飼料添加L-精氨酸或N-氨甲酰谷氨酸對雜交鱧生長性能、血漿生化指標(biāo)、腸道功能及抗氧化能力的影響

李培佳 侯冬強* 趙紅霞 陳 冰 彭 凱 黃 文,3 鄭春田 曹俊明

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣州 510640；2.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江 524088；3.廣州飛禧特生物科技有限公司，廣州 510640)

精氨酸(Arg)作為魚類必需氨基酸，參與機體蛋白質(zhì)、肌酸等合成，對促進水生動物生長、提高機體抗氧化能力等方面極為重要[1]。研究結(jié)果表明，Arg可提高養(yǎng)殖動物飼料效率和蛋白質(zhì)沉積率[2]；降低血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性，維持正常氨基酸代謝能力[3]；提高腸道谷胱甘肽過氧化物酶活性，增強機體抗氧能力[4]；降低腸道丙二醛含量，減少腸道氧化損傷[5]。N-氨甲酰谷氨酸(NCG)作為N-乙甲酰谷氨酸(NAG)類似物，可激活氨甲酰磷酸合酶-1(CPS-1)，促進內(nèi)源性Arg合成[6-7]。同時作為一種安全、代謝穩(wěn)定的營養(yǎng)物質(zhì)，可在治療疾病有關(guān)的方面發(fā)揮有益作用[8]。然而，飼料中直接添加Arg在體內(nèi)易被精氨酸酶降解，并且會影響機體對其他氨基酸的吸收效率。因此，利用NCG內(nèi)源性合成Arg是目前解決Arg使用問題的可行方法，飼料中直接添加NCG，不僅代謝穩(wěn)定性高，而且吸收效率強，相對于飼料補充Arg大幅降低了飼料成本。

雜交鱧子一代較斑鱧(Channamaculata)、烏鱧(ChannaArgus)在生長性能、抗病能力方面有顯著優(yōu)勢。目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，易馴食人工配合飼料，養(yǎng)殖周期短，珠三角養(yǎng)殖產(chǎn)量占比較高[9]。近年來，隨著養(yǎng)殖產(chǎn)量不斷攀升，營養(yǎng)性、微生物性疾病不斷增多。本實驗室開展了雜交鱧對Arg需要量的養(yǎng)殖試驗，試驗結(jié)果表明，雜交鱧Arg適宜水平為2.91%～2.98%[10]。目前，由于不同魚種飼料添加Arg存在其他氨基酸吸收拮抗、投入成本太高等因素，因此內(nèi)源性合成Arg途徑成為高效經(jīng)濟的方法，但是關(guān)于NCG在水產(chǎn)動物飼料中的應(yīng)用研究較少。NCG研究主要集中為內(nèi)源性激活A(yù)rg，也有研究證明，飼料添加NCG可提高大菱鲆(Scophthalmusmaximus)的生長性能[11]，改善鏡鯉(Cyprinuscarpio)的機體免疫活性[12]。NCG在魚類機體內(nèi)可內(nèi)源性合成Arg，生成的Arg與NCG比值為(10～20)∶1[13]。本實驗室開展了Arg或NCG在黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)中的應(yīng)用試驗，發(fā)現(xiàn)黃顙魚飼料中NCG的適宜添加水平是Arg適宜添加水平的1/20[14]。在黃顙魚[14]、大菱鲆[11]、花鱸(Lateolabraxmaculatus)[15]、羅非魚(Oreochromismossambicus)[16]、鏡鯉[12]等水產(chǎn)動物中的研究表明，NCG在飼料中的適宜添加水平為0.03%左右。前期開展試驗獲得的雜交鱧飼料Arg適宜添加水平為0.6%[10]，本試驗NCG添加水平設(shè)計主要依據(jù)以上研究文獻，按照雜交鱧飼料Arg適宜添加水平的1/20即0.03%添加。本試驗通過在飼料中添加Arg或NCG，研究其對雜交鱧幼魚生長性能、體成分、腸道功能、血漿生化指標(biāo)及抗氧化能力的影響，為NCG在雜交鱧配合飼料中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

基礎(chǔ)飼料的主要原料為魚粉、面粉、豆粕、玉米蛋白粉，在基礎(chǔ)飼料中分別添加0(對照)、0.60% Arg(L-Arg，純度≥98%)、0.03% NCG(純度≥98%)配制成3種試驗飼料。飼料Arg含量采用GB/T 18246—2019的常規(guī)酸水解法測定。飼料營養(yǎng)水平及維生素預(yù)混料、礦物質(zhì)預(yù)混料添加水平按照烏鱧營養(yǎng)需求量添加[17]。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

根據(jù)飼料配方將原料粉碎，要求過60目篩，而后進行稱量，稱量后將其逐級混勻，加入磷脂油、豆油、魚油、水進行再次混勻，混勻后，將原料置于膨化機內(nèi)膨化制成膨化顆粒飼料(華強膨化機械T52型膨化機)，而后將膨化飼料置于55 ℃溫度烘干。

1.2 試驗設(shè)計及養(yǎng)殖管理

將雜交鱧魚苗(錦龍漁業(yè)有限公司)運輸至廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所白云實驗基地。魚苗運回后在暫養(yǎng)網(wǎng)箱暫養(yǎng)1周，暫養(yǎng)網(wǎng)箱規(guī)格為2.5 m×2.5 m×1.5 m，暫養(yǎng)期每天飽食投喂2次基礎(chǔ)飼料，暫養(yǎng)結(jié)束后饑餓24 h開始正式試驗。隨機挑選初始體重為(22.02±0.02)g、體格健壯的雜交鱧魚苗450尾，隨機分為3組，分別為對照組、0.60% Arg組、0.03% NCG組，每組3個重復(fù)(網(wǎng)箱)，每個網(wǎng)箱50尾魚，分別投喂3種試驗飼料。

試驗網(wǎng)箱規(guī)格為1.5 m×1.5 m×1.5 m，水體有效體積為293 L，飼喂8周。每天08:00、16:00定時表觀飽食投喂2次，并根據(jù)水溫、攝食和生長等因素調(diào)整投喂量，并記錄攝食及死亡情況。每日對養(yǎng)殖環(huán)境進行檢測，要求溶氧含量大約為8 mg/L，酸堿度大約為8.0，水溫為25～32 ℃，氨氮含量小于0.1 mg/L。

1.3 樣品采集及測定指標(biāo)

1.3.1 生長性能和形態(tài)學(xué)指標(biāo)

生長性能和形態(tài)學(xué)指標(biāo)計算公式如下：

存活率(survival rate，SR，%)=100×F末/F初;增重率(weight gain rate，WGR，%)=100×(W末-W初)/W初;飼料系數(shù)(feed coefficient rate，F(xiàn)CR)=D總/(W末-W初);蛋白質(zhì)沉積率(protein deposition rate，PDR，%)=100×(W末×CP末-W初×CP初)/(D×CP飼料);特定生長率(specific growth rate，SGR，%/d)=100×(LnW末-LnW初)/T;肥滿度(condition factor，CF，g/cm3)=100×W/L3;肝體比(hepatopancreas somatic indices，HIS，%)=100×W肝臟/W;臟體比(viscera somatic indices，VSI，%)=100×W內(nèi)臟/W。

式中：F初為初始尾數(shù)；F末為終末尾數(shù)；W為體重；L為體長；W初為初始魚體重；W末為終末魚體重；CP初為初始魚體蛋白質(zhì)含量；CP末為終末魚體蛋白質(zhì)含量；CP飼料為飼料蛋白質(zhì)含量；D總為攝入飼料總重；D為飼料攝入量；T為養(yǎng)殖時間；W肝臟為肝臟重；W內(nèi)臟為內(nèi)臟重。

1.3.2 飼料營養(yǎng)水平及魚體營養(yǎng)成分測定

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后進行樣品采集，將試驗魚禁食24 h，記錄每個試驗網(wǎng)箱稱重計數(shù)結(jié)果。隨后從每個網(wǎng)箱中隨機選取3尾魚檢測魚體營養(yǎng)成分。飼料及魚體粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分、水分含量分別采用GB/T 6432—2018、GB/T 6433—2006、GB/T 6438—2007、GB/T 6435—2014的方法進行測定。

1.3.3 血漿制備及生化指標(biāo)測定

從每個網(wǎng)箱中隨機選取8尾魚抽取血液制備血漿，首先采用濃度為120 mg/L MS-222溶液麻醉，尾靜脈采血法采集血液，肝素鈉抗凝管收集血液，將采集好的血液采用離心機4 000 r/min進行離心，離心時間10 min，制備血漿。

血漿總蛋白(total protein，TP)含量采用雙縮脲法測定，谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)活性采用速率法測定,尿素氮(urea nitrogen，UN)含量采用酶偶聯(lián)速率法測定，總膽固醇(total cholesterol，TCHO)、甘油三酯(triglyceride，TG)、葡萄糖(glucose，GLU)含量采用酶活性法測定。血漿生化指標(biāo)采用的測定儀器均為全自動化分析儀(貝克曼ProCX4，德國)。

1.3.4 腸道消化酶、功能性指標(biāo)及血漿抗氧化指標(biāo)測定

從每個網(wǎng)箱中隨機選取3尾魚解剖后取腸道組織，進行腸道消化酶、功能性指標(biāo)檢測。采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定腸道蛋白酶、脂肪酶(lipase，LPS)、淀粉酶(amylase，AMS)、Na+/K+ATP酶(sodium-potassium ATPase，Na+/K+ATPase)、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶(γ-glutamyltransferase，γ-GT)，血漿超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、過氧化物酶(peroxidase，POD)活性，總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，測定方法、步驟、計算公式等見試劑盒說明書。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)分析結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，而后采用Duncan氏法進行多重比較，差異顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料添加Arg和NCG對雜交鱧生長性能及形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響

由表3可知，與對照組和0.03% NCG組相比，飼料中添加0.60% Arg顯著提高了雜交鱧WGR及SGR(P<0.05)。對照組和0.03% NCG組間雜交鱧WGR及SGR沒有顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，飼料中添加0.60% Arg和0.03% NCG顯著降低了雜交鱧FCR(P<0.05)。與對照組相比，飼料中添加0.60% Arg和0.03% NCG顯著提高了雜交鱧的PDR及SR(P<0.05)，0.60% Arg和0.03% NCG組間PDR和SR顯著差異(P<0.05)。與對照組相比，各試驗組CF、HSI、VSI無顯著差異(P>0.05)。

表3 飼料添加Arg和NCG對雜交鱧魚體成分的影響

2.2 飼料添加Arg和NCG對雜交鱧魚體成分的影響

由表4可知，與對照組相比，飼料中添加0.60% Arg和0.03% NCG顯著增加了雜交鱧全魚CP含量(P<0.05)。飼料中添加0.60% Arg或0.03% NCG對雜交鱧全魚水分、EE、Ash含量無顯著影響(P>0.05)。

表4 飼料添加Arg和NCG對雜交鱧血漿生化指標(biāo)的影響

2.3 飼料添加Arg和NCG對雜交鱧血漿生化指標(biāo)的影響

由表5可知，飼料中添加0.60% Arg或0.03% NCG對雜交鱧血漿TP、TG、GLU、UN、TC含量及AST、ALT活性均無顯著影響(P>0.05)。

表5 飼料添加Arg和NCG對雜交鱧腸道消化酶活性及功能性指標(biāo)的影響

2.4 飼料添加Arg和NCG對雜交鱧腸道消化酶活性及功能性指標(biāo)的影響

由表6可知，與對照組相比，飼料中添加0.60% Arg顯著增加了雜交鱧腸道蛋白酶、LPS、AMS和γ-GT活性(P<0.05)。與對照組和0.60% Arg組相比，飼料中添加0.03% NCG顯著提高了雜交鱧腸道AMS活性(P<0.05)。飼料中添加0.60% Arg或0.03% NCG對雜交鱧腸道Na+/K+ATPase酶活性無顯著影響(P>0.05)。

表6 飼料添加Arg和NCG對雜交鱧血漿抗氧化指標(biāo)的影響

2.5 飼料添加Arg和NCG對雜交鱧血漿抗氧化指標(biāo)的影響

由表7可知，與對照組相比，飼料中添加0.60% Arg顯著提高了雜交鱧血漿T-AOC(P<0.05)。與對照組和0.60% Arg組相比，飼料中添加0.03% NCG顯著提高了雜交鱧血漿POD活性(P<0.05)。0.60% Arg組雜交鱧血漿POD活性與對照組之間沒有顯著差異(P>0.05)。與0.60% Arg組相比，飼料中添加0.03% NCG顯著提高了雜交鱧血漿CAT活性(P<0.05)。飼料中添加0.60% Arg或0.03% NCG對雜交鱧SOD、GSH-Px活性及MDA含量無顯著影響(P>0.05)。

表2 飼料添加Arg和NCG對雜交鱧生長性能及形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響

3 討 論

由于水生動物鳥氨酸轉(zhuǎn)羧化酶(OTC)、氨甲酰磷酸合成酶(CPS)Ⅲ的活性偏低，因此，必需外源補充Arg以滿足魚類生長和代謝所必需[1]。Arg可激活雷帕霉素靶蛋白(TOR)信號通路調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成，參與鳥氨酸循環(huán)，促進蛋白質(zhì)在體內(nèi)沉積，提高機體生長性能[18]。水生動物缺乏Arg會導(dǎo)致生長遲緩、免疫神經(jīng)受損、營養(yǎng)障礙性疾病等[19]。在本試驗條件下，飼料添加0.03% NCG對雜交鱧WGR及SGR沒有顯著影響，但添加0.60% Arg使飼料Arg含量達到2.92%，可顯著提高雜交鱧WGR及SGR，可能由于雜交鱧對NCG合成的內(nèi)源Arg利用效率低于飼料添加的Arg。但飼料中添加Arg和NCG可降低FCR，提高PDR。這表明外源添加Arg或NCG都可提高機體蛋白質(zhì)沉積，提高生長效率。在本試驗條件下，與對照組相比，飼料中添加Arg和NCG可提高PDR，并且提高雜交鱧魚體CP含量，但對全魚水分、EE、CF含量沒有顯著影響，說明適量添加Arg可有效促進魚體蛋白質(zhì)沉積，促進氨基酸吸收利用，提高肌肉品質(zhì)。NCG作為NAG類似物，由于NAG易降解，NCG不易降解，并且與直接添加Arg相比，可降低飼料成本，提高代謝相對穩(wěn)定性[13]。目前，在水產(chǎn)動物中關(guān)于Arg和NCG的應(yīng)用研究效果較缺乏，并且在研究中還要考慮到添加量、試驗動物種類以及實際生產(chǎn)成本等因素。

血漿生化指標(biāo)直觀反映魚體健康水平、代謝能力及機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，也可反映機體病理變化[20]。在本研究中，雜交鱧血漿TP、TG、GLU、UN、TC含量及AST、ALT活性各組間均無顯著差異，表明外源添加Arg或內(nèi)源合成途徑并未對雜交鱧機體產(chǎn)生不良影響。

腸道作為運輸、消化食物的主要場所，是一個復(fù)雜的多功能器官，同時也是抵御病原微生物入侵的防線，對魚類生長及健康非常重要[21]。本試驗中，與對照組及0.60% Arg組相比較，飼料添加0.03% NCG顯著增加了雜交鱧腸道AMS活性，飼料添加Arg可顯著提高仿刺參蛋白酶活性[22]，顯著提高建鯉蛋白酶及LPS活性[23]，與本試驗研究結(jié)果相同，但NCG在水產(chǎn)動物消化方面研究相對較少。本試驗結(jié)果表明，在飼料中添加Arg可顯著促進營養(yǎng)物質(zhì)交換，提高雜交鱧腸道酶活性及能量轉(zhuǎn)化效率，但Arg代謝物多胺可作用于細(xì)胞增殖分化，同時保護腸道的完整性[24]，Arg在促進營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收方面的作用不僅取決于消化酶的活性，還可能與其代謝產(chǎn)物如一氧化氮或多胺有關(guān)。研究顯示，飼料補充NCG可促進羅非魚脂肪沉積[16]，顯著提高黃顙魚腸道LPS活性[25]，顯著提高大菱鲆PDR[11]，顯著提高花鱸PDR，減少肝腹脂沉積[15]。本試驗結(jié)果表明，添加Arg提高腸道蛋白酶活性，作用于機體蛋白質(zhì)合成，促進機體生長，但NCG只顯著提高了腸道AMS活性，與上述研究結(jié)果不一致，原因可能由于內(nèi)源性合成Arg利用效率低，或與添加量及動物種類相關(guān)聯(lián)。

在水生動物中，機體抗氧化防御系統(tǒng)通過清除體內(nèi)外氧自由基，減少內(nèi)外環(huán)境因素造成的氧化應(yīng)激，保護機體免受氧自由基損傷，其中抗氧化酶的保護機制主要與清除ROS相關(guān)，抗氧化防御系統(tǒng)由SOD、GSH-Px、T-AOC等組成，調(diào)節(jié)機體氧化平衡[26-27]。在本試驗條件下，與對照組相比，飼料添加0.60% Arg顯著增強了雜交鱧血漿T-AOC，T-AOC是機體抗氧化能力的綜合指標(biāo)，直接參與并反映機體受外部刺激及氧自由基代謝的能力。與0.60% Arg組相比，0.03% NCG組顯著提高雜交鱧血漿CAT及POD活性，NCG的抗氧化活性效果要優(yōu)于Arg。

4 結(jié) 論

綜上所述，飼料中添加0.60% Arg或0.03% NCG均能顯著增強雜交鱧PDR、魚體CP含量、腸道LPS及γ-GT活性、血漿T-AOC。而飼料中添加0.03% NCG顯著提高了雜交鱧血漿CAT、POD活性。在本試驗條件下，飼料中添加Arg在生長性能上優(yōu)于NCG，但對抗氧化能力而言，飼料中添加NCG效果優(yōu)于Arg。