不同儲存方式和發(fā)酵時間對茅臺酒糟常規(guī)營養(yǎng)成分含量、發(fā)酵品質(zhì)和微生物多樣性的影響

樊雪瑩 成啟明 陳玉連 李 平 龍見華 李茂雅 陳 超

(貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550000)

近年來，隨著農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革的推進(jìn)，以牛、羊為主的草食畜牧業(yè)比例逐步提高。畜牧業(yè)的發(fā)展帶動了飼草產(chǎn)業(yè)發(fā)展，飼草多樣化供給的態(tài)勢日益突出，飼草需求面臨新的挑戰(zhàn)[1]。隨著我國畜牧業(yè)的快速發(fā)展，飼料用糧的供需矛盾也日益突出，發(fā)展節(jié)糧型畜牧業(yè)，開辟非常規(guī)飼料資源，調(diào)整飼料生產(chǎn)結(jié)構(gòu)，提高飼料資源利用率，已成為我國畜牧業(yè)發(fā)展的必然趨勢。因此，新型優(yōu)質(zhì)飼草的研究與應(yīng)用對未來畜牧業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展具有極為重要的意義。

酒糟是一類數(shù)量較大、來源較集中和穩(wěn)定的非常規(guī)飼料資源[2]。研究發(fā)現(xiàn)，白酒與酒糟產(chǎn)量比為1∶3，2019年，貴州省規(guī)模以上白酒企業(yè)白酒產(chǎn)量總計27.39萬t，酒糟產(chǎn)量已高達(dá)90萬t，據(jù)茅臺公司數(shù)據(jù)顯示，2020年茅臺系列基酒產(chǎn)量約為5.02萬t[3]，酒糟廢棄量可達(dá)15萬t，造成較大的資源浪費和環(huán)境污染。茅臺酒糟作為醬香型酒糟的代表，其營養(yǎng)成分豐富，水分、粗蛋白質(zhì)(crude protein，CP)、淀粉、粗脂肪(ether extract，EE)、粗纖維、粗灰分及無氮浸出物的含量分別為58.46%、13.28%、6.77%、2.51%、7.12%、3.24%和15.38%，可作為優(yōu)質(zhì)飼料飼喂家畜[4]。另外，酒糟是經(jīng)發(fā)酵高溫蒸煮形成的，因此粗纖維含量較低[5]，具有較好的適口性和易消化的特點，而且在一定程度上可以有效預(yù)防牛發(fā)生瘤胃鼓氣的現(xiàn)象。但是酒糟的產(chǎn)量很大，而且濕酒糟水分含量很高，保存困難[6]。因此大量研究者對酒糟飼料合理保存開展研究。王鴻澤等[7]將酒糟與甘薯蔓、稻草混合青貯，研究發(fā)現(xiàn)添加適量酒糟可以較好地保存青貯飼料營養(yǎng)品質(zhì)，有效提高青貯發(fā)酵品質(zhì)。原現(xiàn)軍等[8]研究表明，添加青稞酒糟可以提高青稞秸稈和高羊茅混合青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，以添加20%青稞酒糟為宜。以上研究表明，發(fā)酵是保存酒糟的最佳方法，但是目前關(guān)于適合酒糟發(fā)酵的儲存方式的研究還未見報道。

目前，關(guān)于茅臺酒糟飼料化利用的研究較少。因此，本試驗旨在研究不同儲存方式和發(fā)酵時間對茅臺酒糟常規(guī)營養(yǎng)成分、發(fā)酵品質(zhì)和微生物多樣性的影響，篩選出茅臺酒糟適宜的儲存方式和發(fā)酵時間，旨在為茅臺酒糟飼料化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

茅臺酒糟取自貴州省遵義市茅臺鎮(zhèn)茅臺集團(tuán)。鮮酒糟原料營養(yǎng)成分如表1所示，鮮酒糟干物質(zhì)(dry matter，DM)含量較高，為48.29%；CP含量為21.917%；中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)含量分別為35.793%、23.580%；可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrates，WSC)含量為3.814%。

表1 鮮酒糟原料營養(yǎng)成分

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2020年8月12日在關(guān)嶺月亮灣牛場進(jìn)行，將97%茅臺酒糟+2%玉米麥麩+1%發(fā)酵劑(主要成分為乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌、雙歧桿菌、丁酸梭菌、淀粉酶、蛋白酶、纖維酶和脂肪酶)用大型攪拌機(jī)混合均勻，按照儲存方式設(shè)置4個處理，即青貯窖(J)、自制真空發(fā)酵(Z)、噸包發(fā)酵(D)和罐裝發(fā)酵(G)，壓實密封，創(chuàng)造無氧環(huán)境，每個處理裝填5 t，設(shè)置3個重復(fù)，每次隨機(jī)取樣，減少環(huán)境影響和誤差。以鮮酒糟為對照(CK)處理，所有處理在25 ℃環(huán)境下發(fā)酵，分別在發(fā)酵7、14和30 d時取樣分析。

1.3 測定指標(biāo)及方法

分別在發(fā)酵7、14和30 d時，取樣測定酒糟常規(guī)營養(yǎng)成分、發(fā)酵品質(zhì)和微生物多樣性。

1.3.1 常規(guī)營養(yǎng)成分測定

采用烘干法[9]測定DM含量，采用蒽酮比色法[10]測定WSC含量，采用凱氏定氮法[11]測定CP含量，使用Ankom 220型纖維分析系統(tǒng)[12]測定ADF和NDF含量。

1.3.2 發(fā)酵品質(zhì)測定

利用四分法隨機(jī)取10 g樣品，加入90 mL無菌生理鹽水，搖床以2 000 r/min振蕩搖晃24 h后，用4層紗布過濾得到浸提液，用于pH、氨態(tài)氮(ammonia nitrogen，NH3-N)和有機(jī)酸含量的測定。使用pH計測定pH，采用苯酚-次氯酸比色法[13]測定NH3-N含量，采用高效液相色譜法測定乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)和丁酸(butyric acid，BA)含量[11]。

1.3.3 微生物多樣性測定

根據(jù)Blaxter等[14]提取DNA方法，將每個處理青貯樣品的3個重復(fù)充分混合均勻，取10 g采用HiPure Soil DNA提取試劑盒進(jìn)行微生物DNA提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S r DNA的V5和V7區(qū)，引物序列為799F：AACMGGATTAGATACCCKG；1193R：ACGTCATCCCCACCTTCC，擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化，采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫。使用MiSeq測序儀進(jìn)行2×300 bp的雙端測序，并對結(jié)果進(jìn)行分析。利用UCLUST比對工具，按97%的序列相似度，對操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)[15]進(jìn)行歸并和劃分，通過與Greengenes數(shù)據(jù)庫的模板序列相對比，對OTU進(jìn)行分類地位的鑒定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素分析，采用SPSS 21.0進(jìn)行方差分析和多重比較，數(shù)據(jù)用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，P<0.05作為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。利用Omicsmart在線平臺分析微生物相對豐度，并進(jìn)行OTU分析、Alpha多樣性分析、物種組成分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同儲存方式和發(fā)酵時間對酒糟常規(guī)營養(yǎng)成分含量的影響

如表2所示，儲存方式對所有常規(guī)營養(yǎng)成分含量均有顯著影響(P<0.05)；發(fā)酵時間對DM和CP含量有顯著影響(P<0.05)，對NDF、ADF和WSC含量無顯著影響(P>0.05)；儲存方式與發(fā)酵時間交互作用對DM和CP含量有顯著影響(P<0.05)，對NDF、ADF和WSC含量無顯著影響(P>0.05)。

表2 不同儲存方式和發(fā)酵時間對酒糟常規(guī)營養(yǎng)成分含量的影響

從儲存方式來看，發(fā)酵7 d時J處理和G處理DM含量顯著低于Z處理和D處理(P<0.05)，發(fā)酵14 d時G處理DM含量顯著低于J處理(P<0.05)，發(fā)酵30 d時Z處理DM含量顯著低于其他各處理(P<0.05)。發(fā)酵7 d時Z處理CP含量顯著高于J處理和D處理(P<0.05)，發(fā)酵14 d時Z處理和D處理CP含量顯著高于J處理和G處理(P<0.05)，發(fā)酵30 d時J處理和Z處理CP含量顯著高于G處理(P<0.05)。發(fā)酵7 d時J處理和D處理NDF含量顯著高于Z處理和G處理(P<0.05)，發(fā)酵14 d時D處理NDF含量顯著高于G處理(P<0.05)，發(fā)酵30 d時J處理和D處理NDF含量顯著高于G處理(P<0.05)。發(fā)酵7 d時J處理和D處理ADF含量顯著高于G處理(P<0.05)，發(fā)酵14 d時Z處理和D處理ADF含量顯著高于G處理(P<0.05)，發(fā)酵30 d時J處理、Z處理和D處理ADF含量顯著高于G處理(P<0.05)。發(fā)酵7 d時J處理、Z處理和D處理WSC含量顯著低于G處理(P<0.05)，發(fā)酵14和30 d時J處理、Z處理WSC含量顯著低于G處理(P<0.05)。

從發(fā)酵時間來看，J處理發(fā)酵14和30 d時DM含量顯著高于發(fā)酵7 d時(P<0.05)，Z處理發(fā)酵30 d時DM含量顯著低于發(fā)酵7和14 d時(P<0.05)，D處理發(fā)酵14和30 d時DM含量顯著低于發(fā)酵7 d時(P<0.05)，G處理發(fā)酵30 d時DM含量顯著高于發(fā)酵7和14 d時(P<0.05)。J處理、Z處理和G處理發(fā)酵30 d時CP含量顯著高于發(fā)酵7和14 d時(P<0.05)，D處理發(fā)酵14和30 d時CP含量顯著高于發(fā)酵7 d時(P<0.05)，不同發(fā)酵時間點的CP含量均大于21%。

2.2 不同儲存方式和發(fā)酵時間對酒糟發(fā)酵品質(zhì)的影響

如表3所示，儲存方式和發(fā)酵時間及二者交互作用對所有發(fā)酵品質(zhì)指標(biāo)均有顯著影響(P<0.05)。

表3 不同儲存方式和發(fā)酵時間對酒糟發(fā)酵品質(zhì)的影響

從儲存方式來看，發(fā)酵7 d時J處理、D處理和G處理pH顯著低于Z處理(P<0.05)，發(fā)酵14 d時J處理和G處理pH顯著低于D處理和Z處理(P<0.05)，發(fā)酵30 d時J處理pH顯著高于其他各處理(P<0.05)。發(fā)酵7 d時J處理LA含量顯著高于Z處理和G處理(P<0.05)，發(fā)酵14 d時J處理LA含量顯著高于其他各處理(P<0.05)，發(fā)酵30 d時D處理LA含量顯著高于其他各處理(P<0.05)。發(fā)酵7 d時G處理AA含量顯著低于其他各處理(P<0.05)，發(fā)酵14 d時G處理AA含量顯著高于Z處理(P<0.05)，發(fā)酵30 d時D處理和G處理AA含量顯著高于J處理和Z處理(P<0.05)。發(fā)酵7 d時D處理PA含量顯著高于G處理(P<0.05)，發(fā)酵14 d時D處理PA含量顯著高于J處理(P<0.05)，發(fā)酵30 d時D處理PA含量顯著高于其他各處理(P<0.05)。發(fā)酵7 d時G處理NH3-N含量顯著高于J處理(P<0.05)，發(fā)酵14 d時Z處理和G處理NH3-N含量顯著高于J處理和D處理(P<0.05)，發(fā)酵30 d時D處理NH3-N含量顯著高于其他各處理(P<0.05)。

從發(fā)酵時間來看，J處理和Z處理發(fā)酵30 d時pH顯著高于發(fā)酵7和14 d時(P<0.05)，D處理發(fā)酵14 d時pH顯著高于發(fā)酵7和30 d時(P<0.05)。J處理和Z處理發(fā)酵30 d時LA含量顯著低于發(fā)酵7和14 d時(P<0.05)，D處理發(fā)酵30 d時LA含量顯著高于發(fā)酵7和14 d時(P<0.05)。J處理、Z處理和D處理發(fā)酵7 d時AA含量顯著高于發(fā)酵14和30 d時(P<0.05)。J處理發(fā)酵7和30 d時PA含量顯著高于發(fā)酵14 d時(P<0.05)，D處理發(fā)酵30 d時PA含量顯著高于發(fā)酵7和14 d時(P<0.05)。J處理發(fā)酵30 d時NH3-N含量顯著低于發(fā)酵14 d時(P<0.05)，Z處理和G處理發(fā)酵14 d時NH3-N含量顯著高于發(fā)酵7和30 d時(P<0.05)，D處理發(fā)酵30 d時NH3-N含量顯著高于發(fā)酵7和14 d時(P<0.05)。4處理均未在發(fā)酵過程中檢測出BA含量。

2.3 不同儲存方式和發(fā)酵時間對酒糟微生物多樣性的影響

2.3.1 基于門水平的微生物群落分析

如圖1所示，J處理發(fā)酵30 d時優(yōu)勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)，其次為厚壁菌門(Firmicutes)，其余處理發(fā)酵7、14和30 d時優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門，其次為變形菌門、放線菌門(Actinobacteria)。其中D處理發(fā)酵14 d時和D處理發(fā)酵30 d時厚壁菌門相對豐度較高，分別為54.99%和54.75%。除J處理發(fā)酵30 d時外，其余處理發(fā)酵7、14和30 d時厚壁菌門相對豐度均高于CK處理。隨著發(fā)酵時間的延長，J處理厚壁菌門和放線菌門相對豐度逐漸下降，變形菌門相對豐度逐漸升高；Z處理厚壁菌門和放線菌門相對豐度先下降后略有上升，變形菌門相對豐度先上升后下降；D處理厚壁菌門相對豐度先上升后保持穩(wěn)定，變形菌門相對豐度先上升后下降，放線菌門相對豐度先下降后上升；G處理厚壁菌門和放線菌門相對豐度先下降后上升，變形菌門相對豐度先上升后下降。

Unclassified：未分類；Other：其他；Gemmaatimonadetes：芽單胞菌門；Patescibacteria：候選門級輻射類群菌；Fusobacteria：梭桿菌門；Deimococcus-Thermus：異常球菌-棲熱菌門；Epsilonbacteraeota：埃普西隆桿菌門；Tenericutes：軟壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Actinobacteria：放線菌門；Proteobacteria：變形菌門；Firmicutes：厚壁菌門。

2.3.2 基于屬水平的微生物群落分析

如圖2所示，隨著發(fā)酵時間的延長，J處理、Z處理和D處理乳桿菌屬(Lactobacillus)相對豐度逐漸下降，G處理乳酸菌豐度先下降后略有上升；J處理芽孢桿菌屬(Bacillus)相對豐度略有上升，醋菌屬(Acetobacter)相對豐度逐漸下降；Z處理芽孢桿菌屬和醋菌屬相對豐度逐漸上升，Z處理發(fā)酵7 d時乳桿菌屬相對豐度最高(20.48%)，Z處理發(fā)酵7 d時芽孢桿菌屬和醋菌屬相對豐度最低(12.04%、6.40%)；D處理芽孢桿菌屬和醋菌屬相對豐度先上升后略有下降，D處理發(fā)酵7 d時乳桿菌屬相對豐度最高(19.44%)，D處理發(fā)酵7 d時芽孢桿菌屬相對豐度最低(11.39%)，D處理發(fā)酵7 d時醋菌屬相對豐度最低(6.30%)；G處理芽孢桿菌屬相對豐度逐漸上升，醋菌屬相對豐度先上升后下降，G處理發(fā)酵7 d時乳桿菌屬相對豐度最高(24.22%)，G處理發(fā)酵7 d時芽孢桿菌屬相對豐度最低(11.47%)，G處理發(fā)酵30 d時醋菌屬相對豐度最低(13.07%)。

Unclassified：未分類；Other：其他；Flavobacterium：黃桿菌屬；Stenotrophomonas：寡養(yǎng)單胞菌屬；Komagataeibacter：木質(zhì)醋酸菌屬；Kroppenstedtia：高溫放線菌屬；Brevibacterium：短桿菌屬；Corynebacterium_1：棒狀桿菌屬1；Pseudomonas：假單胞菌屬；Acetobacter：醋菌屬；Bacillus：芽孢桿菌屬；Lactobacillus：乳桿菌屬。

2.3.3 發(fā)酵品質(zhì)指標(biāo)與微生物菌群之間的相關(guān)性分析

如圖3所示，乳桿菌屬、魏斯氏菌屬(Weissella)、短桿菌屬(Brevibacterium)等有益菌群相對豐度與LA含量呈正相關(guān)，與pH呈負(fù)相關(guān)；假單胞菌屬(Pseudomonas)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、黃金桿菌屬(Chryseobacterium)等有害菌群相對豐度與pH呈正相關(guān)，與LA含量呈負(fù)相關(guān)。

Lactobacillus：乳桿菌屬；Bacillus：芽孢桿菌屬；Acetobacter：醋菌屬；Pseudomonas：假單胞菌屬；Corynebacterium_1：棒桿菌屬-1；Brevibacterium：短桿菌屬；Kroppenstedtia：高溫放線菌屬；Komagataeibacter：木質(zhì)醋酸菌屬；Stenotrophomonas：寡養(yǎng)單胞菌屬；Flavobacterium：黃桿菌屬；Camimonas：高溫菌屬；Myroide：麥羅伊德菌屬；Staphylococcus：葡萄球菌屬；Streptomyces：鏈霉菌屬；Weissella：魏斯氏菌屬；Sphingobacterium：鞘氨醇桿菌屬；Chryeobacterium：黃金桿菌屬；Oceanobacillus：大洋芽孢桿菌屬；Lysinibacillus：賴氨酸芽孢桿菌屬；Comamonas：叢毛單胞菌屬。NH3-N：氨態(tài)氮 ammonia nitrogen；LA：乳酸 lactic acid；AA：乙酸 acetic acid；PA：丙酸 propionic acid；BA：丁酸 butyric acid。

3 討 論

3.1 不同儲存方式和發(fā)酵時間對酒糟營養(yǎng)成分含量的影響

DM是發(fā)酵原料有效利用的物質(zhì)基礎(chǔ)，研究發(fā)現(xiàn)較高的DM含量可以抑制丁酸菌和大腸桿菌等菌群的生長繁殖，降低有害菌對營養(yǎng)成分的降解[16]。本試驗中，在發(fā)酵7 d時，Z處理和D處理DM含量顯著高于J處理和G處理，這可能是由于在酒糟裝填完畢后Z處理和D處理進(jìn)行抽真空處理，空氣含量較少，填裝密度較高，緊實度可以在一定的程度上減少DM的損失，與王旭哲[17]研究結(jié)果一致，其研究發(fā)現(xiàn)玉米發(fā)酵后高緊實度DM含量較高。CP和WSC是乳酸菌等微生物在密封發(fā)酵時利用的營養(yǎng)底物，研究發(fā)現(xiàn)在不同香型酒糟中，醬香型酒糟營養(yǎng)價值相對較高，干物質(zhì)中CP、粗脂肪等含量高，粗纖維含量相對較低，這為乳酸菌提供了充足的發(fā)酵底物[18-19]。CP是飼料的主要營養(yǎng)成分之一，蛋白質(zhì)的降解會影響牧草的營養(yǎng)價值，進(jìn)而影響家畜的采食量[20-21]。4種儲存方式處理發(fā)酵后，隨著發(fā)酵時間的延長，CP含量均有所增加，在發(fā)酵30 d時有較高的CP含量，這與王鴻澤等[22]研究一致，這可能是由于酒糟經(jīng)過1次高溫發(fā)酵，本身酸度低，在發(fā)酵初期可以有效地抑制蛋白酶活性和減少微生物地分解，更好地保存蛋白質(zhì)[7]。其中J處理發(fā)酵7 d時CP含量最少，但仍高于21%，表明所有的儲存方式及發(fā)酵時間均對CP有較好的保存效果。在密封發(fā)酵時，WSC含量越高，發(fā)酵微生物繁殖越快，產(chǎn)生的乳酸越多，能快速降低環(huán)境的pH，有利于保存發(fā)酵飼料。隨著發(fā)酵時間的延長，WSC含量逐漸降低，在發(fā)酵前期WSC消耗較快，后期較為緩慢，本試驗J處理有更低的WSC含量，這可能是由于J處理快速進(jìn)入無氧發(fā)酵階段，乳酸菌快速增殖消耗WSC，產(chǎn)生乳酸，降低pH。對發(fā)酵飼料而言，NDF和ADF含量越高，家畜消化率越低。本試驗中，隨著貯藏時間的延長，NDF和ADF含量上升。張永輝等[23]認(rèn)為青貯后NDF和ADF含量增加，可能是由于青貯發(fā)酵過程中細(xì)菌進(jìn)行呼吸作用導(dǎo)致碳水化合物分解，使纖維的含量相對有所增加，但相比于其他常規(guī)青貯飼草，發(fā)酵酒糟的NDF和ADF含量仍處于較低水平。綜合來看，不同儲存方式下不同發(fā)酵時間酒糟營養(yǎng)成分保存均較好，CP含量較高，NDF、ADF含量相對較低。

3.2 不同儲存方式和發(fā)酵時間對酒糟發(fā)酵品質(zhì)的影響

pH、有機(jī)酸含量是初步衡量發(fā)酵品質(zhì)的重要指標(biāo)，品質(zhì)優(yōu)良的發(fā)酵pH在3.8～4.2。本試驗中，4種儲存方式處理發(fā)酵后，pH均在4.2以下[24]，符合優(yōu)質(zhì)飼料發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)，這可能與酒糟本就經(jīng)過發(fā)酵自身含有較多的發(fā)酵菌有關(guān)。乳酸菌快速增殖，產(chǎn)生大量乳酸，pH迅速下降，使發(fā)酵酒糟達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，密封后期，LA含量雖然有所下降，pH略有上升，但總體pH仍在發(fā)酵飼料要求臨界值4.2以下[25]。不同處理下LA含量隨時間變化規(guī)律不盡相同，J處理和Z處理LA含量隨發(fā)酵時間的延長而下降，這可能是由于發(fā)酵早期占據(jù)主導(dǎo)地位的乳酸菌多為同型乳酸菌，發(fā)酵產(chǎn)物主要為LA，隨著發(fā)酵時間的延長，對pH有較強(qiáng)耐受的異型乳酸菌和芽孢桿菌等細(xì)菌開始增多，導(dǎo)致LA含量降低，而AA和PA含量開始有上升，在發(fā)酵7 d時LA含量最高；D處理LA含量隨發(fā)酵時間的延長先降低后升高，在發(fā)酵30 d時含量最高，這可能是由于優(yōu)勢乳酸菌在發(fā)酵前期被抑制，隨發(fā)酵時間的延長逐漸適應(yīng)并發(fā)揮作用產(chǎn)生LA；G處理LA含量隨發(fā)酵時間延長略有上升，發(fā)酵14和30 d時含量略高于發(fā)酵7 d時。發(fā)酵飼料中AA含量可以在一定程度上反映飼料的有氧穩(wěn)定性和保存性能[26]，Kaiser等[27]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵飼料中AA含量可以準(zhǔn)確評價發(fā)酵飼料的厭氧穩(wěn)定階段，以3.0% DM的AA含量作為無氧穩(wěn)定性上限，本試驗中各處理不同發(fā)酵時間AA含量均低于3.0% DM，表明發(fā)酵酒糟有氧穩(wěn)定性良好。有研究表明，在發(fā)酵飼料中，PA含量越低，發(fā)酵飼料有氧穩(wěn)定性越好，且一定量的PA可以抑制真菌的繁殖[28]。本試驗中，J處理發(fā)酵7、14 d時PA含量較低，Z處理發(fā)酵7 d時PA含量較低，D處理發(fā)酵14 d時PA含量較低，G處理發(fā)酵14 d時PA含量較高。BA的產(chǎn)生是由于腐敗菌分解蛋白質(zhì)，造成干物質(zhì)的損失，因此在發(fā)酵中，BA含量越低，發(fā)酵品質(zhì)越好[29]。4處理中均未檢測出BA，發(fā)酵品質(zhì)較好，這可能是由于茅臺酒糟初始pH較低，抑制部分有害微生物的繁殖，減少對營養(yǎng)物質(zhì)的消耗。NH3-N主要由梭菌等有害微生物分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生，反映了蛋白質(zhì)的降解程度[8]，隨著發(fā)酵時間的延長，NH3-N含量先上升后下降，這可能是由于發(fā)酵時間延長，有害微生物繁殖降解蛋白質(zhì)的結(jié)果，J處理和Z處理發(fā)酵7和30 d 時NH3-N含量低于發(fā)酵14 d時，D處理發(fā)酵14 d時NH3-N含量最低，G處理發(fā)酵30 d時NH3-N含量低于發(fā)酵7和14 d時。綜合來看，不同發(fā)酵方式的酒糟發(fā)酵品質(zhì)受時間影響較明顯，不同處理在不同的發(fā)酵時間有較好的發(fā)酵品質(zhì)。

3.3 不同儲存方式和發(fā)酵時間對酒糟微生物多樣性的影響

發(fā)酵是復(fù)雜的微生物共生系統(tǒng)，微生物多樣性影響著發(fā)酵品質(zhì)與營養(yǎng)成分[30]。通過16S高通量測序技術(shù)對不同儲存方式茅臺酒糟發(fā)酵微生物群落進(jìn)行分析，由此可知不同的儲存方式和發(fā)酵時間對酒糟發(fā)酵微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。從門水平來看，4種儲存方式優(yōu)勢菌門依次為厚壁菌門、變形菌門。厚壁菌門是一大類細(xì)菌，多為革蘭氏陽性，多數(shù)厚壁菌可產(chǎn)芽孢，抵抗脫水和極端環(huán)境[31]，可以降解纖維、淀粉、蛋白質(zhì)等大分子化合物。變形菌門為革蘭氏陰性菌，包含大腸桿菌、沙門氏菌、幽門螺旋桿菌等多種類病原菌[32]，這些有害微生物會影響酒糟飼料的發(fā)酵品質(zhì)。4種儲存方式發(fā)酵后與鮮酒糟對比來看，發(fā)酵后厚壁菌門相對豐度增加，變形菌門相對豐度下降。這與陶蓮等[33]的研究結(jié)果一致，即青貯前的玉米秸稈中變形菌門和厚壁菌門為優(yōu)勢菌群，青貯后變形菌門菌群數(shù)量顯著降低，厚壁菌門菌群數(shù)量顯著增加。

從屬水平來看，優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬和芽孢桿菌屬，隨著發(fā)酵時間的延長乳桿菌屬相對豐度下降，這可能是由于發(fā)酵時間的延長，酒糟中的復(fù)膜孢子酵母屬、曲霉屬等微生物增多[34]，影響乳桿菌屬的生長，從而降低了乳桿菌屬的相對豐度。芽孢桿菌屬為革蘭氏陽性菌，在發(fā)酵前期會與乳酸菌爭奪WSC，但芽孢桿菌屬能產(chǎn)生分泌木制纖維素生物質(zhì)降解酶，產(chǎn)生糖類物質(zhì)，可供乳酸菌等微生物利用[35]，后期pH下降抑制其繁殖生長，各處理芽孢桿菌屬相對豐度變化略有不同，其中J處理芽孢桿菌屬相對豐度低于其他處理，隨發(fā)酵時間延長無明顯變化；Z處理芽孢桿菌屬相對豐度隨發(fā)酵時間延長略有增加，D處理芽孢桿菌屬相對豐度隨發(fā)酵時間延長先上升后下降，G處理芽孢桿菌屬相對豐度隨發(fā)酵時間延長先下降后上升。假單胞菌為好氧細(xì)菌，在發(fā)酵過程中利用WSC和CP大量繁殖，導(dǎo)致LA和WSC等營養(yǎng)物質(zhì)含量下降，抑制乳酸菌的繁殖，降低飼料的營養(yǎng)品質(zhì)，因此在發(fā)酵過程中要抑制好氧細(xì)菌的繁殖[36]。除J處理發(fā)酵30 d外，其余處理假單胞菌相對豐度均低于CK處理，且隨著發(fā)酵時間的延長假單胞菌相對豐度逐漸下降。綜合微生物多樣性分析，J處理發(fā)酵7 d時乳桿菌屬相對豐度最高(19.62%)，芽孢桿菌屬相對豐度最低(7.67%)；Z處理發(fā)酵7 d時乳桿菌屬相對豐度最高(20.46%)，芽孢桿菌屬相對豐度最低(12.04%)；D處理發(fā)酵7 d時乳桿菌屬相對豐度略高于發(fā)酵14和30 d時；G處理發(fā)酵7和30 d時乳桿菌屬相對豐度高于發(fā)酵14 d時，發(fā)酵7和14 d時芽孢桿菌屬相對豐度較低，但醋菌屬相對豐度較多。

發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對發(fā)酵微生物菌群和發(fā)酵品質(zhì)有顯著影響。通常，代謝產(chǎn)物與發(fā)酵過程中出現(xiàn)的有益微生物呈正相關(guān)，與有害微生物呈負(fù)相關(guān)。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬相對豐度與LA含量呈正相關(guān)，與PA、BA含量呈負(fù)相關(guān)；LA含量與乳桿菌屬、短桿菌屬相對豐度呈正相關(guān)，而假單胞菌屬、叢毛單胞菌屬、黃金桿菌屬相對豐度與pH呈正相關(guān)，這與Guan等[37]研究結(jié)果一致。NH3-N含量與醋菌屬相對豐度呈正相關(guān)，與假單胞菌屬、黃金桿菌屬相對豐度呈負(fù)相關(guān)，這與Dong等[38]研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

綜合營養(yǎng)成分含量、發(fā)酵品質(zhì)和微生物多樣性等指標(biāo)，建議茅臺酒糟青貯窖發(fā)酵時間為7～14 d，自制真空發(fā)酵時間不超過7 d，噸包發(fā)酵時間為14～30 d，罐裝發(fā)酵時間不超過30 d。