下一代益生菌作用機制及功能特性研究進展

焦 帥 付域澤 張乃鋒

(中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點實驗室，北京 100081)

近幾年，在人或動物消化道內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一類具有很大益生潛力但非常難培養(yǎng)的細菌，稱之為下一代益生菌(next-generation probiotics，NGPs)，比如嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansiamuciniphila，AKK)和產(chǎn)丁酸菌等。糖和脂肪代謝異常、炎癥反應(yīng)是分娩、泌乳、斷奶期間宿主面臨的主要健康問題。改善這些健康問題的最佳途徑之一是通過益生菌調(diào)控腸道微生物區(qū)系，增強腸上皮細胞的完整性、增加最適免疫球蛋白A產(chǎn)量、調(diào)節(jié)體內(nèi)膽汁酸的平衡以及增加抗菌肽的產(chǎn)量等[1]。目前，主要的傳統(tǒng)益生菌比如乳桿菌屬(厚壁菌門)和雙歧桿菌屬(放線菌門)，是通過幾個世紀以來在發(fā)酵食品中的廣泛使用被選擇出來的。雖然其有極高的安全性和廣譜的促健康作用，但是在改善機體代謝障礙方面的總體效果和功能并不顯著。其次，傳統(tǒng)益生菌的使用并不能完全針對特定的健康問題[2]?；谏鲜銮闆r，迫切需要對新的、功能特異性的NGPs進行鑒定和表征，對其作用機制和安全性進行探索和評估。本文就NGPs的候選菌群、作用機制、功能特性和安全評估進行綜述，為NGPs的開發(fā)利用提供參考。

1 NGPs概述

NGPs是指目前還未被確定，但是當給予足夠劑量時，能通過特定作用對動物機體健康、生產(chǎn)性能等產(chǎn)生影響，適用于預(yù)防和治療機體代謝障礙或改善宿主健康的活體微生物[2]。隨著微生物分析技術(shù)的快速發(fā)展，使得鑒定具有潛在健康作用的未知腸道菌株成為可能[3]，腸道微生物區(qū)系的組成、微生物門類的功能等神秘的面紗逐漸被揭開。腸道微生物區(qū)系是一個復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)[4]，是宿主健康和疾病的重要調(diào)節(jié)因子[5]。腸道微生物與宿主體內(nèi)的各種器官和系統(tǒng)相互作用，形成了腸-腦軸、腸-肝軸、腸-血管軸等一系列調(diào)控機制，而且部分微生物的代謝產(chǎn)物是連接腸道微生物區(qū)系和動物機體生理功能的主要信號分子[5]，例如短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)等。因此，NGPs將以腸道共生菌作為主體，通過人工設(shè)計制成微生態(tài)制劑，作用于宿主重塑腸道微生物，以發(fā)揮其特定功能[6]。目前，開發(fā)利用NGPs的策略有2種：一種是將特定菌株的存在與否或者是豐度的差異與某一疾病狀態(tài)聯(lián)系起來，探索給予足夠量菌株情況下，機體是否恢復(fù)健康；另一種是將一種特性良好的益生菌菌株作為某些生物活性分子的載體，運輸該活性分子到特定部位發(fā)揮功能，從而起到靶向治療的作用[7]。

NGPs來源于宿主共生菌[8]，相比于傳統(tǒng)益生菌，其屬種范圍都得到了擴展。新興的NGPs開始成為新的預(yù)防和治療工具，最近的研究揭示了許多潛在的NGPs，比如調(diào)控血糖代謝的普氏菌(Prevotellacopri)和小克里斯滕森氏菌(Christensenellaminuta)，調(diào)節(jié)糖和脂肪代謝的金氏擬桿菌(Parabacteroidesgoldsteinii)和AKK，保護小鼠免受腸道疾病侵襲的普拉梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)，以及具有抗炎效果的脆弱類桿菌(Bacteroidesfragilis)[2]。將獲得的這些功能性微生物開發(fā)為活性生物制劑，在相關(guān)的監(jiān)管框架下應(yīng)用是NGPs的發(fā)展趨勢。傳統(tǒng)益生菌與NGPs在來源、范圍、使用歷史、目標效果、安全性等方面有著諸多差異，如表1所示。NGPs可以說是一種新的嘗試，標志著從具有長期安全使用歷史的傳統(tǒng)微生物到新興的腸道微生物的進步[7]。

表1 傳統(tǒng)益生菌和NGPs的比較

2 NGPs的候選菌群

腸道微生物區(qū)系和糞菌移植的研究，已經(jīng)證明腸道共生菌在調(diào)節(jié)機體健康方面的重要性，這也為NGPs的開發(fā)提供了方向，即在微生物區(qū)系失調(diào)中未得到充分表達的共生菌。比如擬桿菌屬、產(chǎn)丁酸菌、AKK和其他一些腸道菌群(表2)。擬桿菌屬屬于擬桿菌門，是一種嚴格的厭氧菌，其不同的菌株可能表現(xiàn)出完全不同的生理特征和病理表型。擬桿菌屬占結(jié)腸微生物群的20%～40%，是乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的10 000倍。除結(jié)腸外，還可以從其他腸道、口腔、上呼吸道和生殖道等部位分離獲得。其中具有潛在的益生功能的菌屬有卵形擬桿菌(Bacteroidesovatus)、脆弱擬桿菌、解木聚糖擬桿菌(Bacteroidesxylanisolvens)、多氏擬桿菌(Bacteroidesdorei)、酸性擬桿菌(Bacteroidesacidifaciens)等。產(chǎn)丁酸菌是通過降解碳水化合物產(chǎn)生丁酸的一類功能性菌群，其廣泛存在于消化道的各個部位，包括瘤胃、口腔、結(jié)腸和盲腸等。大多數(shù)產(chǎn)丁酸菌是厚壁菌門，典型的菌種有丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、普拉梭菌和霍氏真桿菌(Eubacteriumhallii)。AKK屬于疣微菌門，是一種豐富的腸道菌群，占腸道微生物區(qū)系的1%～3%，該菌呈橢圓形，不運動，不產(chǎn)芽孢，是一類厭氧的革蘭氏陰性菌。Derrien等[9]2004年首次從糞便中分離得到一株優(yōu)勢菌MUCT，通過鑒定其為疣微菌門的一個新屬，命名為阿克曼菌屬，AKK為該菌的唯一菌種，模式菌株為MUCT。AKK最初被歸類為一種嚴格厭氧菌，但最近研究表明，AKK能耐受少量的氧氣，被重新歸類為耐氧厭氧菌[10]。

表2 NGPs主要候選菌群

3 NGPs的作用機制

NGPs的作用機制主要分為3個方面，一是作為機體不可或缺的一部分，通過其自身結(jié)構(gòu)和免疫特性發(fā)揮作用；二是通過分泌代謝產(chǎn)物在調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡和宿主健康方面起重要作用；三是通過提高腸道上皮細胞緊密連接蛋白的表達，增強腸道上皮屏障的功能而起作用。NGPs的作用機制見圖1。

AKK：嗜黏蛋白阿克曼菌 Akkermansia muciniphila；SCFAs and MAMs：短鏈脂肪酸及微生物抗炎性分子short chain fatty acids and microbial ant-inflammatory molecules；NTBF：非產(chǎn)毒素脆弱擬桿菌 non-toxinogenic Bacteroides fragilis；Anti TH：產(chǎn)生抗炎因子的T細胞 anti-inflammatory cytokines producing T cells；GPR119：G蛋白偶聯(lián)受體119 G protein coupled receptor 119；GPR43：G蛋白偶聯(lián)受體43 G protein coupled receptor 43；GLP-1：胰高血糖素樣肽-1 glucagon-like peptide-1；GLP-2：胰高血糖素樣肽-2 glucagon-like peptide-2；IL-6：白細胞介素-6 interleukin-6；IL-10：白細胞介素-10 interleukin-10；MUC-2：黏蛋白-2 mucin-2；2-OG：2-油酰甘油 2-oleoylglycerol；Pro TH：產(chǎn)生促炎因子的T細胞 pro-inflammatory cytokines producing T cells；PSA：多糖A polysaccharide A；RegⅢγ：再生胰島源性3γ regenerating islet-derived 3 gamma；TNF-α：腫瘤壞死因子-α tumor necrosis factor-α；Treg：調(diào)節(jié)T細胞 regulatory T cells；ZO-1：閉鎖小帶蛋白-1 zonula occludens-1。

3.1 調(diào)節(jié)免疫

NGPs對免疫的調(diào)節(jié)主要分為2部分：一是通過自身免疫調(diào)節(jié)，如激活巨噬細胞、B淋巴細胞和自然殺傷(NK)細胞對抗原刺激做出反應(yīng)；與腸上皮和固有層細胞相互作用，誘導(dǎo)局部免疫反應(yīng)；激活腸黏膜中的淋巴組織，提高分泌型免疫球蛋白含量。二是通過產(chǎn)生抗炎細胞因子來提高腸道免疫功能。NGPs與特定微生物或腸上皮細胞的相互作用誘導(dǎo)T、B淋巴細胞和其他免疫細胞產(chǎn)生特定的信號分子，包括細胞因子和趨化因子，通過調(diào)節(jié)細胞間信號傳遞和免疫細胞活力抑制Toll樣受體4(TLR4)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)等炎癥因子活性，增強腸黏膜的免疫功能。非產(chǎn)毒素脆弱擬桿菌可以通過釋放外囊膜泡，向免疫細胞傳遞免疫調(diào)節(jié)分子多糖A(polysaccharide A，PSA)。PSA可以刺激CD4+T細胞，分泌白細胞介素-10(IL-10)，進而發(fā)揮免疫保護作用[42]。普拉梭菌能夠阻斷核因子-κB(NF-κB)途徑和誘導(dǎo)T細胞分化產(chǎn)生抗炎因子，發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)和清除有害物質(zhì)從而保護機體免受攻擊，在清除病原菌之后，調(diào)節(jié)性T細胞就會發(fā)出攻擊停止信號，調(diào)節(jié)機體免疫穩(wěn)態(tài)和阻止自身過度免疫[39]。

3.2 調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)

NGPs可通過產(chǎn)生SCFAs、抗菌肽、細菌素來抑制病原微生物生長，加快腸道上皮合成，保護胃腸黏膜。SCFAs是腸道微生物發(fā)酵纖維的終產(chǎn)物，能夠促進糖異生、降血糖素合成。普拉梭菌和丁酸梭菌作為產(chǎn)丁酸菌的優(yōu)勢菌種，主要產(chǎn)生丁酸和部分其他SCFAs，這些SCFAs通過激活L細胞上的G蛋白偶聯(lián)受體43(GPR43)，促進胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)和胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)的分泌[41]；此外，普拉梭菌和丁酸梭菌分泌的SCFAs及微生物抗炎性分子(MAMs)都能抑制炎性細胞因子的表達，如TNF-α、IL-6、白細胞介素-1β(IL-1β)等[43]。抗菌肽可以通過選擇性地吸附在膜的結(jié)構(gòu)上，與膜融合后產(chǎn)生跨膜通道，導(dǎo)致其內(nèi)容物外泄致細菌死亡。其次，抗菌肽也可以迅速進入細菌內(nèi)部，在特定的靶細胞位點發(fā)生作用、阻礙代謝和生長，有效地殺菌滅菌[44]。AKK通過潘氏細胞釋放抗菌肽再生胰島源性3γ(RegⅢγ)到腸內(nèi)腔，協(xié)同增加腸道生態(tài)系統(tǒng)的抗炎環(huán)境[41]。而且AKK顯著提高了腸道內(nèi)大麻素系統(tǒng)中的生物活性脂質(zhì)2-油酰甘油的含量[23]，2-油酰甘油通過激活G蛋白偶聯(lián)受體119(GPR119)刺激GLP-1和GLP-2的分泌[45]，使得葡萄糖耐量增加和新陳代謝加快，進而影響腸道功能和能量穩(wěn)態(tài)。細菌素通過特異性或非特異性受體與細胞壁成分如脂質(zhì)或表面分子結(jié)合位點結(jié)合，引起細胞膜滲透而促使細胞內(nèi)物質(zhì)泄漏和質(zhì)子原動力消失，導(dǎo)致細胞死亡，從而起到殺菌作用[46]。

3.3 增強腸道屏障功能

腸上皮細胞的結(jié)構(gòu)蛋白[閉鎖小帶蛋白(ZO)、封閉蛋白(claudin)等]和調(diào)節(jié)蛋白(肌動蛋白、E-鈣黏蛋白等)用于連接相鄰的腸上皮細胞，形成緊密連接并調(diào)節(jié)細胞間通透性。其中ZO屬于細胞內(nèi)的接頭蛋白，主要負責將肌動蛋白纖維以及閉合蛋白(occludin)、claudin、連接黏附分子的胞內(nèi)區(qū)連接起來。黏蛋白-2在小腸和結(jié)腸中表達，在腸道上形成一層黏液，以抑制病原菌的黏附和侵襲[47]。緊密連接可以限制脂質(zhì)和膜蛋白在細胞不同液體空間的擴散，維持細胞極性；且相鄰細胞的質(zhì)膜緊密融合有利于維持腸黏膜通透性，防止氧化應(yīng)激破壞屏障功能[48]；調(diào)控因子通過激活p38和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號分子通路，可以增加緊密連接蛋白如claudin3、claudin7、claudin13的表達，從而改善腸上皮屏障的功能[49]。體外模型表明，在AKK表面有一種特殊的細菌結(jié)構(gòu)成分蛋白Amuc_1100，不僅與菌毛的形成有關(guān)，而且被證實能激活腸上皮細胞Toll樣受體2(TLR2)介導(dǎo)的細胞內(nèi)信號，有助于增強腸道屏障[24]。其次，丁酸梭菌和AKK通過增加ZO-1和occludin的表達改善腸道屏障[39]。AKK可恢復(fù)腸道上皮杯狀細胞數(shù)量，增加黏蛋白-2的表達，從而逆轉(zhuǎn)腸黏膜損傷；同時杯狀細胞分泌的黏蛋白被AKK降解形成一定量的醋酸鹽和丁酸鹽[40]。

4 主要NGPs的功能特性

NGPs主要是嚴格的厭氧菌，其中部分菌株已經(jīng)在機體代謝障礙、炎癥性腸病、腹瀉等疾病的動物模型中顯示出效果，甚至NGPs能夠通過調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系或通過分泌代謝產(chǎn)物作用于肺部來增強免疫反應(yīng)，對呼吸道病毒感染有一定的有益影響。研究表明，將NGPs作為治療新型冠狀病毒(SARS CoV-2)感染的藥物具有一定的可能性。但面對當前需要所解決的新冠肺炎問題[39]，需要更系統(tǒng)地研究來證實這些NGPs或其代謝物是否有效。下面將對主要的NGPs的功能特性作一闡述。

4.1 AKK

AKK主要特征是能降解黏蛋白，以黏蛋白作為唯一的碳源和氮源，因此該菌能對其他降解黏蛋白的病原菌產(chǎn)生競爭抑制作用[50]。此外，巴氏殺菌的AKK對小鼠肥胖和胰島素抵抗的預(yù)防能力增強[51]，且單獨純化的膜蛋白Amuc_1100也顯示了該菌的有益作用[52]：參與宿主腸道黏膜免疫穩(wěn)態(tài)和腸道屏障功能的改善。各種疾病如代謝綜合征和自身免疫性疾病也被報道與AKK的豐度紊亂有關(guān)，AKK可作為一種生物標志物，其豐度的降低標志著炎癥和代謝疾病的發(fā)生[53]。此外，與嚴格的厭氧細菌相比，即使在納摩爾濃度的氧氣存在下，AKK也能夠產(chǎn)生丁酸[54]，AKK豐度的增加還與新陳代謝的改善和脂肪量發(fā)育的減少有關(guān)，但不會干擾宿主的總能量攝入，目前該菌被廣泛認為在改善機體脂質(zhì)代謝障礙和低度炎癥方面具有極大潛力[22]。

4.2 擬桿菌屬

擬桿菌屬通過調(diào)節(jié)淋巴細胞和細胞因子的表達，促進新陳代謝和緩解炎癥。Ulsemer等[12]研究發(fā)現(xiàn)，用卵形擬桿菌D-6免疫的小鼠產(chǎn)生了特異性的抗TNF-α、免疫球蛋白M(lgM)和免疫球蛋白G(lgG)抗體，這些抗體能與攜帶TNF-α的人類癌細胞結(jié)合，增強了TNF-α的特異性免疫活性，因此，卵形芽孢桿菌D-6株是一種TNF-α特異性抗腫瘤疫苗的理想候選菌株。非產(chǎn)毒素脆弱擬桿菌與腸道黏蛋白之間的相互作用可能在宿主細菌共生過程中起著關(guān)鍵作用[55]，但產(chǎn)腸毒素脆弱擬桿菌感染是引起宿主產(chǎn)生炎癥性腹瀉的原因[14]。Ulsemer等[15]研究發(fā)現(xiàn)，口服熱處理的解木聚糖擬桿菌DSM 239964能夠提高TNF-α特異性IgM血清抗體的水平，其安全性良好，已在小鼠和人類上面確定無致病性[18]，被歐盟委員會批準為奶制品的補充劑。多氏擬桿菌和普通擬桿菌的序列相似度極高，有研究表明，腸道中高水平表達的多氏擬桿菌和機體血糖代謝障礙產(chǎn)生的自身免疫有關(guān)[56]，而且普通擬桿菌和多氏擬桿菌都能夠減少腸道微生物脂多糖的產(chǎn)生和改善脂質(zhì)代謝異常[57]。

擬桿菌屬的益生功能包括：1)與碳水化合物發(fā)酵有關(guān)的獨特代謝活性，含氮物質(zhì)的利用以及膽汁酸和其他類固醇的生物轉(zhuǎn)化；2)防止病原微生物定植于睪丸素[58]；3)產(chǎn)生可能具有降低膽固醇、刺激飽腹感的SCFAs；4)涉及宿主免疫系統(tǒng)發(fā)育和維持其抵抗病原體和疾病能力的免疫調(diào)節(jié)作用。因此，擬桿菌屬在提高免疫、改善糖脂代謝障礙方面存在巨大潛力。

4.3 產(chǎn)丁酸菌

產(chǎn)丁酸菌不是某一特定的菌屬，是一類可以發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生丁酸的菌，比較具有代表性的有丁酸梭菌、普拉梭菌和霍氏真桿菌。丁酸鹽宿主有幾種有益的作用，包括為上皮細胞提供能量，誘導(dǎo)結(jié)腸調(diào)節(jié)性T細胞，抑制結(jié)腸上皮細胞的炎癥反應(yīng)，以及改善代謝綜合征[59]。在當前的研究中，丁酸梭菌已被證明在動物生產(chǎn)中起到一定的作用。在斷奶仔豬的飼糧中添加一定量的丁酸梭菌，能夠增加其料重比，降低腹瀉指數(shù)[60]。飼糧中添加丁酸梭菌能一定程度上提高犢牛的生長性能，降低腹瀉率；提高血清葡萄糖和IgG含量；增強機體抗氧化能力和免疫功能，改善犢牛健康[61]。除此之外，丁酸梭菌還能緩解小鼠結(jié)腸炎，顯著降低炎癥性腸病(IBD)小鼠死亡率[62]。產(chǎn)丁酸菌通過形成不同的SCFAs，極大地影響代謝平衡以及腸道微生物區(qū)系和宿主的動態(tài)平衡，進而改善腸道健康。

5 NGPs的安全性評估

雖然NGPs有益于動物健康，但是國際益生菌和益生元科學協(xié)會(International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics，ISAPP)建議進行逐個菌株的評估，直至有足夠的研究數(shù)據(jù)可以在物種水平上授予益生菌地位[63]。歐洲食品安全局引入了合格安全推定(qualified presumption of safety，QPS)的概念，旨在為飼料生產(chǎn)和食品中的微生物建立安全評估。評估的標準包括分類單元、知識體系、可能的致病性以及最終用途的說明，在飼料生產(chǎn)和食品中有悠久使用歷史的微生物群體都涵蓋在QPS清單中。對其安全性不完全了解的微生物要進行安全評估，需要包括對物種或菌株水平的明確分類，以及全面的菌株特征，包括全基因組序列分析，以確定潛在的毒力和抗生素耐藥性基因及其水平轉(zhuǎn)移能力[19]。丁酸梭菌通過抗生素耐藥性圖譜、毒素編碼基因和動物研究等一系列安全問題測試，被授權(quán)為一種革蘭氏陽性、產(chǎn)孢、專性需氧、非致病性的新食品添加劑，并且該產(chǎn)品的特征是白色或淺灰色的片劑，具有特殊的氣味和甜味。丁酸梭菌每天的最大攝入劑量為1.35×108CFU/g，在該菌的干預(yù)下，有助于預(yù)防潰瘍性結(jié)腸炎的膀胱炎，減少接受根除幽門螺旋桿菌治療的患者的副作用發(fā)生率[64]。2015年，用解木聚糖擬桿菌DSM-23964發(fā)酵的巴氏乳制品被批準為新型食品，但是該菌株作為乳制品的發(fā)酵劑的使用具有一定的局限性，必須經(jīng)過熱處理和滅活才能被添加到產(chǎn)品中[65]。益生菌的定義中要求菌株必須是活的微生物，在熱處理和滅活后，不存在代謝活動。而且，解木聚糖擬桿菌無法在體外與上皮細胞結(jié)合，因此，我們應(yīng)對活細菌進行研究，解決其活性和安全性的問題。藥敏試驗表明，解木聚糖擬桿菌DSM-23964對甲硝唑、美洛培南類藥物和克林霉素敏感，且無毒力潛勢，還能抵抗胃酶和低pH，是進一步研究其安全性和潛在的健康促進特性的候選菌株[18]。AKK菌從毒力檢測來講，沒有什么特別的安全問題，但是如果作為添加劑產(chǎn)品應(yīng)用在食品和飼料中，還需要包含該菌的新產(chǎn)品的詳細說明，以及將該菌用于產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝能否支持該菌的活性，實現(xiàn)潛在的益生菌作用。其次，該菌的毒理學和營養(yǎng)評估僅對動物模型進行，缺乏人體的臨床試驗以及最佳攝取量，還需進一步對該菌進行研究，了解其更多特性。AKK的優(yōu)勢在于經(jīng)過巴氏殺菌后該菌也能夠有好的效果，這也為其通過益生菌的授權(quán)增加了可能。普拉梭菌的培養(yǎng)條件極其嚴苛，即使是在厭氧的條件下都不一定能培養(yǎng)成功，而且在該菌株中觀察到多重抗生素耐藥基因，加快了該菌對抗生素的耐藥性，如果要想獲得監(jiān)管部門的批準，還需要對該菌株進行全面的毒理學分析和鑒定。

6 小 結(jié)

綜上所述，NGPs作為新一代益生菌，多來源于腸道共生菌，其通過特定作用和調(diào)節(jié)特性對于腸道炎癥等代謝失調(diào)具有預(yù)防和治療作用。NGPs是益生菌向功能性發(fā)展的新階段。目前已經(jīng)確定了部分潛在的NGPs候選菌株，闡明了其作用機制，但相比傳統(tǒng)益生菌而言，其安全性評價復(fù)雜且重要。對氧氣的極端脆弱性是NGPs需解決的重要問題。除此之外，對胃pH和膽鹽的敏感性以及益生菌的工業(yè)生產(chǎn)等因素需要優(yōu)化，毒理學測試和抗生素耐藥性測試也應(yīng)該在菌株上重復(fù)進行。NGPs在調(diào)控機體代謝、緩解炎癥反應(yīng)、改善動物腹瀉方面存在極大潛力，將其作為微生態(tài)制劑應(yīng)用在畜牧業(yè)以及其他領(lǐng)域有巨大的發(fā)展前景。