(OM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、粗脂肪(EE)、酸性洗滌纖維(ADF)、中性洗滌纖維(NDF)和氨基酸含量測(cè)定參考《飼料分析及飼料質(zhì)量分析檢測(cè)技術(shù)(第4版)》[12]。以鹽酸不溶灰分法測(cè)定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率,計(jì)算公式為:
某營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(%)=100-(100×A/A1×B1/B)。
式中:A為飼糧中2 mol/L鹽酸不溶灰分含量;A1為糞中2 mol/L鹽酸不溶灰分含量;B1為糞中該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量;B為飼糧中該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量。
1.4.3 血清生化指標(biāo)
血清高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、尿素(Urea)、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)含量和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)活性使用中生北控生物科技有限公司試劑盒,采用威圖-e全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定;血清丙二醛(MDA)含量和過氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性使用南京建成生物工程研究所試劑盒,按說(shuō)明書測(cè)定;血清游離氨基酸及代謝物含量使用氨基酸分析儀(L8900,日本)測(cè)定。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)先通過Excel 2016軟件進(jìn)行整理,然后采用SAS 9.4統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,P<0.05表示差異顯著,P>0.05表示差異不顯著。
由表3可知,飼糧半胱氨酸水平對(duì)越冬期梅花鹿生長(zhǎng)性能未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。但Ⅱ組總增重比Ⅰ組增加了5.43%,料重比降低了11.83%。
表3 飼糧半胱氨酸水平對(duì)越冬期梅花鹿生長(zhǎng)性能的影響
由表4可知,隨著飼糧半胱氨酸水平升高,各組半胱氨酸和蛋氨酸表觀消化率逐漸提高,Ⅰ組蛋氨酸表觀消化率顯著低于Ⅲ組和Ⅳ組(P<0.05),Ⅰ組半胱氨酸、甘氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、谷氨酸和丙氨酸表觀消化率顯著低于其余各組(P<0.05)。各組之間絲氨酸、精氨酸、組氨酸和脯氨酸表觀消化率差異不顯著(P>0.05)。
表4 飼糧半胱氨酸水平對(duì)越冬期梅花鹿氨基酸表觀消化率的影響
由表5可知,Ⅰ組血清低密度脂蛋白和膽固醇含量顯著高于Ⅲ組(P<0.05),Ⅰ組血清高密度脂蛋白含量顯著高于Ⅲ組和Ⅳ組(P<0.05),Ⅰ組血清谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著高于其余各組(P<0.05),Ⅰ組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著高于Ⅱ組和Ⅲ組(P<0.05),Ⅱ組和Ⅲ組血清葡萄糖含量顯著高于Ⅰ組和Ⅳ組(P<0.05),Ⅰ組血清總蛋白含量顯著高于其余各組(P<0.05),Ⅰ組血清白蛋白含量顯著高于Ⅲ組和Ⅳ組(P<0.05),Ⅱ組血清尿素含量顯著低于Ⅰ組和Ⅳ組(P<0.05)。各組之間血清甘油三酯含量和乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶活性差異不顯著(P>0.05)。
表5 飼糧半胱氨酸水平對(duì)越冬期梅花鹿血清生化指標(biāo)的影響
由表6可知,Ⅱ組血清過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著高于其余各組(P<0.05),Ⅱ組和Ⅲ組血清丙二醛含量顯著低于Ⅰ組和Ⅳ組(P<0.05),Ⅱ組和Ⅲ組血清總超氧化物歧化酶活性顯著高于Ⅰ組和Ⅳ組(P<0.05)。
表6 飼糧半胱氨酸水平對(duì)越冬期梅花鹿抗氧化功能的影響
由表7可知,Ⅰ組血清半胱氨酸含量顯著高于其余各組(P<0.05);Ⅱ組血清蘇氨酸含量顯著低于Ⅲ組(P<0.05);Ⅲ組血清天冬氨酸、谷氨酸和3-甲基組氨酸含量顯著高于其余各組(P<0.05);Ⅱ組血清酪氨酸和丙氨酸含量顯著低于Ⅳ組(P<0.05);Ⅱ組血清α-氨基乙二酸含量顯著低于Ⅲ組和Ⅳ組(P<0.05);Ⅲ組血清乙醇胺含量顯著低于Ⅰ組和Ⅳ組(P<0.05),Ⅱ組顯著低于Ⅳ組(P<0.05)。各組之間血清蛋氨酸、絲氨酸、甘氨酸、?;撬帷㈦琢蛎?、賴氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、組氨酸、脯氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基正丁酸、鳥氨酸、瓜氨酸、1-甲基組氨酸、磷酸絲氨酸和羥脯氨酸含量差異不顯著(P>0.05)。
表7 飼糧半胱氨酸水平對(duì)越冬期梅花鹿血清氨基酸及其代謝物含量的影響
半胱氨酸和蛋氨酸同為含硫氨基酸,并且蛋氨酸通過轉(zhuǎn)硫途徑代謝生成半胱氨酸,因此半胱氨酸是一種條件性必需氨基酸。生產(chǎn)中通常用蛋氨酸調(diào)節(jié)總含硫氨基酸的需要量,但在不同的飼料原料中半胱氨酸的含量存在很大差別,蛋氨酸生成半胱氨酸的效率也受到動(dòng)物的生理狀態(tài)和蛋氨酸水平的影響[13]。半胱氨酸是一種重要的功能性氨基酸,其代謝能夠產(chǎn)生牛磺酸、谷胱甘肽和氣體信號(hào)分子硫化氫等[14],半胱氨酸及其代謝產(chǎn)物具有抗氧化和促生長(zhǎng)等多種生物學(xué)作用[4]。
總增重、平均日增重和平均日采食量能夠直觀反映出動(dòng)物的健康和生長(zhǎng)發(fā)育狀況;料重比能夠直觀反映出動(dòng)物對(duì)飼糧的利用效率和飼養(yǎng)成本。馮倩倩等[15]研究表明,半胱氨酸能夠提高低蛋白質(zhì)飼糧中肉仔雞的平均日增重和平均日采食量;曹寶紅等[8]、曾潔等[9]、傅祥超等[16]、卡麗娜[17]和常馨月等[18]研究表明,飼糧添加半胱氨酸能夠顯著提高獺兔的末重和平均日增重;研究表明,飼糧添加過量的半胱氨酸會(huì)降低大鼠的末重[10],顯著降低北京鴨的平均日增重[19]。本試驗(yàn)結(jié)果與以上研究結(jié)果不同,各組之間梅花鹿生長(zhǎng)性能無(wú)顯著差異。但隨著飼糧半胱氨酸水平提高,各增重指標(biāo)呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì),其中Ⅳ組平均日增重比對(duì)照組降低了23.14%。可能是不同種類和不同生理狀態(tài)的動(dòng)物對(duì)半胱氨酸的耐受能力不同,過量的半胱氨酸可能通過代謝性酸中毒和氧化應(yīng)激抑制動(dòng)物的生長(zhǎng)性能[20-21];也可能是過量的半胱氨酸導(dǎo)致同型半胱氨酸的含量增加,進(jìn)一步產(chǎn)生毒性作用[14],將在后續(xù)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。
氨基酸表觀消化率能夠在一定程度上反映動(dòng)物腸道健康和各氨基酸在胃腸道消化吸收狀況。半胱氨酸對(duì)氨基酸表觀消化率影響的研究鮮有報(bào)道,但半胱氨酸是腸道上皮細(xì)胞的必需氨基酸,能夠通過谷胱甘肽維持上皮細(xì)胞的活力和增殖[22]。因此,半胱氨酸和各氨基酸消化吸收之間關(guān)系十分密切。試驗(yàn)組氨基酸表觀消化率均有不同程度提高,可能是添加半胱氨酸后,提高一些與蛋白質(zhì)消化和氨基酸代謝相關(guān)的代謝物含量,如L-同型半胱氨酸磺酸、O-磷酸酪氨酸和甲硫氨酰組氨酸,影響氨基酸代謝[23];也可能和小腸黏膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)相關(guān),半胱氨酸緩解因寒冷應(yīng)激誘發(fā)腸道損傷導(dǎo)致的吸收能力降低,并顯著提高腸道蛋白酶活性[24]。值得注意的是,本試驗(yàn)中Ⅳ組的氨基酸表觀消化率高于Ⅰ組,而生長(zhǎng)性能表現(xiàn)為總增重較低、料重比較高??赡苁前腚装彼釣槟c道上皮細(xì)胞的必需氨基酸[22],飼糧添加半胱氨酸提高了半胱氨酸表觀消化率,但過量的半胱氨酸吸收會(huì)導(dǎo)致代謝性酸中毒,影響動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育[20]。
血清生化指標(biāo)能夠在一定程度上反映營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝狀況以及動(dòng)物的健康狀態(tài)。血清膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量反映機(jī)體對(duì)脂肪代謝狀況。其中,甘油三酯是脂肪代謝產(chǎn)物,其含量越高,表明脂肪利用率越低[25];血清高密度脂蛋白和低密度脂蛋白反映機(jī)體對(duì)膽固醇的運(yùn)輸作用,血清高密度脂蛋白運(yùn)輸外周組織中的膽固醇至肝臟,血清低密度脂蛋白運(yùn)輸途徑則相反[26]。研究表明,飼糧添加半胱氨酸顯著降低了大鼠血清高密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量[10],本試驗(yàn)結(jié)果與之相同。研究表明,飼糧添加半胱氨酸顯著降低了大鼠和仔豬血清甘油三酯含量[10,22],本試驗(yàn)結(jié)果與之不同,飼糧半胱氨酸水平對(duì)血清甘油三酯含量未產(chǎn)生顯著影響。研究表明,飼糧添加半胱氨酸對(duì)大鼠和獺兔血清總膽固醇含量無(wú)顯著影響[10,17],但顯著降低了仔豬血清膽固醇含量[22],本試驗(yàn)結(jié)果與后者相同??赡苁且?yàn)閯?dòng)物種類、生理狀態(tài)及添加劑量不同導(dǎo)致結(jié)果的差異,本試驗(yàn)可能是半胱氨酸通過促進(jìn)膽汁酸分泌從而使血清膽固醇含量顯著降低[27]。血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性反映動(dòng)物肝功能狀況。黃健[1]在仔鹿低蛋白質(zhì)飼糧添加含硫氨基酸后,血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性呈下降趨勢(shì)。本試驗(yàn)結(jié)果與之相同,飼糧添加含硫氨基酸后血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著下降??赡苁秋暭Z添加半胱氨酸后,飼糧氨基酸平衡,降低了氨基酸在肝臟內(nèi)的分解及合成活動(dòng),減輕了肝臟負(fù)擔(dān)。進(jìn)一步驗(yàn)證了谷草轉(zhuǎn)氨酶和轉(zhuǎn)丙轉(zhuǎn)氨酶活性與氨基酸的平衡性呈負(fù)相關(guān)[28]。其次,半胱氨酸能夠代謝產(chǎn)生谷胱甘肽,具有解毒作用,可保護(hù)肝臟免受損傷[29]。
血清總蛋白、白蛋白、尿素和葡萄糖含量能夠反映飼糧蛋白質(zhì)代謝、氨基酸平衡及能量供應(yīng)狀況。研究表明,飼糧半胱氨酸水平對(duì)肉仔雞和獺兔血清總蛋白、白蛋白和葡萄糖含量無(wú)顯著影響[15,17],顯著降低大鼠血清葡萄糖含量[10],顯著提高仔豬血清葡萄糖和總蛋白含量[22]。以上不同的試驗(yàn)條件得到不同的試驗(yàn)結(jié)果,本試驗(yàn)中,飼糧添加半胱氨酸能夠提高越冬期梅花鹿血清葡萄糖含量,降低血清總蛋白、白蛋白和尿素含量。血清葡萄糖含量的提高可能是半胱氨酸促進(jìn)了腸道內(nèi)消化酶的產(chǎn)生,提高淀粉和糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收[24]。血清總蛋白、白蛋白和尿素含量的降低,可能是加入半胱氨酸后促進(jìn)了氨基酸的平衡,有利于蛋白質(zhì)及氨基酸的利用,并降低肝臟內(nèi)氨基酸的分解合成代謝,減輕肝臟負(fù)擔(dān)并與肝功能指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性相互印證。
活性氧的過度生成會(huì)對(duì)機(jī)體內(nèi)的核酸和生物膜等重要的生物大分子造成嚴(yán)重?fù)p傷,導(dǎo)致機(jī)體生理功能受阻或喪失[30]。超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶在活性氧清除過程中發(fā)揮重要作用,其中超氧化物歧化酶能夠清除超氧陰離子自由基,谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶能夠清除過氧化氫,保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整性[31]。丙二醛是機(jī)體氧自由基攻擊生物膜中不飽和脂肪酸形成的脂質(zhì)過氧化物,反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度及機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[32]。研究表明,半胱氨酸能夠降低獺兔血清丙二醛含量[8];顯著提高大鼠超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性,顯著降低丙二醛含量[10-11]。本試驗(yàn)結(jié)果與之一致,飼糧添加半胱氨酸能夠提高越冬期梅花鹿血清總超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活性,降低丙二醛含量。半胱氨酸是一種含有巰基的抗氧化劑,能夠提高肝臟和血清谷胱甘肽含量,與活性氧相互作用,減少氧化應(yīng)激并緩解氧化損傷[8,33-35]??赡苁前腚装彼嵬ㄟ^下調(diào)腺苷單磷酸活化蛋白激酶-α1(AMPK-α1)、低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)和黃嘌呤氧化還原酶(XOR)的mRNA表達(dá)減少機(jī)體活性氧的產(chǎn)生,降低機(jī)體的氧化應(yīng)激水平[36]。
健康狀況、營(yíng)養(yǎng)水平和生長(zhǎng)速度均能夠影響動(dòng)物血液中氨基酸的組成。血清氨基酸作為機(jī)體氨基酸代謝庫(kù),通常用來(lái)研究動(dòng)物體內(nèi)氨基酸代謝狀況。氨基酸平衡性與血清氨基酸含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)[37]。研究表明,飼糧添加含硫氨基酸時(shí)血清中必需氨基酸、非必需氨基酸及支鏈氨基酸的含量顯著降低[38-39];仔豬飼糧中半胱氨酸水平升高,大多數(shù)血清氨基酸含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[40]。本試驗(yàn)結(jié)果與之相同,Ⅱ組血清氨基酸含量與Ⅰ組相比整體呈下降趨勢(shì),可能是該組血清氨基酸較為平衡,能夠促進(jìn)氨基酸的利用[38]。研究表明,飼糧添加半胱氨酸能夠提高大鼠血清半胱氨酸含量[41]。本試驗(yàn)結(jié)果與之不同,飼糧添加半胱氨酸顯著降低越冬期梅花鹿血清半胱氨酸含量,可能是一定水平的半胱氨酸促進(jìn)谷胱甘肽和?;撬岬暮铣桑糜谔岣呖寡趸芰42-43]。
本試驗(yàn)條件下,飼糧半胱氨酸水平對(duì)越冬期梅花鹿生長(zhǎng)性能影響不顯著。飼糧半胱氨酸水平為4.8 g/kg時(shí),可提高氨基酸表觀消化率,降低血清氨基酸含量,并提高機(jī)體抗氧化能力。