桑葉提取物對蛋雞生產(chǎn)性能、腸道免疫功能、腸道組織形態(tài)及盲腸菌群結構的影響

張 波 黃晨軒 陳一凡 白晶雨 王德賀 陳祥宇 常冬梅 張偉偉 馬國棟 白宇宇 劉銀銀 陳 輝* 籍 穎

(1.河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，保定 071001；2.陜西省佳縣通鎮(zhèn)區(qū)域農(nóng)牧技術推廣站，佳縣 719208；3.正定縣桑產(chǎn)業(yè)應用研究所，正定 050800；4.陜西省佳縣王家砭鎮(zhèn)區(qū)域農(nóng)牧技術推廣站，佳縣 719208；5.河北農(nóng)業(yè)大學信息科學與技術學院，保定 071001)

畜牧業(yè)發(fā)展現(xiàn)已進入新時代，但抗生素濫用等問題嚴重危害畜牧業(yè)健康發(fā)展，隨著限抗政策正式落地，尋找高效綠色的抗生素替代品迫在眉睫。桑葉提取物作為一種新型植物提取物備受關注，其主要成分有桑葉多糖、桑葉黃酮、1-脫氧野尻霉素等，這些生物活性物質具有調(diào)節(jié)免疫力、降血糖、抗氧化、抗凝血等作用[1-5]。章學東等[6]和邱時秀等[7]研究表明，飼糧中添加桑葉粉可顯著提高蛋雞的生產(chǎn)性能；邱時秀等[8]研究表明，飼糧中添加6%～9%桑枝葉干粉可顯著增強彭縣黃雞機體免疫應答水平；鄺哲師等[9]研究表明，飼糧添加5%或10%桑葉粉可顯著降低胡須雞盲腸大腸桿菌數(shù)量，改善腸道健康。目前，生產(chǎn)實踐中主要研究桑葉及發(fā)酵桑葉在動物生產(chǎn)中的應用，針對桑葉提取物在蛋雞生產(chǎn)中的應用研究報道則較少。因此，本試驗擬在飼糧中添加不同水平的桑葉提取物(主要成分為桑葉多糖)，研究其對蛋雞生產(chǎn)性能、免疫功能、腸道組織形態(tài)及盲腸菌群結構的影響，為桑葉提取物在蛋雞生產(chǎn)中的應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本試驗采用單因素隨機試驗設計，選取健康狀況良好且長勢相近的38周齡羅曼灰蛋雞288只，隨機分成4個組，每組6個重復，每個重復12只雞。試驗預試期14 d，正試期56 d。預試期內(nèi)所有雞飼喂基礎飼糧，正試期內(nèi)對照組飼喂基礎飼糧，3個試驗組則在基礎飼糧中分別添加0.4%、0.8%、1.2%的桑葉提取物。試驗所用桑葉提取物由河北某生物科技公司提供，為墨綠色粉末狀，以二氧化硅為載體，主要活性成分為桑葉多糖(20%)、桑葉黃酮(3%)、生物堿(2%)?；A飼糧配制參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)和《新型羅曼商品蛋雞飼養(yǎng)管理手冊》，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.2 飼養(yǎng)管理

本次試驗場地為河北農(nóng)業(yè)大學畜牧學教學基地，蛋雞采用3層半開放式階梯籠養(yǎng)，自由采食和飲水。場地采用自然通風方式，自然+人工光照，光照時間16 h，光照強度15 lx。每日15:00收集1次雞蛋并記錄雞群的精神狀況和病死情況。定時打掃雞舍。

1.3 樣品采集

試驗第56天，每個重復隨機選取2只，共48只雞，遵循動物福利化屠宰流程對雞只進行屠宰。打開腹腔，分離出十二指腸、空腸和回腸，在每段腸道中段取3 cm左右腸道樣品，用生理鹽水將腸道內(nèi)容物沖洗干凈，放到4%甲醛溶液中常溫保存，以備制作石蠟切片。無菌采集回腸黏膜及盲腸內(nèi)容物放入凍存管，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測定指標

1.4.1 生產(chǎn)性能

每天記錄產(chǎn)蛋數(shù)、雞只數(shù)，按重復稱量雞蛋重量。每周以重復為單位計算產(chǎn)蛋率、平均蛋重、平均日采食量以及料蛋比。

1.4.2 腸道免疫指標

使用試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)測定回腸黏膜中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、補體3(C3)、補體4(C4)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-4(IL-4)含量，嚴格按照說明書操作。

1.4.3 腸道組織形態(tài)

制作切片的具體操作為固定、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色和封固，采用正置光學顯微鏡測定絨毛高度(villus height，VH)和隱窩深度(crypt depth，CD)，計算絨隱比(villus height/crypt depth ratio，V/C)：

絨隱比=絨毛高度/隱窩深度。

1.4.4 盲腸菌群結構

每組選取8只蛋雞的盲腸內(nèi)容物進行盲腸菌群結構分析。采用HiSeq 2500高通量測序技術對盲腸微生物16S rDNA基因全長進行測序，由北京百邁克生物科技有限公司完成。測序流程為：使用德國MN公司的NucleoSpin 96 Soil(4×96)試劑盒提取樣品總細菌DNA后，根據(jù)16S rDNA全長引物27F和1492R，合成帶有Barcode的特異引物，進行PCR擴增并對其產(chǎn)物進行純化、定量和均一化形成測序文庫(SMRT Bell)，建好的文庫先進行文庫質檢，質檢合格的文庫用PacBio Sequel進行測序。將PacBio下機數(shù)據(jù)導出為CCS文件(CCS序列使用Pacbio提供的smrtlink工具獲取)后，進行如下3個步驟的操作。

1)CCS識別：使用lima v1.7.0軟件，通過Barcode對CCS進行識別，得到的Barcode-CCS序列數(shù)據(jù)；

2)CCS長度過濾：使用百邁客公司自主研發(fā)的軟件，對Barcode-CCS進行過濾，得到有效序列；

3)去除嵌合體：使用UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到Optimization-CCS序列。

對序列信息進行操作分類單元(OTU)、多樣性及差異性分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Office 365進行整理，應用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)程序對試驗數(shù)據(jù)進行分析，并采用Duncan氏法進行組間的多重比較。試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 桑葉提取物對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，與對照組相比，飼糧中添加0.4%、0.8%或1.2%的桑葉提取物對蛋雞平均日采食量、產(chǎn)蛋率、料蛋比和平均蛋重均無顯著影響(P>0.05)。

表2 桑葉提取物對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

2.2 桑葉提取物對蛋雞腸道免疫功能的影響

由表3可知，與對照組相比，飼糧中添加0.4%、0.8%或1.2%的桑葉提取物對回腸黏膜中IgA、IgM、IgG、C3、C4、TNF-α、IFN-γ及IL-2含量均無顯著影響(P>0.05)，但可顯著提高回腸黏膜中IL-4含量(P<0.05)。

表3 桑葉提取物對蛋雞腸道免疫功能的影響

2.3 桑葉提取物對蛋雞腸道組織形態(tài)的影響

由表4可知，與對照組相比，飼糧中添加0.4%、0.8%或1.2%的桑葉提取物可顯著增加十二指腸、空腸、回腸絨毛高度及回腸絨隱比(P<0.05)，飼糧中添加1.2%的桑葉提取物可顯著降低空腸隱窩深度(P<0.05)，飼糧中添加0.4%或1.2%的桑葉提取物可顯著降低回腸隱窩深度并顯著提高空腸絨隱比(P<0.05)。

表4 桑葉提取物對蛋雞腸道組織形態(tài)的影響

2.4 桑葉提取物對蛋雞盲腸菌群結構的影響

2.4.1 盲腸內(nèi)容物有效OTU數(shù)統(tǒng)計

使用Usearch軟件對Reads在97.0%的相似度水平下進行聚類，獲得OTU。維恩圖(Venn diagram)重疊部分為共有特征數(shù)目，非重疊部分為特有特征數(shù)目。由圖1可知，試驗組與對照組共有OTU數(shù)為526個。

A：0.4%桑葉提取物組；B：0.8%桑葉提取物組；C為1.2%桑葉提取物組；D：對照組。

2.4.2 物種分類學分析

根據(jù)物種分類學注釋結果，盲腸菌群在門水平上的相對豐度如圖2所示，在屬水平上的相對豐度如圖3所示。由圖2可知，對照組與試驗組蛋雞盲腸菌群中相對豐度大于1%的菌門有擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)。由表5可知，與對照組相比，各試驗組盲腸菌群中變形菌門的相對豐度均顯著降低(P<0.05)，其余菌門的相對豐度均無顯著變化(P>0.05)。由圖3可知，對照組與試驗組蛋雞盲腸菌群中相對豐度大于1%的菌屬有擬桿菌屬(Bacteroides)、理研菌科RC9腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、普雷沃氏菌科UCG-001(Prevotellaceae_UCG-001)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)等。由表5可知，與對照組相比，飼糧中添加0.4%或1.2%的桑葉提取物可顯著提高盲腸菌群中糞桿菌屬的相對豐度(P<0.05)，飼糧中添加1.2%的桑葉提取物可顯著提高盲腸菌群中考拉桿菌屬的相對豐度(P<0.05)。

表5 桑葉提取物對蛋雞盲腸菌群在門和屬水平上相對豐度的影響

Others：其他；Tenericutes：軟壁菌門；Deferribacteres：互養(yǎng)菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Spirochaetes：螺旋體門；Proteobacteria：變形菌門；Actinobacteria：放線菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門。

Bacteroides：擬桿菌屬；Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研菌科RC9腸道群；Faecalibacterium：糞桿菌屬；Prevotellaceae_UCG-001：普雷沃氏菌科UCG-001；Lactobacillus：乳桿菌屬；Phascolarctobacterium：考拉桿菌屬；Desulfovibrio：脫硫弧菌屬；Olsenella：歐陸森氏菌屬；Ruminococcaceae_UCG-014：瘤胃球菌科UCG-014；Sphaerochaeta：鱗球菌屬；Others：其他。

3 討 論

3.1 桑葉提取物對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

目前，針對飼糧中添加桑葉及其提取物是否會對畜禽生產(chǎn)性能產(chǎn)生影響尚無統(tǒng)一定論。Zhao等[10]和呼紅梅等[11]研究表明，飼糧中添加桑葉多糖對仔豬的平均日采食量、平均日增重及飼料轉化率均無顯著影響。雷春龍等[12]研究表明，飼糧中添加桑枝葉提取物對羅曼粉蛋雞的平均日采食量無顯著影響，但添加0.4%與0.8%桑枝葉提取物可顯著提高產(chǎn)蛋率并顯著降低料蛋比。本試驗結果表明，飼糧中添加0.4%～1.2%的桑葉提取物不會對蛋雞生產(chǎn)性能造成不良影響，且有使料蛋比降低的趨勢。新鮮桑葉中含有諸如單寧(5.32 mg/kg)和植酸(488.9 mg/kg)等抗營養(yǎng)因子，直接飼喂會影響畜禽采食，降低生產(chǎn)性能，嚴重時還會發(fā)生中毒的情況[3,13]。使用桑葉提取物則可有效避免此類問題，因此本試驗對蛋雞生產(chǎn)性能未造成不良影響。

3.2 桑葉提取物對蛋雞腸道免疫功能的影響

腸道免疫功能與腸道健康有著密切聯(lián)系。IL-4是Ⅱ型輔助T細胞分泌的細胞因子，在調(diào)節(jié)體液免疫中起關鍵作用[14]。IL-4含量升高可反映出機體免疫應答水平的提升。IgM是由漿細胞完整分泌的一類免疫球蛋白，產(chǎn)生于初次體液免疫反應并起抗原受體作用[15]。Chen等[16]研究表明，在體內(nèi)試驗中純化Ⅱ型桑葉多糖(MLP-2)能明顯提升蛋雞氣管與空腸黏膜中IL-2、IFN-γ和分泌型免疫球蛋白A(sIgA)的表達水平，促進盲腸中IgA+細胞的產(chǎn)生，從而增強蛋雞氣管和腸道的免疫功能。馮麒鳳等[17]研究表明，飼糧中添加0.75%的桑葉提取物可顯著提高大鯢腸道免疫相關基因雷帕霉素靶蛋白(TOR)、IL-4、多聚免疫球蛋白受體(pIgR)、Toll樣受體2(TLR2)、髓樣分化因子88(MyD88)和白細胞介素-1受體相關激酶4(IRAK4)的表達量。許禎瑩等[18]研究表明，飼糧中添加3%、6%、9%或12%的桑葉粉可顯著提高羅曼褐蛋雞血清中IgA、IgG、IgM、白細胞介素-1(IL-1)及白細胞介素-6(IL-6)含量，且隨著添加水平增加而呈現(xiàn)上升的趨勢。雷春龍等[12]研究表明，飼糧中添加0.2%、0.4%或0.8%的桑枝葉提取物可顯著提高羅曼粉蛋雞血清中IgG含量，添加0.4%或0.8%的桑枝葉提取物還可顯著提高血清中IgA、IgM、IL-6和TNF-α含量。桑葉多糖可增強非特異性免疫、體液免疫及細胞免疫等免疫功能[19-21]。本研究結果表明，飼糧中添加0.8%桑葉提取物可顯著提高羅曼褐蛋雞回腸黏膜中IL-4含量，且IgM有升高的趨勢，提示桑葉提取物可增強蛋雞腸道免疫功能，改善腸道健康。

3.3 桑葉提取物對蛋雞腸道組織形態(tài)的影響

腸道消化能力可以通過小腸絨毛高度、隱窩深度及絨隱比進行評價[22-25]。當小腸絨毛高度增高時，會擴大小腸黏膜與食糜表面積，有助于提升腸道消化能力[26]。隱窩深度反映了小腸上皮細胞的成熟速率，隱窩變淺表明小腸上皮細胞的成熟速率增加，分泌功能增強[27]。絨隱比反映了腸道整體生理形態(tài)與功能狀態(tài)，絨隱比升高表明腸道吸收功能在增強[24,28]。本研究結果顯示，飼糧中添加0.2%、0.4%或0.8%的桑葉提取物均可顯著提高蛋雞十二指腸、空腸、回腸絨毛高度及回腸絨隱比，飼糧中添加1.2%的桑葉提取物可顯著降低空腸隱窩深度，飼糧中添加0.4%或1.2%桑葉提取物可顯著降低回腸隱窩深度并顯著提高空腸絨隱比。上述結果提示，桑葉提取物可以有效改善蛋雞腸道內(nèi)環(huán)境，促進小腸消化吸收，保障腸道健康。張金龍等[29]研究表明，飼糧中添加2%發(fā)酵桑葉粉可顯著提升42日齡羅斯308肉雞空腸和回腸絨毛高度。有學者發(fā)現(xiàn)多糖類物質作為天然強抗氧化劑，可直接清除機體內(nèi)脂質過氧化物和超氧離子自由基[12]。Wang等[30]研究表明，桑葉多糖具有明顯的清除自由基活性，且呈劑量效應關系，桑葉多糖在0.05～1.00 mg/mL范圍內(nèi)濃度越大，自由基清除活性越高。因此我們推測飼糧中添加的桑葉提取物可能作為抗氧化劑增強腸道免疫功能，維持蛋雞腸道組織形態(tài)結構。此外，謝紅兵[31]研究表明，植物多糖可促進小腸葡萄糖相關轉運蛋白表達，激活相關信號通路促進上皮細胞增殖，進而提升腸道消化吸收功能。桑葉提取物改善腸道健康的具體機制還不清楚，需進一步試驗驗證。

3.4 桑葉提取物對蛋雞盲腸菌群結構的影響

腸道健康與腸道內(nèi)菌群結構息息相關，腸道菌群不僅參與消化道消化吸收過程，還參與抵御外來細菌對機體的入侵，起著生物屏障作用[32-34]。腸道菌群結構變化受到諸如畜禽個體、飼養(yǎng)環(huán)境、飼糧配比等的影響[35]。諸多研究表明，植物多糖可以調(diào)節(jié)畜禽腸道菌群結構，改善腸道健康[33,35-36]。

程冉冉[37]研究表明，蛋雞盲腸菌群中的優(yōu)勢菌門為擬桿菌門、厚壁菌門和放線菌門，本試驗結果與此一致。王文文等[38]研究表明，飼糧中添加400 mg/kg BW發(fā)酵麩皮多糖可使肉羊瘤胃菌群中變形菌門的相對豐度顯著降低。變形菌門中包括諸多致病菌，降低變形菌門的相對豐度有利于腸道健康[39]。本試驗中，飼糧中添加0.2%、0.4%或0.8%的桑葉提取物均可顯著降低蛋雞盲腸菌群中變形菌門的相對豐度，說明桑葉提取物抑制了蛋雞盲腸菌群中有害菌的生長。糞桿菌屬在腸道菌群中的相對豐度可以衡量腸道健康狀況，糞桿菌屬可以生產(chǎn)丁酸鹽，丁酸鹽能夠協(xié)調(diào)機體抵御外來病原體入侵，降低機體炎癥反應，一定范圍內(nèi)其相對豐度越高說明腸道內(nèi)環(huán)境越健康[40-41]?？祭鷮賹儆诤癖诰T，通常為有益菌[42]。本試驗中，飼糧中添加0.4%或1.2%的桑葉提取物均可顯著升高蛋雞盲腸菌群中糞桿菌屬的相對豐度，且添加1.2%的桑葉提取物還可顯著升高考拉菌屬的相對豐度，表明桑葉提取物改善了蛋雞的盲腸菌群結構。

4 結 論

① 飼糧中添加0.4%～1.2%的桑葉提取物對蛋雞生產(chǎn)性能無不良影響。

② 飼糧中添加0.8%的桑葉提取物可顯著提高蛋雞回腸黏膜中IL-4含量，增強腸道免疫功能。

③ 飼糧中添加0.8%～1.2%的桑葉提取物可改善腸道組織形態(tài)和盲腸菌群結構，進而保障腸道健康。

④ 綜合分析得出，本試驗條件下，在蛋雞飼糧中添加0.8%的桑葉提取物最為適宜。