飼料中添加槲皮素-5′-磺酸鈉對(duì)雜交石斑魚(yú)(褐點(diǎn)石斑魚(yú)♀×清水石斑魚(yú))生長(zhǎng)性能、抗氧化能力和腸道健康的影響

羅 君 楊二軍 付偉杰 黃建盛,2 謝瑞濤 陳 剛,2*

(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江 524088；2.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(湛江)，湛江 524025；3.廣東恒興飼料實(shí)業(yè)股份有限公司，湛江 524022)

槲皮素(3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮，C15H10O7)是一種在植物中廣泛存在的黃酮類化合物，具有抗炎、抗癌、抗細(xì)胞凋亡和免疫保護(hù)等生物學(xué)功能[7-9]。研究表明，飼料中添加黃酮類化合物可提高水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能、抗氧化和免疫能力，調(diào)節(jié)腸道微生物群落的組成[10-11]。槲皮素作為飼料添加劑對(duì)魚(yú)類生長(zhǎng)和免疫的作用已在虹鱒魚(yú)(Oncorhynchusmykiss)[12]、斑馬魚(yú)(Daniorerio)[13]、克琳雷氏鯰(Rhamdiaquelen)[14]、金頭鯛(SparusaurataL.)[15]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[16]和草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)[17]上進(jìn)行了研究。但由于槲皮素的水溶性差、體內(nèi)代謝快、生物利用度低，限制了其在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用[9]。為改善槲皮素的腸道吸收和生物活性，研究人員對(duì)其進(jìn)行了各種化學(xué)修飾[7-9,18]?；腔磻?yīng)可提高黃酮類化合物的水溶性和生物活性[19]，1914年Watson等[20]通過(guò)在槲皮素中引入磺酸基，合成了槲皮素-5′-磺酸及槲皮素-5′-磺酸鈉(QS)。基于特定的分子結(jié)構(gòu)，QS可能是一種具有臨床應(yīng)用潛力的有機(jī)金屬化合物。體外研究表明，QS可通過(guò)抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯，發(fā)揮抗癌作用[21]。

QS具有抗氧化、抗菌和抗腫瘤活性[22-24]。動(dòng)物模型研究表明，QS對(duì)重金屬中毒小鼠的器官具有一定的保護(hù)作用[25-26]。但飼料中添加QS對(duì)石斑魚(yú)生長(zhǎng)和免疫的影響尚未見(jiàn)研究。為促進(jìn)QS在水產(chǎn)動(dòng)物飼料中的應(yīng)用，本研究通過(guò)在飼料中添加QS，探究QS對(duì)雜交石斑魚(yú)生長(zhǎng)性能、抗氧化能力和腸道健康的影響。

1 材料與方法

1.1 QS的化學(xué)合成及表征

試驗(yàn)用所有化學(xué)品均為分析純，無(wú)需進(jìn)一步純化即可使用。槲皮素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97%，結(jié)構(gòu)如圖1-A所示)購(gòu)買(mǎi)自上海麥克林生化有限公司。

參考Czerwonka等[21]的方法制備QS，具體如下：將濃硫酸(40.0 mL)和槲皮素(10.0 g)于80 ℃水浴中加熱攪拌反應(yīng)2 h。冷卻后，在連續(xù)攪拌狀態(tài)下加入適量蒸餾水，過(guò)濾得到橙紅色槲皮素-5′-磺酸沉淀，在飽和水溶液中重結(jié)晶。使用NaOH中和所得的槲皮素-5′-磺酸，過(guò)濾得到黃色沉淀并在飽和水溶液重結(jié)晶。經(jīng)風(fēng)干和研磨，得到黃色微晶QS產(chǎn)物。QS的結(jié)構(gòu)如圖1-B所示。

圖1 槲皮素(3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮)(A)和槲皮素-5′-磺酸鈉(3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮-5′-磺酸鈉)結(jié)構(gòu)(B)

1H NMR和13C NMR光譜在BRUKE AVANCE Ⅲ 400 MHz上測(cè)量。四甲基硅烷(TMS)作為內(nèi)標(biāo)。

1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ: 12.47(1H, s, 5-OH), 10.98(1H, s, 4′-OH), 10.78(1H, s, 7-OH), 9.46(1H, s, 3-OH), 9.26(1H, s, 3′-OH), 7.87(1H, d, H-2′), 7.62(1H, d, H-6′), 6.40(1H, d, H-8), 6.19(1H, d, H-6)。

13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ: 175.84(C-4), 163.99(C-7), 160.76(C-5), 156.12(C-9), 145.96(C-2), 145.46(C-3′), 144.20(C-4′), 136.10(C-3), 131.19(C-5′), 120.81(C-1′), 117.76(C-2′), 115.37(C-6′), 103.04(C-10), 98.22(C-6), 93.26(C-8)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考石斑魚(yú)的研究成果[27-28]配制基礎(chǔ)飼料，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。參考槲皮素的研究結(jié)果[29-30]，分別在基礎(chǔ)飼料中添加0、0.80、1.60、3.20 mmol/kg QS，換算為質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、0.381、0.762、1.524 g/kg，以槲皮素等量替代基礎(chǔ)飼料中的微晶纖維素。飼料制備前將所有原料粉碎過(guò)60目篩，并按照配方精確稱重。按照含量從小到大的原則逐級(jí)將QS與各飼料成分混勻，然后再將油和水分別混入，揉搓；混合物用螺桿機(jī)濕法擠出4.0 mm粒徑的顆粒飼料并于陰涼處風(fēng)干。干燥后，飼料顆粒分裝于密封袋中，在-20 ℃保存直至使用。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 試驗(yàn)用魚(yú)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)魚(yú)取自廣東海洋大學(xué)湛江海洋高新科技園養(yǎng)殖所培育的雜交子一代幼魚(yú)。選取健康的雜交石斑魚(yú)運(yùn)至廣東恒興飼料實(shí)業(yè)股份有限公司863養(yǎng)殖基地，飼喂基礎(chǔ)飼料暫養(yǎng)2周，禁食24 h后，取體重為(10.10±0.02)g的幼魚(yú)300尾，隨機(jī)放入12個(gè)玻璃鋼養(yǎng)殖桶(500 L，25尾/桶)。將12個(gè)玻璃鋼養(yǎng)殖桶隨機(jī)分為4組，每組3個(gè)養(yǎng)殖桶(重復(fù))。4組試驗(yàn)魚(yú)分別投喂在基礎(chǔ)飼料中添加0(FM組)、0.80(QSL組)、1.60(QSM組)、3.20 mmol/kg QS(QSH組)的試驗(yàn)飼料，每日投喂2次(08:00和17:00)，按照體重的5%～8%飽食投喂。各組試驗(yàn)魚(yú)飼養(yǎng)管理?xiàng)l件相同。在8周的飼養(yǎng)試驗(yàn)期間，每日記錄死亡魚(yú)的數(shù)量、重量及飼料投喂量。試驗(yàn)期間試驗(yàn)魚(yú)在一個(gè)連續(xù)24 h通風(fēng)的流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中飼養(yǎng)，水溫25～29 ℃、pH 7.5～8.0、鹽度28.0～32.0 g/L、溶氧濃度6～8 mg/L、氨氮濃度(0.03±0.01)mg/L。

1.4 樣品采集

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后停食24 h，記錄每個(gè)養(yǎng)殖桶中試驗(yàn)魚(yú)的數(shù)量和重量。每個(gè)養(yǎng)殖桶中隨機(jī)取9尾試驗(yàn)魚(yú)，MS-222麻醉，其中3尾魚(yú)采集長(zhǎng)度1 cm的后腸用于腸道核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)測(cè)定，取肝臟用于抗氧化指標(biāo)測(cè)定；剩余的6尾魚(yú)在無(wú)菌狀態(tài)下剖取整腸，剝離腸道外脂肪組織后，3尾魚(yú)的整腸用于腸道菌群分析，3尾魚(yú)的整腸用于抗氧化指標(biāo)測(cè)定。所取組織采用液氮速凍后在-80 ℃保存直至使用。

1.5 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

飼養(yǎng)8周后，根據(jù)記錄的采食量、體重以及死亡魚(yú)的數(shù)量計(jì)算增重率(weight gain rate，WGR)、特定生長(zhǎng)率(specific growth rate，SGR)、存活率(survival rate，SR)和飼料系數(shù)(feed coefficient rate，F(xiàn)CR)，計(jì)算公式如下：

WGR(%)=100×(終末總重-初始總重)/初始總重；SGR(%/d)=100×(ln終末總重-ln初始總重)/飼養(yǎng)天數(shù)；SR(%)=100×終末尾數(shù)/初始尾數(shù)；FCR=攝食飼料干重/(終末總重+死亡個(gè)體總重-初始總重)。

1.6 肝臟及腸道抗氧化指標(biāo)測(cè)定

肝臟或腸道樣品用預(yù)冷的生理鹽水漂洗和濾紙拭干后，稱取0.4 g，加入9倍體積預(yù)冷的0.9%生理鹽水勻漿；勻漿液在4 ℃條件下以2 500 r/min離心10 min；取上清液保存在-80 ℃下直至進(jìn)一步分析。使用商業(yè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutamate peroxidase，GPx)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

將雜交石斑魚(yú)后腸樣品置于裝有液氮的研缽中研磨至粉末狀，采用TransZol UP Plus RNA Kit試劑盒(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)從中提取總RNA。提取的RNA溶解在120 μL不含RNase的水中，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)提取的RNA條帶，超微量核酸蛋白檢測(cè)儀檢驗(yàn)RNA的純度及濃度。使用TranScript cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)合成第1鏈cDNA。使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)各個(gè)基因的上、下游引物序列并由上海生工生物股份有限公司合成，所有引物經(jīng)過(guò)驗(yàn)證后用于后續(xù)正式試驗(yàn)。NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因主要包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、TNF受體相關(guān)因子-2(TRAF-2)、TNF受體超家族成員1A(TNFRSF1A)、干擾素-γ(IFN-γ)、絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶7(MAP3K7)、MAP3K7結(jié)合蛋白3(TAB3)、NF-κBp65亞單位(NF-κBp65)、NF-κB抑制劑-α(IκB-α)，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因。本試驗(yàn)使用的所有引物序列如表2所示。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

使用PerfectStart Green qPCR Su-perMix(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)熒光定量試劑盒在實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀(Roche LightCycler?96 SW1.1)上進(jìn)行擴(kuò)增。10 μL反應(yīng)體系包括5 μL SYBR Green Supermix，上、下游引物各0.5 μL，3.5 μL ddH2O和0.5 μL cDNA。熔解曲線驗(yàn)證引物特異性。PCR擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，循環(huán)40次。每個(gè)樣本重復(fù)3次驗(yàn)證。按照2-ΔΔCt的方法[31]計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.8 腸道菌群

使用DNA提取試劑盒(MN NucleoSpin 96 Soi)提取微生物DNA；利用通用引物對(duì)(正向引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCGCAGCA-3′；反向引物806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)PCR擴(kuò)增各樣品16S rRNA基因的V3～V4區(qū)序列。使用北京百邁客生物科技有限公司的Illumina HiSeq 2500平臺(tái)對(duì)純化的樣品進(jìn)行高通量測(cè)序分析。

原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識(shí)別分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列，結(jié)果以FASTQ文件格式存儲(chǔ)。使用FLASH軟件(version 1.2.11)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，Trimmomatic軟件(version 0.33)將拼接得到的序列進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾，UCHIME軟件(version 8.1)鑒定并去除嵌合體，生成tags。使用USEARCH軟件(version 10.0)在相似性97%的水平上對(duì)tags進(jìn)行聚類，獲得操作分類單元(OTU)。基于百邁客云平臺(tái)進(jìn)行微生物多樣性分析，得到α多樣性指數(shù)(Ace、Chao1、Shannon、Simpson指數(shù))、β多樣性、物種注釋及分類學(xué)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 22.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差分析顯著時(shí)采用Duncan氏法進(jìn)行組間多重比較。試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”(mean±SE)表示，P<0.05時(shí)具有顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 QS對(duì)雜交石斑魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，與FM組相比，添加不同水平QS對(duì)雜交石斑魚(yú)的終末體重、WGR、SGR、SR和FCR均無(wú)顯著影響(P>0.05)，其中，QSL組的WGR和SGR相比FM組有所上升；4組的SR均大于96%。

表3 QS對(duì)雜交石斑魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

2.2 QS對(duì)雜交石斑魚(yú)肝臟和腸道抗氧化指標(biāo)的影響

通過(guò)測(cè)定肝臟和腸道中SOD、GPx、CAT活性和MDA含量來(lái)評(píng)估雜交石斑魚(yú)的抗氧化狀態(tài)，肝臟和腸道檢測(cè)結(jié)果分別見(jiàn)表4和表5。與FM組相比，QSL和QSM組的肝臟SOD、GPx和CAT活性顯著增加(P<0.05)；QSH組的肝臟CAT活性顯著高于FM組(P<0.05)，SOD和GPx活性與FM組無(wú)顯著差異(P>0.05)；各組肝臟MDA含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。各組腸道SOD活性無(wú)顯著差異(P>0.05)；與FM組相比，3個(gè)添加QS組腸道GPx活性顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著增加(P<0.05)；QSH組腸道CAT活性顯著低于FM組(P<0.05)。

表4 QS對(duì)雜交石斑魚(yú)肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

表5 QS對(duì)雜交石斑魚(yú)腸道抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 QS對(duì)雜交石斑魚(yú)腸道NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖2顯示了各組雜交石斑魚(yú)腸道NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。與FM組相比，QSL組TNF-α、TRAF-2、TNFRSF1A、IFN-γ、TAB3和MAP3K7的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)，NF-κBp65和IκB-α的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著變化(P>0.05)；QSM和QSH組NF-κBp65、IκB-α、TAB3和MAP3K7的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，TNF-α和IFN-γ的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)，TRAF-2和TNFRSF1A的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著變化(P>0.05)。

TNF-α：腫瘤壞死因子-α tumor necrosis factor-α；TRAF-2：TNF受體相關(guān)因子-2 TNF receptor-associated factor-2；TNFRSF1A：TNF受體超家族成員1A TNF receptor superfamily member 1A；IFN-γ：干擾素-γ interferon-γ；NF-κBp65：NF-κBp65亞單位 nuclear factor-κB p65 subunit；IκB-α：NF-κB抑制劑-α NF-κB inhibitor-α；MAP3K7：絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶7 mitogen-activated protein kinase kinase kinase 7；TAB3：MAP3K7結(jié)合蛋白3 MAP3K7-binding protein 3。

2.4 飼料中添加QS對(duì)雜交石斑魚(yú)腸道菌群的影響

2.4.1 腸道菌群多樣性分析

通過(guò)對(duì)雜交石斑魚(yú)腸道菌群進(jìn)行16S rRNA高通量測(cè)序，樣品的平均干凈讀數(shù)為79 409，平均有效讀數(shù)為74 985?；贠TU數(shù)據(jù)的韋恩圖(圖3)顯示，4組共享的OTU數(shù)目為619個(gè)；FM組中特有OTU數(shù)目最多，為134個(gè)；QSH組中特有OTU數(shù)目最少，為75個(gè)。OTU分析表明，QS使雜交石斑魚(yú)腸道微生物群落數(shù)量降低。

FM：FM組 FM group；QSL：QSL組 QSL group；QSM：QSM組 QSM group；QSH：QSH組 QSH group。

使用QIIME2軟件，進(jìn)行α多樣性指數(shù)分析。所有樣本的Good’s覆蓋率均高于99.6%，表明數(shù)據(jù)涵蓋了大多數(shù)細(xì)菌物種。α多樣性指數(shù)結(jié)果如表6所示，與FM組相比，各添加QS組OTU數(shù)目，ACE和Chao1指數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)，QSL組的Simpson和Shannon指數(shù)顯著增加(P<0.05)，QSM和QSH組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表6 QS對(duì)雜交石斑魚(yú)腸道菌群α多樣性指數(shù)的影響

通過(guò)偏最小二乘判別分析(PLS-DA)法對(duì)雜交石斑魚(yú)腸道菌群的β多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，成分(component)1和2的主要貢獻(xiàn)率分別為11.75%、9.26%，4組樣本有明顯聚類趨勢(shì)，QSL和QSM組遠(yuǎn)離FM組(圖4)，這說(shuō)明QS可引起雜交石斑魚(yú)腸道菌群結(jié)構(gòu)改變。

圖4 偏最小二乘判別分析

2.4.2 腸道菌群組成分析

根據(jù)物種注釋結(jié)果，4組雜交石斑魚(yú)腸道菌群在門(mén)水平上的組成見(jiàn)圖5-A，在屬水平上的組成見(jiàn)圖5-B。

由圖5-A可知，4組樣本中相對(duì)豐度大于5%的菌門(mén)共有5個(gè)，分別為厚壁菌門(mén)(Firmicutes，31.24%)、變形菌門(mén)(Proteobacteria，26.50%)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes，13.37%)、放線菌門(mén)(Actinobacteria，9.68%)和疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia，5.09%)。方差分析結(jié)果(表7)顯示，與FM組相比，QSM組Firmicutes相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)；QSL組Bacteroidetes相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)，Actinobacteria相對(duì)豐度顯著增加(P<0.05)。

表7 雜交石斑魚(yú)腸道菌群門(mén)水平上的相對(duì)豐度

由圖5-B可知，除屬水平上未命名的菌群外，4組樣本中相對(duì)豐度大于2%的菌屬共有10個(gè)，分別為艾克曼菌屬(Akkermansia，4.86%)、擬桿菌屬(Bacteroides，4.77%)、不可培養(yǎng)細(xì)菌_o_Chloroplast(uncultured_bacterium_o_Chloroplast，3.33%)、暫定種_Vidania(Candidatus_Vidania，3.22%)、乳桿菌屬(Lactobacillus，2.88%)、不可培養(yǎng)細(xì)菌_f_毛螺菌科(uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae，2.86%)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium，2.80%)、瘤胃球菌科_UCG-005(Ruminococcaceae_UCG-005，2.62%)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio，2.43%)、不可培養(yǎng)細(xì)菌_f_Muribaculaceae(uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae，2.26%)。方差分析結(jié)果(表8)顯示，與FM組相比，QSL組Bifidobacterium相對(duì)豐度顯著增加(P<0.05)、Akkermansia相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)；QSM組Ruminococcaceae_UCG-005相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)。

表8 雜交石斑魚(yú)腸道菌群屬水平上的相對(duì)豐度

3 討 論

3.1 QS對(duì)雜交石斑魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

黃酮類化合物是藥用植物最有效的成分之一，可提高魚(yú)類的生長(zhǎng)速度，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力[32-33]。研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.4 g/kg槲皮素可顯著提高草魚(yú)的WGR并降低FCR[29]。Zhai等[30]報(bào)道，飼料中添加不同水平(200、400、800和1 600 mg/kg)槲皮素后羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)的SGR有所提高，且高劑量更有效。在肉雞的研究中發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0、0.02%、0.04%、0.06%的槲皮素對(duì)生長(zhǎng)指標(biāo)無(wú)顯著影響[34]。槲皮素被機(jī)體吸收后主要以苷元形式存在，這種存在形式在促進(jìn)生長(zhǎng)中可能發(fā)揮重要作用[35]。但由于研究對(duì)象、飼養(yǎng)條件和使用劑量不同，目前關(guān)于槲皮素的促生長(zhǎng)機(jī)制尚不清楚。本試驗(yàn)中，QS對(duì)雜交石斑魚(yú)的生長(zhǎng)性能無(wú)顯著影響；相比于FM組，QSL組的終末體重和WGR有上升趨勢(shì)，但隨著添加量的增加而降低?；腔磻?yīng)顯著提高了槲皮素的水溶性，但也可能導(dǎo)致QS在魚(yú)體內(nèi)的吸收與代謝發(fā)生改變。此外，植物提取物對(duì)生長(zhǎng)的促進(jìn)作用呈劑量依賴性，超出最佳劑量時(shí)，可能會(huì)降低促生長(zhǎng)作用。在草魚(yú)的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著槲皮素添加量的增加，WGR有降低的趨勢(shì)[29]。Santos-Buelga等[36]發(fā)現(xiàn)，飼喂3.3 g/kg槲皮素可使小鼠的WGR降低29%。高劑量添加黃酮類化合物可能會(huì)抑制營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，導(dǎo)致促生長(zhǎng)作用降低[29]。由于缺乏QS相關(guān)文獻(xiàn)，其飼用最佳添加量仍需進(jìn)一步研究。

3.2 QS對(duì)雜交石斑魚(yú)抗氧化能力的影響

機(jī)體通過(guò)產(chǎn)生少量活性氧(ROS)增強(qiáng)對(duì)病原體的抵抗能力，而過(guò)量的ROS可對(duì)組織和細(xì)胞造成氧化損傷[37]。槲皮素可能通過(guò)上調(diào)抗氧化酶(如SOD、CAT和GPx)的活性抑制過(guò)量ROS的形成，從而減少細(xì)胞氧化應(yīng)激[38-39]。據(jù)Cui等[40]報(bào)道，槲皮素和槲皮素-5′,8-二磺酸鹽增強(qiáng)了小鼠肝臟GPx和SOD活性并抑制氧化應(yīng)激。本試驗(yàn)中，3個(gè)添加QS組雜交石斑魚(yú)肝臟中SOD、GPx和CAT活性均顯著提高，其中QSL和QSM組增強(qiáng)效果更顯著，表明QS增強(qiáng)了雜交石斑魚(yú)肝臟的抗氧化能力，且較低劑量更有效。根據(jù)Czerwonka等[21]的研究結(jié)果，槲皮素和QS均具有高自由基清除能力，且二者清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)的能力相當(dāng)。綜上所述，本試驗(yàn)進(jìn)一步證明了QS的抗氧化能力。

當(dāng)機(jī)體ROS產(chǎn)生和清除之間的平衡遭到破壞時(shí)，會(huì)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致MDA和其他過(guò)氧化脂的積累，因此MDA含量通常用于評(píng)估細(xì)胞氧化損傷程度[41]。GPx是一種重要的抗氧化酶，可通過(guò)谷胱甘肽(GSH)還原過(guò)氧化氫(H2O2)清除氧自由基；機(jī)體中H2O2含量增加，可引起組織氧化應(yīng)激[42-43]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，QS的添加使雜交石斑魚(yú)腸道中GPx活性顯著降低，MDA含量顯著增加。Kaindl等[44]發(fā)現(xiàn)，槲皮素可有效抵抗結(jié)腸上皮中脂肪酸氫過(guò)氧化物(LOOH)等營(yíng)養(yǎng)因素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，但在無(wú)外源壓力的情況下，槲皮素可引起組織損傷。槲皮素的毒性作用可能與槲皮素清除ROS的過(guò)程中氧化形成的有毒產(chǎn)物有關(guān)。槲皮素能夠與人體自由基反應(yīng)生成有毒的氧化產(chǎn)物，即槲皮素-奎寧(quercetin-quinine)，這種物質(zhì)幾乎立即與GSH反應(yīng)，或者在沒(méi)有GSH的情況下與蛋白質(zhì)巰基反應(yīng)[45-48]。此類反應(yīng)一旦發(fā)生，可能會(huì)導(dǎo)致毒性作用，例如，通過(guò)破壞細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)的完整性而導(dǎo)致細(xì)胞損傷，或破壞含有巰基結(jié)構(gòu)的酶的功能[49-51]。此外，在離體小鼠肝核模型系統(tǒng)中，槲皮素以劑量依賴性方式降低核GSH含量，并可能導(dǎo)致DNA損傷[52]。本研究中，隨著QS添加量的增加，雜交石斑魚(yú)肝臟SOD和GPx活性出現(xiàn)下降趨勢(shì)，腸道MDA含量顯著增加。雜交石斑魚(yú)攝入高劑量QS后，可能產(chǎn)生了有毒的代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物降低了肝臟和腸道的抗氧化能力。

3.3 QS對(duì)雜交石斑魚(yú)腸道NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

適量的炎癥因子參與損傷組織再生，可修復(fù)和愈合傷口；嚴(yán)重的炎癥會(huì)破壞正常組織和細(xì)胞，引起各種炎癥性疾病[53]。NF-κB信號(hào)通路被認(rèn)為在促炎基因的表達(dá)中起主要作用[54]。TNF-α是早期炎癥發(fā)生過(guò)程中的重要成分[55]。根據(jù)Yang等[34]對(duì)肉雞的研究結(jié)果，槲皮素通過(guò)上調(diào)脾臟中TNF-α、TRAF-2、TNFRSF1B、NF-κBp65和IFN-γ和下調(diào)IκB-α的表達(dá)激活NF-κB信號(hào)通路。與Yang等[34]的研究結(jié)果一致，本試驗(yàn)中，添加QS組雜交石斑魚(yú)腸道NF-κB信號(hào)通路被激活，TNF-α的相對(duì)表達(dá)量在各添加QS組中顯著上調(diào)。研究顯示，植物成分飼料添加劑對(duì)魚(yú)類炎癥基因的表達(dá)有促進(jìn)作用，能夠上調(diào)TNF-α在魚(yú)腸道中的表達(dá)[56-57]。隨著QS添加量的增加，NF-κBp65的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)，NF-κB信號(hào)通路被抑制，結(jié)合抗氧化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果，表明腸道抗氧化能力降低，這可能導(dǎo)致了ROS的蓄積。研究發(fā)現(xiàn)，ROS少量存在時(shí)，有利于NF-κB信號(hào)通路的激活，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用；當(dāng)ROS大量存在時(shí)，可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡[58-59]。

體外試驗(yàn)證明QS顯著降低了HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞系的活力，表明QS可能是潛在的抗結(jié)腸癌藥物[21]。研究發(fā)現(xiàn)，抗結(jié)腸癌藥物在高度增殖的正常組織(如胃腸道黏膜)中表現(xiàn)出了細(xì)胞毒性：通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞氧化應(yīng)激、增加ROS生成并促發(fā)一系列炎癥通路，破壞腸道黏膜，引發(fā)黏膜炎[60-61]。NF-κB在此過(guò)程中起關(guān)鍵作用，可誘導(dǎo)炎癥基因表達(dá)和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致組織損傷和細(xì)胞凋亡[61]。這可能進(jìn)一步解釋了腸道MDA含量的增加。此外，NF-κB還會(huì)導(dǎo)致黏附分子和環(huán)氧合酶-2(COX-2)基因表達(dá)上調(diào)[62]。COX-2是一種參與炎癥的誘導(dǎo)型酶，在血管內(nèi)皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞、癌性上皮和成纖維細(xì)胞中受到刺激后表達(dá)[62]。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素及其代謝物在體外和體內(nèi)都表現(xiàn)出對(duì)COX-2的激活作用[63-64]。根據(jù)上述研究結(jié)果推測(cè)QS具有促炎活性，長(zhǎng)期補(bǔ)充可能會(huì)導(dǎo)致腸道發(fā)生炎癥反應(yīng)。然而，仍需要更多的研究來(lái)明確QS與魚(yú)類腸道炎癥反應(yīng)間的聯(lián)系。

3.4 QS對(duì)雜交石斑魚(yú)腸道菌群的影響

腸道是魚(yú)類的消化和免疫器官，腸道菌群在維持宿主腸道結(jié)構(gòu)功能，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、代謝以及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等方面具有重要作用[65]。研究表明，膳食多酚可調(diào)節(jié)腸道微生物群落的組成和活性[66]。在人類腸道中發(fā)現(xiàn)，腸道微生物參與黃酮類化合物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化，發(fā)揮更強(qiáng)的生理功能[67]。本試驗(yàn)中，菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明雜交石斑魚(yú)腸道菌群在門(mén)水平主要富集在Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria和Verrucomicrobia。這一結(jié)果與He等[68]對(duì)雜交石斑魚(yú)腸道優(yōu)勢(shì)菌群的研究結(jié)果一致。這些菌門(mén)通常構(gòu)成了雜交石斑魚(yú)的腸道核心菌群，而與飲食類型無(wú)關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)irmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes占各種海洋和淡水魚(yú)類腸道微生物群的90%[69-71]。這些細(xì)菌在宿主腸道的營(yíng)養(yǎng)吸收和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

通常，腸道菌群的多樣性越高，微生態(tài)系統(tǒng)越穩(wěn)定，腸道菌群多樣性降低可能導(dǎo)致細(xì)菌群落功能穩(wěn)定性降低，增加機(jī)體患病風(fēng)險(xiǎn)[72]。分析菌群α多樣性變化有助于從宏觀上評(píng)估QS對(duì)雜交石斑魚(yú)腸道菌群的影響。本試驗(yàn)中，QS添加不影響雜交石斑魚(yú)腸道菌群的種類和豐富度。與FM組相比，QSL組的物種多樣性和均勻度變化最顯著。Xiong等[73]研究發(fā)現(xiàn)，幼蝦發(fā)生疾病后腸道菌群組成會(huì)發(fā)生顯著變化。

腸道中的微生物具有塑造炎癥微環(huán)境的潛力，相反，炎癥也可能會(huì)影響微生物的組成[74]。Jiang等[75]發(fā)現(xiàn)益生菌補(bǔ)充劑可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的激活改善腸道微生物紊亂。這意味著腸道微生物失衡可能激活NF-κB信號(hào)通路導(dǎo)致腸炎。在本試驗(yàn)中，與FM組相比，QSL組Bacteroidetes相對(duì)豐度顯著降低。譚蓉等[76]研究結(jié)果中腸道炎癥伴隨著B(niǎo)acteroidetes相對(duì)豐度的下降。Lactobacillus、Bifidobacterium和Akkermansia是水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域最常用的益生菌種類，它們的減少會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)炎癥和代謝紊亂[77]。進(jìn)一步從屬水平上發(fā)現(xiàn)，QSL組Akkermansia相對(duì)豐度顯著降低。Wang等[78]發(fā)現(xiàn)固腸止瀉丸可以降低與結(jié)腸炎呈正相關(guān)的Turicibacter的相對(duì)豐度，顯著增加有益菌Ruminococcaceae_UCG-005的相對(duì)豐度。在本試驗(yàn)中，與FM組相比，QSM組Ruminococcaceae_UCG-005相對(duì)豐度顯著降低。因此，QS可能通過(guò)直接或間接影響腸道炎癥相關(guān)微生物的豐度調(diào)控NF-κB信號(hào)通路的激活。

4 結(jié) 論

① 飼料中添加QS不影響雜交石斑魚(yú)的生長(zhǎng)。

② 飼料中添加QS可以提高雜交石斑魚(yú)的肝臟抗氧化能力。

③ QS通過(guò)增強(qiáng)腸道氧化應(yīng)激、降低腸道Bacteroidetes和Akkermansia的相對(duì)豐度、激活腸道NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)雜交石斑魚(yú)的腸道炎癥反應(yīng)。