生化黃腐酸對(duì)仙居雞生產(chǎn)性能、屠宰性能、血清生化指標(biāo)、腸道消化酶活性以及盲腸微生物菌群和代謝組的影響

馮佩詩(shī) 揭曉瀘 葉 軒 田 勇 盧立志* 王 平*

(1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，杭州 310014；2.浙江省仙居種雞場(chǎng)，仙居 311719；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021)

蛋雞在產(chǎn)蛋后期由于生理機(jī)能的衰退，疾病抵抗力的下降，容易受病原微生物的侵襲而發(fā)生疾病。傳統(tǒng)上，會(huì)在畜禽飼糧中加入亞治療水平的抗生素以促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)和預(yù)防疾病。然而，抗生素的使用是一把雙刃劍，其過(guò)量使用和濫用容易造成細(xì)菌耐藥性的提高。故自2020年1月始，我國(guó)開(kāi)始全面禁用飼用抗生素。因此，亟需開(kāi)發(fā)一種綠色、安全、有效的飼用抗生素替代品來(lái)保障畜禽生產(chǎn)。

生化黃腐酸(biochemical fulvic acid，BFA)是腐植酸的一種，是通過(guò)人工模擬自然界腐植酸的形成過(guò)程，以秸稈、糖蜜等為主要原料，通過(guò)特定的微生物發(fā)酵產(chǎn)生的一類含有多種活性基團(tuán)的有機(jī)化合物[1-2]。近年研究指出，在奶牛和肉牛飼糧中添加適量的BFA可增加奶牛產(chǎn)奶量，提高機(jī)體免疫能力和抗應(yīng)激能力，降低飼養(yǎng)場(chǎng)的氨排放量[3]。另外，BFA可提高小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)、碳粒廓清指數(shù)和血細(xì)胞凝集效價(jià)，促進(jìn)機(jī)體非特異性免疫[4]。陸秀玉[5]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.03%的BFA可提高肉仔雞的平均日增重(ADG)，降低料重比(F/G)，促進(jìn)肉仔雞的生長(zhǎng)。但是，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于BFA用作飼料添加劑的適宜劑量和研究結(jié)論存在較大的爭(zhēng)議。因此，本試驗(yàn)以仙居雞為研究對(duì)象，研究不同劑量的BFA對(duì)仙居雞生產(chǎn)性能、屠宰性能、血清生化指標(biāo)、腸道消化酶活性以及盲腸微生物菌群和代謝組的影響，以期為BFA在家禽生產(chǎn)上的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用BFA為棕黃色粉末狀，為河北某科技有限公司產(chǎn)品，純度為99%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用平均體重為(1.83±0.33)kg、524日齡健康的仙居母雞240羽，由浙江省仙居種雞場(chǎng)提供。試驗(yàn)雞隨機(jī)分為4組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10羽。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加500(BFA500組)、1 000(BFA1000組)、1 500 mg/kg(BFA1500組)的BFA。在參考NRC(1994)和《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)的基礎(chǔ)上配制基礎(chǔ)飼糧，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。預(yù)試期3 d，正試期42 d。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在浙江省仙居種雞場(chǎng)進(jìn)行，雞舍為磚混結(jié)構(gòu)，采用3層籠養(yǎng)，自然光照加人工光照，光照制度為18 h光照:6 h黑暗，相對(duì)濕度為55%～65%。試驗(yàn)雞自由采食和飲水，按照常規(guī)方法進(jìn)行飼養(yǎng)管理。

1.4 樣品采集

試驗(yàn)第42天，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選擇接近平均體重的2只試驗(yàn)雞，使用不含抗凝劑的采血管從頸靜脈采血10 mL，經(jīng)靜置2 h后，3 000 r/min離心10 min，收集血清后分裝于離心管中，-20 ℃保存，用于后續(xù)血清生化指標(biāo)測(cè)定。放血致死后，1只試驗(yàn)雞用于測(cè)定屠宰性能指標(biāo)，另1只試驗(yàn)雞分別收集十二指腸、空腸、回腸和盲腸內(nèi)容物，液氮速凍后，-80 ℃保存，用于后續(xù)腸道消化酶活性以及盲腸微生物菌群和代謝組測(cè)定。

1.5 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.5.1 生產(chǎn)性能測(cè)定

每天觀察雞的生長(zhǎng)發(fā)育、發(fā)病及死亡情況，準(zhǔn)確記錄產(chǎn)蛋總數(shù)、蛋重、死淘數(shù)和采食量。于試驗(yàn)第41天的21:00禁食，次日08:00以重復(fù)為單位稱重，計(jì)算平均日采食量(ADFI)、ADG、F/G、產(chǎn)蛋率和料蛋比。

1.5.2 屠宰性能測(cè)定

參照《家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語(yǔ)和度量統(tǒng)計(jì)方法》(NY/T 823—2020)測(cè)定活重、屠體重、半凈膛重、全凈膛重、兩側(cè)胸肌重、兩側(cè)腿肌重、腹脂重和脾臟重，計(jì)算屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、胸肌率、腿肌率和腹脂率，計(jì)算公式如下：

屠宰率(%)=(屠體重/活重)×100；半凈膛率(%)=(半凈膛重/活重)×100；全凈膛重(%)=(全凈膛重/活重)×100；胸肌率(%)=(兩側(cè)胸肌重/全凈膛重)×100；腿肌率(%)=(兩側(cè)腿肌重/全凈膛重)×100；腹脂率(%)=[腹脂重/(全凈膛重+腹脂重)]×100。

1.5.3 血清生化指標(biāo)測(cè)定

血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性和總蛋白(TP)、尿酸(UA)含量采用寧波美康生物科技股份公司試劑盒，使用全自動(dòng)生化分析儀(HITACHI-7020，日本)測(cè)定，測(cè)定方法分別為丙氨酸底物法、天門冬氨酸底物法、雙縮脲法和脲酶-谷氨酸脫氫法。

血清白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(上海赫澎生物科技有限公司)測(cè)定，并按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.5.4 腸道消化酶活性測(cè)定

采集后的腸道內(nèi)容物于低溫下稱取0.1 g，使用試劑盒(南京建成生物工程研究所)分別測(cè)定糜蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶活性，并按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.5.5 盲腸微生物菌群測(cè)定

對(duì)照組和BFA150組的盲腸微生物總DNA使用E.Z.N.A.?糞便DNA試劑盒(D4015，Omega公司，美國(guó))提取。所提取的總DNA由上海美吉生物有限公司使用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)細(xì)菌16S rDNA V3～V4可變區(qū)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序平臺(tái)為Illumina NovaSeq PE250，原始數(shù)據(jù)(raw reads)經(jīng)拼接、質(zhì)控和過(guò)濾后，使用美吉生物云平臺(tái)(https：//cloud.majorbio.com)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5.6 盲腸代謝組測(cè)定

對(duì)照組和BFA150組的盲腸內(nèi)容物的制備、代謝物鑒定和定量由上海美吉生物有限公司測(cè)定，儀器平臺(tái)為AB SCIEX公司的超高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)。原始數(shù)據(jù)經(jīng)去噪平滑、基線校正、重疊識(shí)別獲得的數(shù)據(jù)矩陣用80%規(guī)則來(lái)去除缺失值，再進(jìn)行填補(bǔ)空缺值，用總和歸一化法對(duì)樣本質(zhì)譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行歸一化，同時(shí)刪除質(zhì)量控制(QC)樣本相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)>30%的變量，并進(jìn)行l(wèi)og10對(duì)數(shù)化處理，得到最終用于后續(xù)分析的數(shù)據(jù)矩陣。同時(shí)將質(zhì)譜信息與代謝公共數(shù)據(jù)庫(kù)HMDB(http：//www.hmdb.ca/)和Metlin(https：//metlin.scripps.edu/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配，得到代謝物信息。預(yù)處理后的數(shù)據(jù)上傳美吉生物云平臺(tái)(https：//cloud.majorbio.com)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2019初步整理后，用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Scheffe法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BFA對(duì)仙居雞生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，飼糧中添加BFA對(duì)仙居雞的ADG、ADFI、F/G、產(chǎn)蛋率和料蛋比無(wú)顯著影響(P>0.05)。但是，隨著飼糧中BFA添加量的提高，ADG有所提高，而F/G有所降低。

表2 BFA對(duì)仙居雞生產(chǎn)性能的影響

2.2 BFA對(duì)仙居雞屠宰性能的影響

由表3可知，飼糧中添加BFA對(duì)仙居雞的半凈膛率、全凈膛率、胸肌率、腿肌率、腹脂率和脾臟重?zé)o顯著影響(P>0.05)。BFA1000組的屠宰率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

表3 BFA對(duì)仙居雞屠宰性能的影響

2.3 BFA對(duì)仙居雞血清生化指標(biāo)和細(xì)胞因子含量的影響

由表4可知，飼糧中添加BFA對(duì)血清ALT、AST活性和TP、UA含量無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表4 BFA對(duì)仙居雞血清生化指標(biāo)的影響

由表5可知，BFA500組、BFA1000組和BFA1500組的血清TNF-α含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。BFA500組的血清IL-6含量顯著低于BFA1500組(P<0.05)，但與其余2組無(wú)顯著差異(P>0.05)。飼糧中添加BFA對(duì)血清IL-2和IL-10含量無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表5 BFA對(duì)仙居雞血清細(xì)胞因子含量的影響

2.4 BFA對(duì)仙居雞腸道消化酶活性的影響

由圖1可知，飼糧中添加BFA對(duì)十二指腸、空腸、回腸消化酶活性的影響有一定差異。在十二指腸，BFA500組、BFA1000組和BFA1500組的糜蛋白酶活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；飼糧中添加BFA對(duì)胰蛋白酶和淀粉酶活性無(wú)顯著影響(P>0.05)。在空腸，BFA500組、BFA1000組和BFA1500組的糜蛋白酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，飼糧中添加BFA對(duì)胰蛋白酶和淀粉酶活性無(wú)顯著影響(P>0.05)。在回腸，BFA1000組的糜蛋白酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，BFA500的淀粉酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，BFA500組、BFA1000組和BFA1500組的胰蛋白酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 BFA對(duì)仙居雞盲腸微生物菌群的影響

2.5.1 BFA對(duì)盲腸微生物群落豐富度和多樣性的影響

Illumina NovaSeq PE250高通量測(cè)序結(jié)果表明，從對(duì)照組和BFA1500組盲腸內(nèi)容物樣本中共獲得1 210 413條clean reads，平均每個(gè)樣品121 041條clean reads，平均序列長(zhǎng)度為420 bp。由表6可知，α-多樣性結(jié)果顯示，對(duì)照組和BFA150組的Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannoneven指數(shù)、Simpsoneven指數(shù)和覆蓋率無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表6 BFA對(duì)仙居雞盲腸微生物α-多樣性的影響

2.5.2 BFA對(duì)盲腸微生物菌群組成及結(jié)構(gòu)的影響

基于97%相似度進(jìn)行操作分類單位(OTU)聚類，共獲得4 243個(gè)OTU，其中對(duì)照組獨(dú)有的OTU數(shù)量為1 174個(gè)，BFA150組獨(dú)有的OTU數(shù)量為1 156個(gè)(圖2-A)。采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU序列進(jìn)行分類學(xué)分析，在門水平上共鑒定出20個(gè)菌門，并且以厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和脫硫桿菌門等為優(yōu)勢(shì)菌門(圖2-B)。在屬水平上共鑒定出229個(gè)菌屬，其中優(yōu)勢(shì)菌屬為擬桿菌屬、乳桿菌屬、理研菌科RC9腸道群和考拉桿菌屬等(圖2-C)。

Control、CON：對(duì)照組 control group；BFA：BF150組 BF150 group。下圖同 the same as below。

2.5.3 微生物富集差異

進(jìn)一步用LEfSe并以線性判別分析(LDA)值>2為閾值分析了對(duì)照組和BFA150組之間的微生物富集差異。由圖3可知，在屬水平上，對(duì)照組中富集的生物標(biāo)記物為腸球菌屬、草酸桿菌屬、奇異菌屬；BFA1500組富集的生物標(biāo)記物為罕見(jiàn)小球菌屬、Catenibacillus、蛋白胨鏈球菌科未知屬和毛螺菌科-UCG-002(圖3)。

g_Enterococcus：腸球菌屬；g_Oxalobacter：草酸桿菌屬；g_Atopobium：奇異菌屬；g_Subdoligranulum：罕見(jiàn)小球菌屬；g_Lachnospiraceae_UCG-002：毛螺菌科-UCG-002；g_norank_f_Peptococcaceae：蛋白胨鏈球菌科未知屬。

2.6 BFA對(duì)仙居雞盲腸代謝組的影響

2.6.1 差異代謝物的篩選與鑒定

為了研究BFA對(duì)盲腸微生物代謝的影響，我們利用非靶向代謝組學(xué)同時(shí)檢測(cè)分析了盲腸內(nèi)容物的小分子代謝物。由圖4可知，與對(duì)照組相比，在BFA1500組共檢測(cè)到了1 586個(gè)差異離子峰，并篩選出27種差異代謝物[變量重要性投影(VIP)>2且P<0.05]。在這些差異代謝物中，16種被下調(diào)，11種被上調(diào)。其中，得分最高的前5種代謝物為磷脂酰乙醇胺PE[14∶1(9Z)/16∶1(9Z)](VIP=4.278 5)、硫代硫酸鹽(VIP=3.388 3)、蕨素E(VIP=3.386 6)、咖啡因(VIP=3.373 0)和單取代基甘油糖脂MG(0∶0/16∶0/0∶0)(VIP=3.169 3)。

5-hexenyl glucosinolate：5-己烯基硫苷；6’-hydroxyenterolactone：6-羥基腸內(nèi)酯；Ganoderenic acid C：靈芝烯酸C；Pterosin E：蕨素E；1,2,3,4,5,6,-hexahydro-7H-cyclopenta[b]pyridine-7-one：1,2,3,4,5,6-六氫-7H-環(huán)戊并[b]吡啶-7-酮；MG(0∶0/16∶0/0∶0)：?jiǎn)稳〈视吞侵琈G(0∶0/16∶0/0∶0)；(2E,4Z,7Z)-2,4,7-tridecatrienal：(E,Z,Z)-2,4,7-十三碳三烯醛；Shikimic acid：莽草酸；Ascorbalamic acid：阿斯考巴拉酸；(-)-stercobilin：糞膽色素；(S)-3-mercaptohexyl pentanoate：3-巰基己醇戊酸酯；Undecanoic acid：十一酸；[3-(7-hydroxy-4-oxo-4H-chromen-2-yl)phenyl]oxidanesulfonic acid：[3-(7-羥基-4-氧代-4H-鉻-2-基)苯基]烷氧磺酸；Docosanamide：二十二酰胺；Stearoylethanolamide：硬脂酸單乙醇酰胺；5beta-cholanic acid-3alpha：去氧膽酸；12alpha-diol N-(2-sulphoethyl)-amide：甘氨去氧膽酸；Sucrose：蔗糖；Triethylamine：三乙胺；D-(+)-cellobiose：D-(+)-纖維二糖；Thiosulfate：硫代硫酸鹽；PE[14∶1(9Z)/16∶1(9Z)]：磷脂酰乙醇胺PE[14∶1(9Z)/16∶1(9Z)]；Caffeine：咖啡因。

由圖5可知，利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異代謝物進(jìn)行注釋，共獲得8個(gè)差異的代謝通路，分別為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，咖啡因代謝，碳水化合物的消化和吸收，味覺(jué)傳導(dǎo)，硫代謝，半乳糖代謝，植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成以及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

Tropane, piperidine and pyridine alkaloid biosynthesis：托烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成；Taste transduction：味覺(jué)傳導(dǎo)；Sulfur metabolism：硫代謝；Steroid hormone biosynthesis：類固醇激素生物合成；Starch and sucrose metabolism：淀粉和蔗糖代謝；Phosphotransferase system(PTS)：磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)；Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；Lysine degradation：賴氨酸降解；Galactose metabolism：半乳糖代謝；Carbohydrate digestion and absorption：碳水化合物的消化和吸收；Caffeine metabolism：咖啡因代謝；Biosynthesis of plant secondary metabolites：植物次生代謝物的生物合成；Biosynthesis of plant hormones：植物激素的生物合成；Biosynthesis of phenylpropanoids：苯丙烷生物合成；Biosynthesis of alkaloids derived from shikimate pathway：莽草類生物堿的生物合成；Biosynthesis of alkaloids derived from ornithine, lysine and nicotinic acid：鳥(niǎo)氨酸、賴氨酸和煙酸生物堿的生物合成；Biosynthesis of alkaloids derived from histidine and purine：組氨酸和嘌呤類生物堿的生物合成；Aminobenzoate degradation：氨基苯甲酸酯降解；ABC transporters：ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

2.6.2 代謝物組成與微生物群落組成的相關(guān)性分析

將樣品中相對(duì)豐度前20的菌屬與上述VIP前20的差異代謝物進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，罕見(jiàn)小球菌屬與蕨素E、單取代基甘油糖脂MG(0∶0/16∶0/0∶0)、(E,Z,Z)-2,4,7-十三碳三烯醛、莽草酸、靈芝烯酸C、Vignatic acid B呈負(fù)相關(guān)，而與硬脂?；掖减０?、二十二酰胺、D-(+)-纖維二糖、三乙胺、咖啡因、磷脂酰乙醇胺PE(14∶1(9Z)/16∶1(9Z))、蜜二糖和脫氧膽酸呈正相關(guān)。此外，考拉桿菌屬恰好相反，與蕨素E、單取代基甘油糖脂MG(0∶0/16∶0/0∶0)、Vignatic acid B和Mammea A/AB呈正相關(guān)，而與二十二酰胺、D-(+)-纖維二糖、蔗糖、三乙胺、磷脂酰乙醇胺PE[14∶1(9Z)/16∶1(9Z)]和蜜二糖呈負(fù)相關(guān)。

3 討 論

3.1 BFA對(duì)仙居雞生產(chǎn)性能和屠宰性能的影響

飼料成本通常占家禽養(yǎng)殖成本的70%以上，因此，F(xiàn)/G是衡量效益的重要指標(biāo)，F(xiàn)/G越小，利潤(rùn)越高。眾多研究表明，BFA具有改善家禽的生產(chǎn)性能、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和降低死亡率等作用。陸秀玉[4]研究指出，飼糧中添加0.03%的BFA可顯著提高肉仔雞的ADG。李素芬等[5]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.5%～1.0%的BFA可提高肉仔雞的ADG，改善飼料報(bào)酬和經(jīng)濟(jì)效益。這可能與BFA改變?nèi)怆u腸道黏膜形態(tài)，增加絨毛高度，從而提高飼料的消化和吸收有關(guān)[6]。在本試驗(yàn)中，雖然飼糧中添加BFA可改善仙居雞的ADG和F/G，但是未達(dá)到顯著水平。這可能與試驗(yàn)所選擇的仙居雞處于產(chǎn)蛋后期，生長(zhǎng)速度放慢有關(guān)[7]。

屠宰率和全凈膛率是衡量家禽產(chǎn)肉性能的重要指標(biāo)，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，雖然BFA1000和BFA1500組的屠宰率分別為90.27%和90.67%，低于對(duì)照組的92.84%，但是在全凈膛率上，各組均達(dá)68%以上，組間無(wú)顯著差異。屠宰性能結(jié)果與黃玲玲[8]研究結(jié)果相當(dāng)，表明BFA對(duì)屠宰性能無(wú)明顯影響。

3.2 BFA對(duì)仙居雞血清生化指標(biāo)和細(xì)胞因子含量的影響

血清生化指標(biāo)是反映動(dòng)物健康狀況的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)測(cè)定了仙居雞的血清AST、ALT活性和TP、UA含量，各組之間血清生化指標(biāo)無(wú)顯著差異，表明飼糧中添加BFA對(duì)血清生化指標(biāo)無(wú)負(fù)面影響。

IL-2和IL-10是免疫網(wǎng)絡(luò)中重要的調(diào)節(jié)因子，它們?cè)诳垢腥竞投糁蒲装Y反應(yīng)上發(fā)揮重要的作用[9-10]。TNF-α和IL-6則是促炎反應(yīng)中重要的細(xì)胞因子，它們可與其他免疫細(xì)胞結(jié)合以維持慢性炎癥[11]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧中添加BFA可在一定程度上提高仙居雞血清IL-2含量，并且降低血清IL-6和TNF-α含量，提示BFA可通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥因子水平從而增強(qiáng)仙居雞的細(xì)胞免疫功能。Liu等[12]的研究結(jié)果也表明，BFA可顯著降低大鼠中性粒細(xì)胞、白細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)量，顯著提高血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)和IL-2含量，從而增強(qiáng)機(jī)體防御能力和免疫水平。另外，BFA可提高小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力，對(duì)機(jī)體的非特異性免疫有一定的促進(jìn)作用[13]。BFA對(duì)畜禽免疫功能具有積極影響，表明其具有作為功能性飼料添加劑改善畜禽健康的價(jià)值。

3.3 BFA對(duì)仙居雞腸道消化酶活性的影響

消化酶是飼料消化吸收的媒介，其活性是反映機(jī)體消化能力的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，空腸中糜蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶活性均高于十二指腸或回腸，可見(jiàn)空腸是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的主要場(chǎng)所[14]。研究顯示，BFA是一種安全的促生長(zhǎng)添加劑，可通過(guò)提高腸道消化活性增強(qiáng)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，從而提高生產(chǎn)性能[15]。在本試驗(yàn)中，飼糧中添加BFA可提高空腸糜蛋白活性和回腸糜蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶活性，這與侯少巖等[16]、朱榮生等[17]研究結(jié)果一致。烏蘭等[18]報(bào)道，飼料中添加0.30%的黃腐酸有助于提高鯽魚的肝胰臟蛋白質(zhì)酶、淀粉酶和腸道淀粉酶活性。由于BFA本身不含有消化酶，但可在一定程度上提高腸道消化酶活性，提示BFA可能刺激腸道消化酶的分泌，或者刺激內(nèi)源消化酶的合成，但具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

3.4 BFA對(duì)仙居雞盲腸微生物菌群和代謝組的影響

罕見(jiàn)小球菌屬是近年來(lái)在人類排泄物中新分離的嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陰性菌，呈多樣性的球菌形態(tài)[19]。罕見(jiàn)小球菌屬?gòu)V泛存在于健康成人腸道內(nèi)，并與腸道通透性息息相關(guān)[20]。研究指出，罕見(jiàn)小球菌屬可通過(guò)發(fā)酵反應(yīng)產(chǎn)生丁酸、乳酸以及微量的乙酸和琥珀酸[19]，這些短鏈脂肪酸是腸上皮細(xì)胞的主要能量來(lái)源，參與維持腸道黏膜屏障、調(diào)節(jié)腸道炎癥以及增加胃腸動(dòng)力等[21]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加BFA可增加仙居雞盲腸罕見(jiàn)小球菌屬相對(duì)豐度，并且罕見(jiàn)小球菌屬與甘氨去氧膽酸呈顯著正相關(guān)。目前已知只有極少數(shù)低相對(duì)豐度的菌屬能夠進(jìn)行次級(jí)膽汁酸代謝[22]。這提示BFA可能通過(guò)提高罕見(jiàn)小球菌屬相對(duì)豐度，增加腸道短鏈脂肪酸和次級(jí)膽汁酸含量，進(jìn)而影響機(jī)體的能量和脂肪代謝。

Catenibacillus和毛螺菌科-UGG-002是在BFA組富集的2個(gè)屬于毛羅桿菌科的菌屬。其中，Catenibacillus是一種嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陽(yáng)性菌，主要以鏈狀出現(xiàn)[23]。研究指出，Catenibacillus不但可將葛根素去糖基化為大豆黃酮，還參與其他芳香族C-葡萄糖苷和類黃酮O-葡萄糖苷的去糖基化[24]；其代謝產(chǎn)物原兒茶酸、3,4-二羥基苯乙酸和3,4-二羥基苯基丙酸已被證實(shí)可通過(guò)下調(diào)促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、白細(xì)胞介素-8(IL-8)和TNF-α的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗炎作用，并且通過(guò)降低一氧化氮(NO)、過(guò)氧化氫(H2O2)和丙二醛含量來(lái)發(fā)揮抗氧化作用[25]。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧中添加BFA可增加盲腸咖啡因水平?？Х纫蚴且环N存在于植物中的天然生物堿，已被鑒定為糖基水解酶18家族(幾丁質(zhì)酶)的抑制劑[26]。郭會(huì)林等[27]研究發(fā)現(xiàn)，咖啡因長(zhǎng)期刺激可增加小鼠小腸絨毛高度、降低隱窩深度，并且增強(qiáng)小鼠腸道對(duì)腸道激素胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)和胰島素的敏感性。另外，咖啡因可改善硫酸葡聚糖鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥狀，減少細(xì)菌易位的發(fā)生和降低促炎細(xì)胞因子含量[28]。

4 結(jié) 論

飼糧中添加1 500 mg/kg BFA對(duì)仙居雞生產(chǎn)性能有一定的改善作用，并且提高了空腸糜蛋白酶以及回腸糜蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶活性，降低了血清促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α含量，其良好的促生長(zhǎng)和抗炎效果可能與盲腸中短鏈脂肪酸產(chǎn)生有關(guān)的罕見(jiàn)小球菌屬、Catenibacillus和毛螺菌科-UGG-002相對(duì)豐度增加有關(guān)。BFA可作為飼用抗生素的潛在替代品。