添加屎腸球菌、枯草芽孢桿菌及其復(fù)合菌對綿羊生長性能、養(yǎng)分表觀消化率、瘤胃發(fā)酵指標(biāo)和瘤胃微生物區(qū)系的影響

白天天 崔浩然 趙林波 王 彥 郭雪峰,2* 周小玲,2

(1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點實驗室，阿拉爾 843300)

人們長期使用抗生素防治動物疫病和維持畜禽機體健康，使得畜禽出現(xiàn)耐藥病原體和藥物殘留[1]，人們的公共健康受到威脅[2]，在這種情況下，人們迫切尋找合適的益生菌作為抗生素的替代品?！讹暳咸砑觿┢贩N目錄(2013)》允許使用的飼料級微生物菌種包括屎腸球菌(Enterococcusfaecium)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。屎腸球菌與腸道表面黏附形成保護(hù)屏障，是腸道正常優(yōu)勢菌群[3]，產(chǎn)有機酸降低腸道pH[4]，維持菌群平衡[5]，防治動物腸道菌群失調(diào)，用于幼畜的腸道保健[6]?？莶菅挎邨U菌可產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生孢子，為需氧革蘭氏陽性菌[7]。研究表明，添加2×1010CFU/d屎腸球菌可以提高斷奶犢牛瘤胃氨態(tài)氮(NH3-N)、乙酸以及總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)含量，降低瘤胃pH[8]，還可以顯著提高仔豬平均日增重(ADG)[9]，顯著降低料重比(F/G)[10]；飼喂枯草芽孢桿菌可以使?fàn)倥DG和F/G顯著提高[11]。李月明等[12]在體外產(chǎn)氣試驗中發(fā)現(xiàn)，添加2×1010CFU/g枯草芽孢桿菌可以提高產(chǎn)氣量和NH3-N含量，降低pH，提高TVFA含量。程連平等[13]發(fā)現(xiàn)，添加1×1010CFU/g枯草芽孢桿菌可以顯著提高羔羊瘤胃液NH3-N、乙酸、丙酸等含量。飼喂復(fù)合益生菌(枯草芽孢桿菌、糞腸球菌等)可以改善羔羊胃腸道菌群，減少羔羊的腹瀉率[14]；復(fù)合菌制劑(地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和植物乳酸菌)可以提高8周齡犢牛瘤胃中的黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量[15]。本研究將屎腸球菌和枯草芽孢桿菌添加至綿羊飼糧中進(jìn)行單菌以及復(fù)合菌添加，并比較其對綿羊生長性能、養(yǎng)分表觀消化率、瘤胃發(fā)酵指標(biāo)和瘤胃微生物區(qū)系的影響，為微生態(tài)制劑在反芻動物飼料添加劑上的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，為健康綠色畜牧養(yǎng)殖提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

屎腸球菌F11.1G為塔里木大學(xué)畜牧科技重點實驗室篩選菌株，于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏(保藏號：M 2020793)，活菌數(shù)為1×1010CFU/g?？莶菅挎邨U菌購買于某酵母股份有限公司，活菌數(shù)為2×1010CFU/g。菌種發(fā)酵液采用專利(一種屎腸球菌粉劑的制備方法及其應(yīng)用，申請?zhí)枺?10420)制作，配制0.5%乳糖和0.001%檸檬酸發(fā)酵液，高壓后均勻混合，加入5%菌粉，于搖床中37 ℃培養(yǎng)24～36 h備用。根據(jù)白天天等[16]試驗結(jié)果確定屎腸球菌在綿羊體內(nèi)的添加活菌數(shù)為1×1010CFU/mL，根據(jù)孫康等[17]、盧佳偉等[18]和烏日勒格[19]研究確定枯草芽孢桿菌在綿羊體內(nèi)的添加活菌數(shù)為1×1010CFU/mL，通過菌種發(fā)酵液制作及培養(yǎng)后調(diào)整屎腸球菌和枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為1×1010CFU/mL。

1.2 試驗設(shè)計

選取24只體重為(32.7±4.7)kg、安裝瘺管的成年綿羊，隨機分為4組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)1只。4個組分別為CK組(添加10 mL發(fā)酵液)、S組(添加10 mL屎腸球菌發(fā)酵液)、K組(添加10 mL枯草芽孢桿菌發(fā)酵液)和F組(添加5 mL屎腸球菌發(fā)酵液+5 mL枯草芽孢桿菌發(fā)酵液)，于晨飼前與部分精料混合飼喂。

1.3 飼養(yǎng)管理及飼糧

試驗于2021年7月20日至2021年10月5日在塔里木大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院試驗站進(jìn)行。單欄飼養(yǎng)，每日09:00和20:00各飼喂1次(限飼1.2 kg)，自由飲水。預(yù)試期15 d，正試期60 d，正試期分為2期：第1～30天為Ⅰ期和第31～60天為Ⅱ期。參考《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004)[20]并結(jié)合生產(chǎn)實際配制基礎(chǔ)飼糧，滿足綿羊維持水平，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.4 樣品的采集及處理

糞樣、飼糧樣采集：消化試驗采用全收糞法，于第5～12天和第35～42天晨飼前收集糞樣和剩料，稱重備用，選取未污染糞樣加入10%硫酸浸泡，保存于-20 ℃，待試驗結(jié)束后，混合各試驗動物7 d的糞樣，烘干后粉碎過40目篩備用。

瘤胃樣品采集：于第1～3天和第31～33天晨飼后連續(xù)采集0、2、4、6和8 h的瘤胃食糜，進(jìn)行原蟲計數(shù)及pH、NH3-N和VFA含量的測定。于第30天和第60天晨飼前1 h內(nèi)采集瘤胃液，保存于-80 ℃，送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測序。

1.5 指標(biāo)測定

1.5.1 生長性能測定

于試驗第0(試驗開始前1天)、60天晨飼前對所有綿羊進(jìn)行空腹稱重，分別記為初始體重和終末體重。每日飼喂前清理收集剩料并稱重，計算干物質(zhì)采食量(DMI)。

ADG=(終末體重-初始體重)/飼養(yǎng)天數(shù)；F/G=DMI/ADG。

1.5.2 養(yǎng)分表觀消化率測定

飼糧和糞樣中的干物質(zhì)(DM)含量采用干燥法測定；有機物(OM)含量采用灼燒法測定；粗蛋白質(zhì)(CP)含量采用凱氏定氮法測定；酸性洗滌纖維(ADF)和中性洗滌纖維(NDF)含量采用酸堿消煮法測定，具體操作參照《動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)實踐教程》[21]進(jìn)行。養(yǎng)分表觀消化率計算公式如下：

某養(yǎng)分表觀消化率(%)=100×(B-C)/B。

式中：B為飼糧中該養(yǎng)分的含量；C為糞樣中該養(yǎng)分的含量。

1.5.3 瘤胃發(fā)酵指標(biāo)測定

原蟲計數(shù)參照蔣辰宇[22]方法測定；屎腸球菌和枯草芽孢桿菌活力參照郭雪峰等[23]方法測定；pH通過?，斉票銛y式pH測試筆測定；VFA含量采用賽默飛U3000高效液相色譜儀，參照蘇利紅等[24]方法測定；NH3-N含量采用馮宗慈等[25]方法測定。

1.5.4 瘤胃微生物區(qū)系測定

微生物多樣性是基于Illumina NovaSeq測序平臺，利用雙末端測序(paired-end)的方法，構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行測序。通過對Reads拼接過濾，聚類或去噪，并進(jìn)行物種注釋及豐度分析，可以揭示樣品的物種構(gòu)成；進(jìn)一步進(jìn)行α多樣性分析、β多樣性分析、顯著物種差異分析等，挖掘樣品之間的差異。

瘤胃微生物多樣性使用Usearch軟件對Reads在97.0%的相似度水平下進(jìn)行聚類，獲得分類操作單元(OTU)。以SILVA為參考數(shù)據(jù)庫使用樸素貝葉斯分類器對特征序列進(jìn)行分類學(xué)注釋,可得到每個特征對應(yīng)的物種分類信息，進(jìn)而在各水平(界、門、綱、目、科、屬、種)統(tǒng)計各樣品群落組成，利用QIIME軟件生成不同分類水平上的物種豐度表，再利用R語言工具繪制成樣品各分類學(xué)水平下的群落結(jié)構(gòu)圖。使用QIIME2軟件，對樣品α多樣性指數(shù)進(jìn)行評估。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件one-way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加屎腸球菌、枯草芽孢桿菌及其復(fù)合菌對綿羊生長性能和養(yǎng)分表觀消化率的影響

由表2可知，Ⅰ期時，各組間養(yǎng)分消化率無顯著差異(P>0.05)，S組的ADG最高，F(xiàn)組的F/G最高；Ⅱ期時，S組的ADF消化率顯著高于CK組和F組(P<0.05)，其他各組各養(yǎng)分表觀消化率無顯著差異(P>0.05)，K組的ADG最高，S組的F/G最高。

表2 添加屎腸球菌、枯草芽孢桿菌及其復(fù)合菌對綿羊生長性能和養(yǎng)分表觀消化率的影響

2.2 添加屎腸球菌、枯草芽孢桿菌及其復(fù)合菌對綿羊瘤胃發(fā)酵pH的影響

由表3可知，Ⅰ期時，各組pH在各階段均隨時間的增加呈先下降再上升的趨勢，在2～4 h時達(dá)到最低后開始上升；K組和F組的pH始終低于CK組(P>0.05)，在0～2 h和8 h時，S組的pH低于CK組(P>0.05)，在8 h時，S組為最低；Ⅱ期8 h時，CK組pH低于其他各組(P>0.05)。

表3 添加屎腸球菌、枯草芽孢桿菌及其復(fù)合菌對綿羊瘤胃發(fā)酵pH的影響

2.3 添加屎腸球菌、枯草芽孢桿菌及其復(fù)合菌對綿羊瘤胃NH3-N含量的影響

由表4可知，Ⅰ期時，CK組NH3-N含量隨時間的增加呈波動變化，其他各組均呈先下降再上升趨勢，4～6 h時，CK組NH3-N含量高于其他各組(P>0.05)；Ⅱ期時，除K組NH3-N含量隨時間的增加出現(xiàn)波動變化外，其他各組均呈先下降再上升趨勢，4 h時，CK組NH3-N含量高于其他各組，但均差異不顯著(P>0.05)；在各階段，6 h時F組NH3-N含量均為最低。

表4 添加屎腸球菌、枯草芽孢桿菌及其復(fù)合菌對綿羊瘤胃NH3-N含量的影響

2.4 添加屎腸球菌、枯草芽孢桿菌及其復(fù)合菌對綿羊瘤胃VFA含量的影響

由表5可知，各組乙酸含量均隨時間的增加呈先上升后下降的趨勢，Ⅰ期，各時間點各組乙酸含量差異均不顯著(P>0.05)，CK組乙酸含量均為最高；Ⅱ期時，6 h時S組顯著高于K組(P<0.05)，但與其他各組均差異不顯著(P>0.05)。

表5 添加屎腸球菌、枯草芽孢桿菌及其復(fù)合菌對綿羊瘤胃VFA含量的影響

在各時期各組丙酸含量均隨時間的增加呈先上升再下降的趨勢，Ⅰ期時，各組之間丙酸含量無顯著差異(P>0.05)，在Ⅱ期6 h時，S組丙酸含量顯著高于K組(P<0.05)，與CK組相比差異不顯著(P>0.05)，其他時間點各組之間差異不顯著(P>0.05)。

各時期各組丁酸含量均隨時間的增加呈先上升再下降的趨勢，只有F組在Ⅰ期2 h時的丁酸含量低于CK組(P>0.05)，Ⅱ期時，除0 h時S組、K組和6 h時S組、K組的丁酸含量低于CK組(P>0.05)外，其他各組丁酸含量均高于CK組(P>0.05)。

各時期各組戊酸含量隨時間的增加呈先上升再下降的趨勢，除Ⅰ期0 h時S組和4 h時F組的戊酸含量低于CK組(P>0.05)外，其他各組戊酸含量均高于CK組(P>0.05)，Ⅱ期0～4 h時CK組戊酸含量均為最高，6 h時只有F組的戊酸含量高于CK組(P>0.05)，8 h時CK組戊酸含量低于其他各組(P>0.05)。

各時期各組TVFA含量均隨時間的增加呈先上升再下降的趨勢，Ⅰ期時，各組TVFA含量無顯著差異(P>0.05)，在Ⅱ期時，除6 h時K組的TVFA含量顯著低于其他各組(P<0.05)外，其他各時間點各組均差異不顯著(P>0.05)。

Ⅰ期時，隨時間的增加各時期各組乙酸/丙酸呈波動變化，各組各時間點乙酸/丙酸均差異不顯著(P>0.05)，Ⅱ期時，隨時間的增加各組乙酸/丙酸呈先下降再上升趨勢，0 h時，F(xiàn)組的乙酸/丙酸顯著高于CK組(P<0.05)，其他時間點各組均差異不顯著(P>0.05)。

2.5 添加屎腸球菌、枯草芽孢桿菌及其復(fù)合菌對綿羊瘤胃原蟲數(shù)量的影響

由表6可知，各時期各組原蟲數(shù)量隨時間的增加呈波動變化，在Ⅰ期時，CK組的原蟲數(shù)量在4和8 h時高于其他各組(P>0.05)；在Ⅱ期0和8 h時，CK組原蟲數(shù)量低于其他各組(P>0.05)。

表6 添加屎腸球菌、枯草芽孢桿菌及其復(fù)合菌對綿羊瘤胃原蟲數(shù)量的影響

2.6 添加屎腸球菌、枯草芽孢桿菌及其復(fù)合菌對綿羊瘤胃細(xì)菌多樣性指數(shù)的影響

由表7可知，各時期各組之間ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和PD_whole_tree指數(shù)均差異不顯著(P>0.05)。Ⅰ期時，S組的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和PD_whole_tree指數(shù)最高，CK組的Shannon指數(shù)最低，各組Simpson指數(shù)相同；Ⅱ期時，除S組的ACE指數(shù)和PD_whole_tree指數(shù)出現(xiàn)了降低趨勢，S組和F組的Simpson指數(shù)保持穩(wěn)定外，各組各指數(shù)均呈上升趨勢。本試驗樣本覆蓋指數(shù)達(dá)到0.99以上，反映本次測序結(jié)果可以代表瘤胃液中物種的真實情況。

表7 添加屎腸球菌、枯草芽孢桿菌及其復(fù)合菌對綿羊瘤胃細(xì)菌多樣性指數(shù)的影響

2.7 添加屎腸球菌、枯草芽孢桿菌及其復(fù)合菌對綿羊瘤胃細(xì)菌門水平組成的影響

由表8可知，綿羊瘤胃微生物門水平主要由擬桿菌門、厚壁菌門、Kiritimatiellaeota、變形菌門、互養(yǎng)菌門、螺旋體門、藍(lán)藻門、髕骨細(xì)菌門、放線菌門、無壁菌門和一些占比較少的菌門組成。各時期各組瘤胃液樣品中瘤胃細(xì)菌門水平組成存在差異，Ⅰ期時，各組中的擬桿菌門、厚壁菌門、Kiritimatiellaeota和變形菌門占有相對較高豐度，Ⅱ期時，各組中的擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、互養(yǎng)菌門占有相對較高豐度，各期各組之間除疣微菌門外的主要優(yōu)勢菌門相對豐度均無顯著差異(P>0.05)。

表8 添加屎腸球菌、枯草芽孢桿菌及其復(fù)合菌對綿羊瘤胃細(xì)菌門水平組成的影響

2.8 添加屎腸球菌、枯草芽孢桿菌及其復(fù)合菌對綿羊瘤胃細(xì)菌屬水平組成的影響

由表9可知，綿羊瘤胃微生物屬水平主要由普雷沃氏菌屬-1、理研菌科RC9腸道群、普雷沃氏菌科UCG-003、瘤胃球菌科UCG-005、普雷沃氏菌科UCG-001和丹毒絲菌科UCG-004和一些占比較少的菌屬組成。各時期各組瘤胃液樣品中瘤胃細(xì)菌屬水平組成存在差異，各組在各時期共有的優(yōu)勢菌屬為普雷沃氏菌屬-1、理研菌科RC9腸道群、普雷沃氏菌科UCG-003、未分類菌屬-F082、未分類擬桿菌目-RF16群。除Ⅱ期CK組、K組未分類菌屬-F082相對豐度顯著高于S組(P<0.05)外，各時期各組優(yōu)勢菌屬相對豐度均無顯著差異(P>0.05)。

表9 添加屎腸球菌、枯草芽孢桿菌及其復(fù)合菌對綿羊瘤胃細(xì)菌屬水平組成的影響

3 討 論

3.1 添加屎腸球菌、枯草芽孢桿菌及其復(fù)合菌對綿羊生長性能和養(yǎng)分表觀消化率的影響

乳酸菌利用飼料中的碳水化合物分解產(chǎn)生乳酸，乳酸利用菌可將乳酸降解為乙酸、丙酸等，提高了飼料的利用率。在Ⅰ期時發(fā)現(xiàn)，添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌可以提高綿羊ADG，與王建國等[26]在飼糧中添加微生態(tài)制劑(芽胞桿菌、乳酸菌和酵母菌等)后的結(jié)果相同，添加枯草芽孢桿菌后降低了DM攝入量和ADF攝入量，這可能是因為枯草芽孢桿菌的芽孢代謝產(chǎn)物中含有多肽類抗菌物質(zhì)[27]，綿羊采食后瘤胃內(nèi)出現(xiàn)的多肽類抗菌物質(zhì)破壞了瘤胃內(nèi)微生物平衡，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的利用過程受到影響，但可能因枯草芽孢桿菌菌種來源不同，使得營養(yǎng)物質(zhì)的利用率存在差異[28]，添加量過高也可能會影響?zhàn)B分降解率[29]。在Ⅱ期時發(fā)現(xiàn)，添加屎腸球菌后可以顯著提高ADF表觀消化率，與添加復(fù)合菌(乳酸菌、芽孢桿菌和雙歧桿菌)至青海細(xì)毛羊飼糧中[30]和飼喂荷斯坦奶牛地衣芽孢桿菌后[31]的結(jié)果一致；在本試驗中，添加屎腸球菌提高了綿羊養(yǎng)分的攝入量和消化率，但未達(dá)到顯著水平，在Ⅱ期時效果較好，我們猜測外源添加的菌株在剛進(jìn)入瘤胃內(nèi)環(huán)境時與瘤胃微生物有互作作用，在Ⅱ期屎腸球菌和瘤胃內(nèi)微生物達(dá)成了穩(wěn)定，可能與瘤胃中某一菌群的變化有關(guān)，具體原因需要進(jìn)一步的研究。本研究中各組ADG均較低，可能是因為本試驗中試驗動物為成年瘺管羊，飼糧設(shè)計為維持水平，且試驗在夏天進(jìn)行，天氣炎熱，因此綿羊增重較慢，從而使綿羊F/G偏高。

3.2 添加屎腸球菌、枯草芽孢桿菌及其復(fù)合菌對綿羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

瘤胃pH的變化受多種因素的影響，可以衡量瘤胃內(nèi)環(huán)境變化。瘤胃pH的變化可以影響瘤胃微生物對底物的利用效率，人們認(rèn)為瘤胃微生物pH在5.7以上時，生長速度最快[32]，也有人認(rèn)為瘤胃pH變化范圍一般在5.5～7.5[8]，本試驗中pH范圍在5.98～6.78，可見各時期各組各時間點的pH均在5.7以上，在正常范圍之內(nèi)，可知添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌會降低瘤胃pH，但并不會影響瘤胃微生物的正常生長。在Ⅰ期綿羊攝入菌劑后發(fā)現(xiàn)pH開始下降，在4 h達(dá)到最低，這可能與屎腸球菌進(jìn)入瘤胃后可迅速產(chǎn)生乳酸[33]，枯草芽孢桿菌發(fā)酵瘤胃內(nèi)飼料產(chǎn)生有機酸，限飼使得食糜在瘤胃內(nèi)滯留，綿羊多次反芻增加食糜中碳水化合物在瘤胃中降解的比例，致使產(chǎn)酸量升高有關(guān)，這與TVFA含量在同時間段的升高相吻合，而在Ⅱ期則沒有這種變化，可能使瘤胃內(nèi)微生物適應(yīng)了屎腸球菌和枯草芽孢桿菌進(jìn)入瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的影響，達(dá)到了穩(wěn)定。在本試驗中，Ⅰ期0～2 h和8 h時，添加屎腸球菌后瘤胃pH出現(xiàn)下降，與丙酸桿菌、植物乳桿菌及其復(fù)合益生菌劑添加至公牛飼糧的結(jié)果[34]一致。

NH3-N是反映瘤胃氮代謝水平的重要指標(biāo)，通過測定瘤胃中氨氮濃度可以間接反映瘤胃微生物分解飼糧粗蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨氮和利用氨氮合成微生物體蛋白的平衡情況[35]。在本試驗中，添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌在0～2 h會提高瘤胃中的瘤胃液中NH3-N含量，蘇勇華等[36]在多浪羊中添加枯草芽孢桿菌也得到了同樣的結(jié)論。在4 h時，各組NH3-N含量最低，這可能是因為瘤胃微生物迅速利用氨合成微生物蛋白，同時與天氣炎熱，綿羊飲水量增加，瘤胃液被稀釋有關(guān)。NH3-N含量過低時會影響合成微生物蛋白，過高表明氨的利用率較低，造成氨的損失。在8 h，S組和K組的NH3-N含量高于對照組，可能與瘤胃內(nèi)可快速利用的能源耗盡，影響微生物對NH3-N的利用效率，因而導(dǎo)致其含量上升有關(guān)。

瘤胃VFA包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸等，有95%的VFA可被利用進(jìn)行氧化供能或合成脂肪[37]。丁酸可合成中、短鏈脂肪酸，刺激瘤胃上皮發(fā)育，促進(jìn)養(yǎng)分的消化吸收[38]，丙酸是肝臟中產(chǎn)生葡萄糖的主要前體物質(zhì)。在本試驗中，添加屎腸球菌后發(fā)現(xiàn)丁酸、戊酸、TVFA含量和乙酸/丙酸有所提高，VFA含量增加的原因可能是因為屎腸球菌能夠改善瘤胃發(fā)酵，促進(jìn)碳水化合物在瘤胃中的降解[39]，添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌后發(fā)現(xiàn)乙酸/丙酸降低，使得瘤胃發(fā)酵類型轉(zhuǎn)變?yōu)楸嵝?，與丁洪濤等[40]研究結(jié)果一致；復(fù)合菌劑組提高了乙酸/丙酸，這可能是因為復(fù)合菌劑組中的屎腸球菌和枯草芽孢桿菌之間可能有競爭作用，使復(fù)合菌組的瘤胃發(fā)酵趨向乙酸型發(fā)酵。由此可見，添加益生菌可通過改變瘤胃發(fā)酵類型，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵。

3.3 添加屎腸球菌、枯草芽孢桿菌及其復(fù)合菌對綿羊瘤胃微生物區(qū)系的影響

瘤胃是反芻動物重要的消化場所，瘤胃微生物組成和結(jié)構(gòu)影響著瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收[41]。原蟲占反芻動物瘤胃微生物體積的30%～80%[42]，不僅可以促進(jìn)纖維和淀粉等轉(zhuǎn)化成VFA，還具有吞噬細(xì)菌，減緩碳水化合物的發(fā)酵速度，增加甲烷產(chǎn)量的負(fù)面作用[43]，因此，原蟲數(shù)量應(yīng)在一個適宜的范圍。每毫升瘤胃內(nèi)容物中的原蟲數(shù)量一般為105～107個[44]。本試驗中的原蟲范圍在1.22×106～3.05×106個/mL，可見屎腸球菌和枯草芽孢桿菌并不會對瘤胃內(nèi)原蟲數(shù)量產(chǎn)生不良影響。Ⅰ期時，添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌并未對瘤胃內(nèi)的原蟲數(shù)量產(chǎn)生影響。Ⅱ期時，發(fā)現(xiàn)添加枯草芽孢桿菌后原蟲數(shù)量出現(xiàn)降低，可能是因為后期枯草芽孢桿菌在瘤胃穩(wěn)定增殖，間接影響了原蟲發(fā)酵碳水化合物的作用，進(jìn)而抑制了原蟲的生長，8 h時瘤胃內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣耗盡，枯草芽孢桿菌活力降低，原蟲數(shù)量又出現(xiàn)上升趨勢。

在本試驗中，添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌后ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和PD_whole_tree指數(shù)并未出現(xiàn)顯著差異，Ⅰ期時，添加屎腸球菌發(fā)現(xiàn)ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)出現(xiàn)了上升，說明屎腸球菌組的菌群豐富度增加了；K組和F組的Shannon指數(shù)在2個時期均出現(xiàn)了上升，這種現(xiàn)象可能是因為益生菌劑的攝入使其在瘤胃內(nèi)大量增殖，對綿羊瘤胃微生物菌群豐度產(chǎn)生了影響，這與劉宇陽[45]的研究結(jié)果一致。

反芻動物瘤胃中擬桿菌門具有降解飼料中蛋白質(zhì)、多糖和碳水化合物的作用，而厚壁菌門則能促使纖維降解，從而提高纖維物質(zhì)利用率[46]。而變形菌門主要為革蘭氏陰性菌，包含多種致病菌，如大腸桿菌、幽門螺桿菌、沙門氏菌等[47]，其含量高于19%時標(biāo)志著微生物群落不穩(wěn)定[48]。在本試驗中，各組綿羊瘤胃中的優(yōu)勢菌門為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門等，與吳璞等[49]的小尾寒羊的瘤胃優(yōu)勢菌門相同；添加屎腸球菌發(fā)現(xiàn)提高了疣微菌門的相對豐度，添加益生菌劑增加了擬桿菌門的相對豐度，降低了變形菌門的相對豐度，與陳相如[50]在斷奶羔羊的飼糧中添加復(fù)合益生菌(枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌等)對菌門的影響一致；本試驗中變形菌門的占比都在5.48%以下，所以添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌對瘤胃菌門無負(fù)面影響，且不影響瘤胃菌群穩(wěn)定。

普雷沃氏菌屬可以降解纖維素、半纖維素、蛋白質(zhì)和淀粉等[51]，理研菌科RC9腸道群可以有效降解可溶性多糖和不溶性纖維素[52]，理研菌科菌屬對維護(hù)腸道健康有重要作用[53]。解琥珀酸菌屬能分解纖維素或纖維二糖為琥珀酸、乙酸和二氧化碳等[54]。各時期添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌后的瘤胃菌屬共同為普雷沃氏菌屬-1、理研菌科RC9腸道群、普雷沃氏菌科UCG-003等，各菌屬相對豐度均在5%以上。Ⅰ期時，添加枯草芽孢桿菌后纖維桿菌門相對豐度上升，F(xiàn)組降低了普雷沃氏菌科UCG-003的相對豐度，Ⅱ期時，各組中奎因氏菌屬和解琥珀桿菌屬占有相對較高豐度。這說明添加屎腸球菌和枯草芽孢桿菌及其復(fù)合菌劑可以促進(jìn)纖維的降解，而二者的復(fù)合菌劑則不利于營養(yǎng)物質(zhì)消化，可能是菌劑之間的交互作用所致。Ⅱ期時，添加屎腸球菌后未分類菌屬-F082的相對豐度下降，與蘆巖[55]添加乳酸菌和酵母菌混合菌液進(jìn)行棉桿和甜菜渣青貯的體外發(fā)酵試驗后的微生物區(qū)系分析一致，屎腸球菌可能會對其產(chǎn)生影響。

4 結(jié) 論

綜上所述，添加60 d屎腸球菌可以提高綿羊ADF表觀消化率，降低瘤胃中未分類菌屬-F082相對豐度；添加60 d枯草芽孢桿菌會降低瘤胃中乙酸、丙酸和TVFA含量；添加60 d復(fù)合益生菌劑降低了瘤胃中乙酸/丙酸。因此，屎腸球菌可以促進(jìn)綿羊?qū)I養(yǎng)物質(zhì)的利用，調(diào)節(jié)綿羊瘤胃微生物區(qū)系菌門或菌屬的相對豐度，負(fù)面作用較少。因此，屎腸球菌和枯草芽孢桿菌可作為微生態(tài)制劑飼料添加劑，應(yīng)用于反芻動物健康綠色畜牧養(yǎng)殖中。