殷成港 高 歌* 商 譚 李習龍 蔣顯仁**
(1.中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所,農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點實驗室,北京 100081;2.賽多美(北京)農(nóng)業(yè)科技有限公司,北京 100027)
伴隨著集約化養(yǎng)殖的不斷發(fā)展,仔豬早期斷奶是近年來養(yǎng)豬過程中的重要環(huán)節(jié),可以極大地提高養(yǎng)豬場的生產(chǎn)效率。早期斷奶仔豬的胃腸道未完全發(fā)育、免疫系統(tǒng)不完善、抗病能力弱,同時受到飼糧組成、飼養(yǎng)環(huán)境和心理等因素的影響,會使斷奶仔豬產(chǎn)生一系列的斷奶應激,導致仔豬發(fā)育遲緩、發(fā)生腹瀉,嚴重時甚至導致死亡[1-2]。為解決這一難題,養(yǎng)殖生產(chǎn)中主要通過在飼糧中添加抗生素來緩解仔豬早期斷奶應激。然而,飼糧中添加抗生素會產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留[3-4]。我國已于2020年7月禁止在飼糧中添加抗生素。高劑量氧化鋅可以有效降低仔豬腹瀉和促進仔豬生長,長期以來一直在斷奶仔豬飼糧中使用,特別是“禁抗”以來發(fā)揮了很好的“替抗”作用。然而,高劑量氧化鋅的添加也帶來一系列負面影響,比如增加了機體對抗生素的抗藥性,并且大量鋅元素的排出對環(huán)境造成了很大污染。歐盟將于2022年6月份開始禁止在斷奶仔豬飼糧中添加高劑量氧化鋅,規(guī)定飼糧中鋅的添加量不能超過150 mg/kg。因此,為保障畜禽養(yǎng)殖業(yè)的生產(chǎn)效益和可持續(xù)發(fā)展,尋找和開發(fā)綠色、高效“替抗”的飼料添加劑已刻不容緩。
近年來,后生元及其有效成分益生作用的研究逐漸受到關(guān)注,后生元是繼益生菌出現(xiàn)后定義的一個新概念,是一種功能性生物活性化合物。后生元是益生菌經(jīng)加工處理后的益生菌成分統(tǒng)稱,包括菌體與益生菌代謝產(chǎn)物。2019年,國際益生菌和益生元協(xié)會把后生元定義為“對宿主起有益作用的滅活菌和/或菌成分”[5]。后生元因具有超長的保質(zhì)期、安全的劑量參數(shù)以及含有多種具有抗菌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗增殖、降膽固醇等生物學作用而受到人們的關(guān)注[6]。Guo等[7]研究發(fā)現(xiàn),來自乳酸乳球菌產(chǎn)生的后生元(胞外多糖)可以增加抗氧化酶[過氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)等]活性,表現(xiàn)出抗氧化活性,同時降低小鼠血漿和肝臟中的脂質(zhì)過氧化物[丙二醛(malondialdehyde,MDA)等]含量。Izuddin等[8]研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加后生元增加了羔羊的增重、采食量、營養(yǎng)物質(zhì)攝入量和營養(yǎng)物質(zhì)消化率,提高了血清總蛋白、尿素氮和葡萄糖含量。
目前,后生元在斷奶仔豬飼糧中應用效果的研究較少。因此,本試驗選用后生元與高劑量氧化鋅進行對比,探討后生元對斷奶仔豬生長性能、腹瀉率、抗氧化能力及糞便微生物菌群的影響,以及飼糧中添加后生元對于高劑量氧化鋅的替代效果,為后生元在動物生產(chǎn)中的深入研究和開發(fā)應用提供數(shù)據(jù)參考。
本試驗所用后生元為乳酸菌來源后生元產(chǎn)品,由美國某生物科技有限公司提供,該產(chǎn)品為嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)經(jīng)過多級發(fā)酵而成,含有多種代謝產(chǎn)物,主要包括有機酸、肽聚糖、胞外多糖、磷壁酸、蛋白質(zhì)和肽等。本產(chǎn)品主要載體為膨潤土,粗蛋白質(zhì)含量為5%。
試驗選取75頭23日齡“杜×長×大”三元雜交斷奶閹公豬,初始體重為(6.18±0.21)kg,按體重完全隨機區(qū)組分為3個組,每組5個重復(欄),每個重復5頭豬。陰性對照組(negative control group,NC組)飼喂不添加抗生素和氧化鋅的基礎飼糧,陽性對照組(positive control group,PC組)飼喂基礎飼糧+氧化鋅[保育前期(第1~14天)添加2 kg/t,保育后期(第15~42天)不添加],后生元組(postbiotics group,PB組)飼喂基礎飼糧+后生元(保育前期添加4 kg/t,保育后期添加2 kg/t)。試驗期42 d,分2階段(保育前期和保育后期)飼喂。仔豬基礎飼糧配制參照NRC(2012)保育階段豬營養(yǎng)需要,其組成及營養(yǎng)水平見表1。
表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(飼喂基礎)
試驗于中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所廊坊試驗基地進行。試驗采用全封閉式豬舍,試驗仔豬分欄飼養(yǎng)于1.4 m×1.7 m的漏縫式地板圈內(nèi),飼喂粉料,自由采食和飲水。豬舍初始室溫為28 ℃,每周降低1 ℃,最終溫度達到25 ℃。每日檢查豬舍照明和通風情況,并定期清潔豬圈。室內(nèi)使用日光和人造光相結(jié)合,使用速度控制風扇通風。每欄配有2個乳頭式飲水器和不銹鋼可調(diào)式料槽。消毒程序及疫苗接種按豬場常規(guī)方法進行。
1.4.1 生長性能
在試驗開始當天、第14天、第28天和第42天,分別稱量仔豬欄重并記錄數(shù)據(jù),計算平均日增重(average daily gain,ADG)、平均日采食量(average daily feed intake,ADFI)和重料比(gain to feed ratio,G/F)。仔豬死淘時記錄死淘仔豬體重和相對應欄剩余料重,用于校正生長性能數(shù)據(jù)。計算公式如下:
ADG=[(試驗末重-試驗初重)/頭數(shù)]/試驗天數(shù);ADFI=[(試驗期內(nèi)供料量-試驗期內(nèi)剩料量)/頭數(shù)]/試驗天數(shù);G/F=ADG/ADFI。
1.4.2 腹瀉率
試驗期記錄第1~14天腹瀉情況,每天09:00逐頭檢測仔豬腹瀉情況,觀察每頭仔豬肛門紅腫情況及各欄內(nèi)稀糞是否存在。采用4分糞便評分系統(tǒng)對每頭仔豬每日進行視覺評估監(jiān)測:0分=堅硬,成形的糞便;1分=柔軟,濕潤的糞便,成形;2分=軟便,不成形;3分=水樣便。液體形式糞便(2~3分)將被視為腹瀉。腹瀉率(%)為腹瀉仔豬數(shù)除以斷奶仔豬總數(shù)的百分比,計算公式如下:
腹瀉率(%)=[腹瀉豬頭次/(試驗豬頭數(shù)×總天數(shù))]×100。
1.4.3 血漿抗氧化和免疫指標
試驗第14天和第42天,分別從每欄中選取1頭體重接近平均體重的仔豬,通過前腔靜脈進行靜脈采血,靜置30 min后3 000 r/min離心10 min,分離血漿并置于-20 ℃冰箱保存待測??寡趸笜税ǎ篗DA、SOD、CAT和GSH-Px;免疫指標包括:免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)。上述測定指標所需試劑盒均購自南京建成生物工程研究所,具體操作步驟依照試劑盒說明書進行。
1.4.4 糞便微生物指標
試驗第14天,從每欄中隨機選取3頭仔豬,通過人工刺激肛門內(nèi)外括約肌法和直腸擦拭法,采集新鮮的糞便樣本(大約20 g),同一欄糞便混勻裝入凍存管并放入-80 ℃冰箱凍存,對糞便樣本進行DNA提取和16S rRNA PCR擴增。糞便樣品送到上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司,通過高通量測序技術(shù)對糞便進行16S rRNA基因測序,構(gòu)建PE文庫,利用Illumina測序(序列相似度:0.97,物種分類數(shù)據(jù)庫:silva138/16s_bacteria,分類置信度:0.7),根據(jù)相似度水平的不同對所有序列進行操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)劃分,用97%相似度水平的OTU進行統(tǒng)計分析。
使用SAS 9.3統(tǒng)計軟件分析所有數(shù)據(jù),采用隨機區(qū)組設計進行廣義線性模型(GLM)方差分析,使用Tukey HSD法進行多重比較。此外,采用卡方檢驗分析仔豬腹瀉率。利用非參數(shù)檢驗分析糞便樣品之間微生物的相對豐度,揭示樣品的物種構(gòu)成。結(jié)果以平均值和均值標準誤(SEM)表示,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。
由表2可知,PC組的第28天體重顯著低于NC組和PB組(P<0.05),PC組的第15~28天ADG和ADFI極顯著低于NC組和PB組(P<0.01),PC組的第1~42天ADFI顯著低于PB組(P<0.05),PC組和PB組的第1~14天腹瀉率極顯著低于NC組(P<0.01)。
表2 飼糧中添加后生元對斷奶仔豬生長性能及腹瀉率的影響
由表3可知,第14天,PC組和PB組的血漿CAT、SOD和GSH-Px活性極顯著高于NC組(P<0.01);PC組和PB組的血漿MDA含量極顯著低于NC組(P<0.01),PB組的血漿MDA含量極顯著低于PC組(P<0.01)。第42天,PC組和PB組的血漿SOD和GSH-Px活性極顯著高于NC組(P<0.01),PB組的血漿MDA含量顯著低于NC組(P<0.05)。
表3 飼糧中添加后生元對斷奶仔豬血漿抗氧化指標的影響
由表4可知,第14天,PC組和PB組的血漿IgA含量極顯著高于NC組(P<0.01)。第42天,PB組的血漿IgA含量極顯著高于NC組(P<0.01),PC組和PB組的血漿IgG含量極顯著高于NC組(P<0.01)。
表4 飼糧中添加后生元對斷奶仔豬血漿免疫指標的影響
2.4.1 斷奶仔豬糞便微生物菌群聚類分析
根據(jù)第14天糞便樣品中的OTU繪制了Venn圖,可用來統(tǒng)計不同樣品中獨有與共有的OTU數(shù)目,可以比較直觀地體現(xiàn)出樣品OTU數(shù)目組成的相似性和重疊性。由圖1可知,NC組獨有51個OTU,PC組獨有48個OTU,PB組獨有66個OTU,3組共同擁有496個OTU。
NC:陰性對照組 negative control group;PC:陽性對照組 positive control group;PB:后生元組 postbiotics group。下圖同 the same as below。
2.4.2 斷奶仔豬糞便微生物α多樣性分析
根據(jù)物種注釋結(jié)果,分別在門水平和屬水平上進行了分析,由表5可知,PC組和PB組的Shannon指數(shù)極顯著高于NC組(P<0.01),PC組和PB組的Simpson指數(shù)顯著低于NC組(P<0.05)。各組之間Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)差異不顯著(P>0.05)。
表5 飼糧中添加后生元對斷奶仔豬糞便微生物α多樣性的影響
2.4.3 斷奶仔豬糞便微生物組成分析
由圖2可知,在門水平上,糞便微生物中優(yōu)勢菌門主要是厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidota)、放線菌門(Actinobacteriota)、螺旋菌門(Spirochaetota)、變形菌門(Proteobacteria)。其中,NC組、PC組和PB組的糞便厚壁菌門相對豐度分別為76.61%、67.79%和80.35%,擬桿菌門相對豐度分別為13.72%、22.55%和14.77%。
Firmicutes:厚壁菌門;Bacteroidetes:擬桿菌門;Actinobacteria:放線菌門;Spirochaetes:螺旋菌門;Proteobacteria:變形菌門;Others:其他。
由圖3可知,在屬水平上,糞便微生物中優(yōu)勢菌屬主要是乳桿菌屬(Lactobacillus)、狹義梭菌屬1(Clostridium_sensu_stricto_1)、orank_f_Muribaculaceae、理研菌科RC9腸群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、普雷沃菌科NK3B31群(Prevotellaceae NK3B31_group)、普雷沃菌屬(Prevotella)、密螺旋菌屬(Treponema)、腸桿菌屬(Terrisporobacter)、克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)、布勞特氏菌屬(Blautia)等。其中,NC組、PC組和PB組的糞便乳桿菌屬相對豐度分別為21.13%、2.69%和22.27%,糞便狹義梭菌屬1相對豐度分別為6.54%、15.71%和6.37%。
Lactobacillus:乳桿菌屬;Clostridium_sensu_stricto_1:狹義梭菌屬1;Rikenellaceae_RC9_gut_group:理研菌科RC9腸群;Prevotellaceae_ NK3B31_group:普雷沃菌科NK3B31群;Prevotella:普雷沃菌屬;Treponema:密螺旋菌屬;Terrisporobacter:腸桿菌屬;Blautia:布勞特氏菌屬;Subdoligranulum:罕見小球菌屬;Agathobacter:無加桿菌屬;Roseburia:羅斯氏菌屬;Faecalibacterium:糞桿菌屬;Romboutsia:羅姆布茨菌屬;Clostridium_sensu_stricto_6:狹義的梭菌屬6;Ruminococcus:瘤胃球菌屬;Escherichia-Shigella:埃希氏菌-志賀氏菌屬;Streptococcus:鏈球菌屬;Butyricicoccus:丁酸菌屬;Desulfovibrio:脫硫弧菌屬;Catenibacterium:鏈狀桿菌屬;Oribacterium:東方桿菌屬;Syntrophococcus:互營球菌屬;Oscillospira:顫螺旋菌屬;Anaerovibrio:厭氧弧菌屬;Christensenellaceae_R-7_group:克里斯滕森菌科R-7群;Lachnospiraceae_XPB1014_group:毛螺旋菌科_XPB1014群;unclassified_f_Lachnospiraceae:未分類-毛螺旋菌科;Lachnospiraceae_NK4A136_group:毛螺旋菌科NK4A136群;Lachnospiraceae_AC2044_group:毛螺旋菌科AC2044群;NK4A214_group:NK4A214群;Eubacterium_ruminantium_group:優(yōu)桿菌屬反芻動物群;Eubacterium_hallii_group:優(yōu)桿菌屬哈利群;Eubacterium_siraeum_group:優(yōu)桿菌屬西雷姆群;Ruminococcus_torques_group:瘤胃球菌屬扭矩群;Lachnospiraceae_NK3A20_group:毛螺旋菌科NK3A20群;Others:其他。
由表6可知,NC組和PB組的糞便乳桿菌屬相對豐度極顯著高于PC組(P<0.01),PC組的糞便狹義梭菌屬1相對豐度極顯著高于NC組和PC組(P<0.01)。
表6 飼糧中添加后生元對斷奶仔豬糞便乳桿菌屬和狹義梭菌屬1的相對豐度的影響
本研究證實了飼糧中添加氧化鋅可通過降低斷奶仔豬腹瀉率促進保育前期生長的效果[9-11],從而建立了一個很好的動物模型來確定飼糧中添加后生元對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的作用。盡管如此,Pieper等[12]研究表明,氧化鋅對于腸道有益菌和有害菌均有抑制作用,對斷奶仔豬后期生長產(chǎn)生不良的影響。本研究中,PC組仔豬在保育后期的生長性能較差,這可能是保育前期氧化鋅抑制了腸道內(nèi)微生物活性,在保育后期無氧化鋅的作用時使腸道菌群失衡,從而抑制了腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和后期的生長。早期研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加后生元可以降低仔豬的腹瀉率,對于生長有一定的促進作用。Thu等[13]研究表明,斷奶仔豬飼糧中添加植物乳桿菌液體代謝物組合可以降低斷奶仔豬腹瀉率,提高斷奶仔豬的生長性能。Sukegawa等[14]研究表明,斷奶仔豬飼糧中添加熱滅活的糞腸球菌IHARA可以促進斷奶仔豬小腸絨毛的生長,提高機體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率,降低腹瀉率,進而提高斷奶仔豬的生長性能。Fu等[15]研究表明,斷奶仔豬飼糧中添加酵母水解物能夠促進斷奶仔豬腸道屏障功能,提高生長性能。Loh等[16]研究表明,飼糧中添加0.5%的植物乳桿菌代謝物組合可以改善斷奶仔豬的腸道健康環(huán)境和生長性能,提高蛋白質(zhì)消化率;但添加0.1%的植物乳桿菌代謝物組合無明顯的作用效果,說明后生元對于斷奶仔豬的作用效果與添加量密切相關(guān)。與上述研究結(jié)果相似,本試驗中,飼糧中添加后生元可降低斷奶仔豬腹瀉率,可能與其提高仔豬機體健康和腸道完整性有關(guān)。本研究團隊前期研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加沒食子酸可通過抑制腸道炎癥反應,提高腸道完整性,從而降低仔豬斷奶后腹瀉率[17]。但本研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加后生元對斷奶仔豬生長性能雖有所促進,但無顯著影響,這可能與添加的后生元種類和添加量、仔豬自身條件以及飼養(yǎng)管理有關(guān),需要后續(xù)相關(guān)試驗來進行驗證。
氧化應激是活性氧的產(chǎn)生和清除之間的失衡,會造成動物體內(nèi)不可修復的氧化損傷,進而影響整個機體的功能[18-19]。研究發(fā)現(xiàn),仔豬斷奶會破壞體內(nèi)的氧化平衡,破壞自由基的正常代謝,降低機體抗氧化能力[20]。MDA直接反映脂質(zhì)氧化損傷的程度[21],而CAT、SOD和GSH-Px的活性強弱反映了機體抗氧化能力的強弱[22-26]。Xu等[27]研究發(fā)現(xiàn),植物乳桿菌胞外多糖具有顯著的抗氧化活性,能夠?qū)?,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基起到清除活性作用,并且可以保護DNA免受損傷。Zhang等[28]研究表明,植物乳桿菌C88多糖可以抑制MDA的形成,提高總抗氧化能力(T-AOC)和SOD活性,并呈劑量依賴性。Czech等[29]研究發(fā)現(xiàn),在懷孕母豬飼糧中添加酵母甘露寡糖,可以提高后代仔豬機體CAT和SOD活性。血漿IgA、IgG在動物機體參與免疫應答反應中發(fā)揮著主要作用[30-31]。WANG等[32]研究發(fā)現(xiàn),植物乳桿菌胞外多糖可以顯著提高大鼠腸道IgA含量。Xiong等[33]研究表明,飼糧中添加酵母水解物可以增加斷奶仔豬血漿IgG含量。本試驗中,飼糧中添加氧化鋅和后生元降低了斷奶仔豬血漿MDA含量,提高了血漿CAT、SOD、GSH-Px活性和IgA和IgG含量,說明飼糧中添加氧化鋅和后生元可以提高斷奶仔豬抗氧化能力,并增強免疫功能,從而提高仔豬斷奶后的抗病力并抑制仔豬腹瀉。此外,飼糧中添加后生元可以顯著降低斷奶仔豬第14天和第42天血漿MDA含量,說明機體的脂質(zhì)過氧化和自由基生成水平降低。而添加氧化鋅僅降低了第14天血漿MDA含量,可能說明飼糧中添加后生元對于調(diào)節(jié)機體脂質(zhì)過氧化和自由基生成的效果相比氧化鋅更好。因此,在抗氧化能力和免疫功能方面,后生元具有替代氧化鋅的效果。
腸道菌群與生物體的健康和疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),腸道微生物的存在為機體創(chuàng)造了良好的微生態(tài)環(huán)境,腸道菌群與機體相互依賴,相互制約[34]。腸道微生物的多樣性影響著機體健康,微生物多樣性越豐富越有利于機體的健康[35]。Da Silva等[36]研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加2 500 mg/kg普通氧化鋅可以降低盲腸菌群的相對豐度,Simpson指數(shù)有下降的趨勢。杜泓明[37]研究表明,益生菌培養(yǎng)物可以提高斷奶仔豬腸道內(nèi)菌群多樣性。本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果一致,飼糧中添加氧化鋅降低了菌群OTU數(shù)目和特有OTU數(shù)目,而PB組總OTU數(shù)目和特有OTU數(shù)目有所增加。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)可以反映糞便菌群的多樣性,分別與物種多樣性呈正相關(guān)和負相關(guān)[38]。本試驗中,與NC組相比,PC組和PB組Shannon指數(shù)提高,Simpson指數(shù)降低。綜上所述,飼糧中添加后生元在一定程度上可以提高斷奶仔豬糞便微生物菌群數(shù)量以及多樣性,添加氧化鋅降低了斷奶仔豬糞便微生物菌群數(shù)量。
微生物群落組成結(jié)構(gòu)受飼糧組成和環(huán)境因素影響較大。相關(guān)研究表明,豬腸道微生物中,在門水平上以厚壁菌門相對豐度最高,依次是擬桿菌門、變形桿菌門、放線菌門和螺旋體門等[39]。本研究結(jié)果與上述一致,在門水平上主要是厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、螺旋菌門、變形菌門,其中厚壁菌門的相對豐度最高,占菌落的60%~80%;與NC組相比,PC組的糞便厚壁菌門相對豐度降低,糞便擬桿菌門相對豐度升高,說明飼糧中添加氧化鋅可能一定程度上破壞了糞便微生物的平衡;PB組與NC組差異不明顯,說明后生元能夠維持糞便微生物在門水平上的平衡。吳飛等[40]研究表明,飼糧中添加0.6%后生元(乳酸桿菌菌體成分及其代謝產(chǎn)物)可提高回腸食糜中乳桿菌屬相對豐度,降低梭菌屬(Clostridium)相對豐度。本試驗在屬水平上結(jié)果顯示,PB組與NC組糞便微生物在屬水平上的相對豐度差異不明顯,但飼糧中添加氧化鋅降低了乳桿菌屬相對豐度,并提并高了狹義梭菌屬1相對豐度。Starke等[41]研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加高劑量氧化鋅降低了仔豬腸道內(nèi)乳酸桿菌的數(shù)量。狹義梭菌屬是腸道有害菌屬,可產(chǎn)生毒素對機體產(chǎn)生危害[42]。本試驗提高的狹義梭菌屬1相對豐度說明了氧化鋅對于微生物的影響較大,PC組后期的生長性能顯著降低可能與狹義梭菌屬相對豐度提高有關(guān)聯(lián),也有可能是因為氧化鋅的后置性,導致有害菌增殖破壞腸道微生物菌群平衡所致。此外,飼糧中添加后生元對糞便微生物在屬水平的相對豐度無顯著影響,說明飼糧中添加后生元能夠維持腸道微生物的正常水平。
① 飼糧中添加后生元能夠降低保育前期斷奶仔豬腹瀉率,提高其抗氧化能力和免疫功能,具有替代高劑量氧化鋅的作用。
② 飼糧中添加后生元可豐富斷奶仔豬糞便中菌群多樣性,維持有益菌的數(shù)量,從而保障仔豬穩(wěn)定生長。