沙地葡萄莖痘伴隨病毒雙重巢式RT-PCR 檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用*

胡國(guó)君，張尊平，范旭東，任 芳，翟秀麗，時(shí)曉燕，董雅鳳

（1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，國(guó)家落葉果樹脫毒中心，遼寧興城125100）（2 赤峰市森林草原保護(hù)發(fā)展中心）

我國(guó)是世界上最大的鮮食葡萄生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，葡萄因其色豐、味美而深受消費(fèi)者的喜愛。病毒病害在葡萄上時(shí)有發(fā)生，隨著葡萄產(chǎn)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化、精細(xì)化管理的推進(jìn)，病毒病越來越受到種植者的關(guān)注。葡萄主要通過枝條嫁接等無性方式進(jìn)行繁殖，導(dǎo)致葡萄植株攜帶的病毒廣泛傳播，嚴(yán)重制約了葡萄產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[1-2]。皺木復(fù)合病是一種重要的葡萄病毒病害，在世界各葡萄產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，一般可產(chǎn)生4 種癥狀類型：在Kober 上產(chǎn)生莖溝和栓皮化，在LN33 上產(chǎn)生莖溝，以及在沙地葡萄上產(chǎn)生莖痘。感病后，葡萄產(chǎn)量減少14%～70%，嫁接成活率降低40%，生長(zhǎng)量減少30%，危害重大[3-4]。已有研究表明，沙地葡萄莖痘伴隨病毒（grapevine rupestris stem pitting-associated virus，GRSPaV）與沙地葡萄上的莖痘產(chǎn)生有關(guān)[5-7]。

GRSPaV 是分布最廣的葡萄病毒，除了可以引起沙地葡萄莖痘外，還可引起霞多麗、品麗珠、Baco Blanc 和雜交LN33 等葡萄品種或砧木的葉脈壞死，此外，還與西拉葡萄衰退病有關(guān)，主要表現(xiàn)為嫁接口結(jié)合處膨脹，開裂和溝槽，有時(shí)在秋天還與葡萄葉片變紅有關(guān)[8]，給葡萄生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響，亟待加強(qiáng)對(duì)該病毒的防控。GRSPaV 隸屬于β線性病毒科（Betaflexiviridae）凹陷病毒屬（Foveavirus），基因組全長(zhǎng)約8.7 bp，3′末端含聚合A 尾，含有5 個(gè)開放閱讀框（open reading frames，ORFs）。其中，ORF1 推測(cè)編碼復(fù)制酶蛋白，ORF2～4 編碼三基因框，具有運(yùn)動(dòng)蛋白活性，ORF5 編碼病毒的外殼蛋白[9]。該病毒為韌皮部限制性病毒，主要通過嫁接傳播[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，GRSPaV 的基因組具有廣泛的遺傳多樣性，存在大量的分子變種[9]。不僅在不同的葡萄品種中，甚至在同一株葡萄的不同部位也可能存在不同的分子變種。據(jù)報(bào)道，1 株葡萄中可能含有4 個(gè)GRSPaV 分子變種，其中接穗中含有2～4個(gè)，砧木上有1 個(gè)[12]。高效靈敏的檢測(cè)技術(shù)不僅可以及時(shí)、有效地對(duì)病毒病的發(fā)生進(jìn)行監(jiān)測(cè)，同時(shí)作為精準(zhǔn)鑒定苗木是否攜帶病毒的重要手段對(duì)于葡萄病毒病的防控具有重要意義。然而，大量分子變種的存在給GRSPaV 的檢測(cè)效率造成嚴(yán)重影響，尤其對(duì)脫毒種苗的鑒定。為了提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，在葡萄病毒檢測(cè)和脫毒種苗鑒定中經(jīng)常針對(duì)一種病毒選用2 對(duì)以上的檢測(cè)引物或檢測(cè)反應(yīng)[13-14]。這樣檢測(cè)效率得到了保障，但同時(shí)檢測(cè)成本等也相應(yīng)提高。因此，建立準(zhǔn)確、高效、低成本的GRSPaV 檢測(cè)技術(shù)體系需求迫切。本研究在GRSPaV 的2 個(gè)基因上同時(shí)進(jìn)行巢式擴(kuò)增，通過體系優(yōu)化，建立雙重巢式RT-PCR 檢測(cè)方法，以期在保證GRSPaV 檢測(cè)效率的基礎(chǔ)上，降低檢測(cè)成本，為該病毒病的防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

感染GRSPaV 的葡萄樣品京秀、達(dá)米娜、里扎馬特和87-1 以及陰性對(duì)照無病毒貝達(dá)砧木均采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所國(guó)家落葉果樹脫毒中心的保存圃。供檢樣品為實(shí)驗(yàn)室保存的84 份葡萄樣品的試管苗和25 份田間葡萄樣品。

1.2 試劑

Taq DNA 聚合酶、dNTPs 和大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α等，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；莫洛尼鼠白血病病毒（maloney-Murine leukemia virus，M-MLV），購(gòu)自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；膠回收純化試劑盒，購(gòu)自愛思進(jìn)公司（Axygen）；pTOPO-TA Vector 載體，購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；gel red 核酸染料，購(gòu)自Biotium 公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 引物設(shè)計(jì)

參照NCBI 上的GRSPaV 全基因組序列（105條），設(shè)計(jì)了2 組巢式擴(kuò)增引物：repF1/R1→repF2/R2和cpF1/R1→cpF2/R2（表1）。

表1 GRSPaV 的PCR 擴(kuò)增用引物

1.4 擴(kuò)增片段的克隆轉(zhuǎn)化和測(cè)序分析

將引物組合repF1/R1→repF2/R2 和cpF1/R1→cpF2/R2 的擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行回收純化，連接到載體pTOPO-TA Vector 上，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。挑選單一的菌落進(jìn)行搖菌，并進(jìn)行菌液PCR 驗(yàn)證，最后挑選陽性克隆送北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 總RNA 提取

1.6 cDNA 合成

取上述總RNA 3 μL、6 堿基隨機(jī)引物1 μL、DEPC 處理去離子水6 μL 于一離心管中，混勻后在沸水中變性6 min，然后放冰上3 min。向上述溶液中依次加入：5×RT buffer 2 μL、dNTPs（10 mmol/L）1 μL、M-MLV（200 U/μL）0.5 μL，用水補(bǔ)足總體系為20 μL。將上述溶液混勻后42 ℃10 min，37 ℃50 min，70 ℃滅活5 min，冰上3 min，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7 普通PCR 擴(kuò)增

取上述cDNA 模板2 μL 加到如下PCR 擴(kuò)增體系中：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L each）0.5 μL，RSP 52/53（或RSP 9F/9R）（10 μmol/L）各0.5 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.125 μL，最后加水定容至25 μL。

引物RSP 52/53 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

引物RSP 9F/9R 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

擴(kuò)增結(jié)束后，取6 μL PCR 產(chǎn)物和1 μL 6×Loading buffer（含gel red 染料）在1.2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行分離，在BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng)中，觀察擴(kuò)增結(jié)果。

1.8 單一巢式PCR 擴(kuò)增

第1 輪PCR 擴(kuò)增體系：取合成的cDNA 2 μL，依次加入10×PCR buffer 2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol/L each）0.5 μL、引物repF1/R1 或cpF1/R1（10 μmol/L）各0.5 μL、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.125 μL，加水定容至25 μL。

引物repF1/R1 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

引物cpF1/R1 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

觀察組：在對(duì)照組的治療基礎(chǔ)上同時(shí)給予患者雙黃連口服液（生產(chǎn)單位：河南天地藥業(yè)股份有限公司；批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z41021468；規(guī)格：每支裝10 mL），同樣以棉簽蘸取雙黃連口服液，于潰瘍處及其周圍進(jìn)行涂抹，每日3次，鹽酸雷尼替丁膠囊用于雙黃連口服液之后，用法與對(duì)照組相同，均連續(xù)服用2周。

第2 輪PCR 擴(kuò)增體系：以第1 輪PCR 擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，用量為1 μL，依次加入10×PCR buffer 2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol/L each）0.5 μL、引物repF2/R2 或cpF2/R2（10 μmol/L）各0.5 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.125 μL，加水定容至25 μL。

引物repF2/R2 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

引物cpF2/R2 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

第2 輪擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.9 雙重巢式PCR 擴(kuò)增及反應(yīng)條件優(yōu)化

第1輪PCR體系：cDNA、10×PCR buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs、引物組合repF1/R1-cpF1/R1（10 μmol/L）、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL），定容至25 μL。其中，引物組合repF1/R1-cpF1/R1 設(shè)置0.2/0.2-0.6/0.6、0.4/0.4-0.4/0.4、0.6/0.6-0.2/0.2 μL 3 個(gè)用量，dNTPs 設(shè)置1.0、0.7、0.4 μL 3 個(gè)用量，Taq DNA 聚合酶設(shè)置0.25、0.15、0.05 μL 3 個(gè)用量，cDNA 設(shè)置4.0、3.0、2.0 μL 3 個(gè)用量。

引物組合repF1/R1-cpF1/R1 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

第2 輪PCR 體系：以第1 輪PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用量為1 μL，其余成分為10×PCR buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs、引物組合repF2/R2-cpF2/R2（10 μmol/L）、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL），定容至25 μL。其中引物組合repF2/R2-cpF2/R2 設(shè)置0.3/0.3-0.3/0.3、0.2/0.2-0.4/0.4、0.4/0.4-0.2/0.2 μL 3個(gè)用量，dNTPs 設(shè)置1.0、0.75、0.5 μL 3 個(gè)用量，Taq DNA 聚合酶設(shè)置0.25、0.15、0.05 μL 3 個(gè)用量。

引物組合repF2/R2-cpF2/R2 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

第2 輪擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.10 檢測(cè)效果比較

利用普通RT-PCR、單一巢式RT-PCR 和雙重巢式RT-PCR 分別對(duì)84 份葡萄試管苗進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的驗(yàn)證

由圖1 可知，所設(shè)計(jì)的2 組巢式引物repF1/R1→repF2/R2和cpF1/R1→cpF2/R2均能在陽性樣品中擴(kuò)增出單一且與預(yù)期片段大小一致的條帶，而陰性對(duì)照中沒有擴(kuò)增條帶。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化及測(cè)序分析，并將獲得的病毒序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 比對(duì)。結(jié)果顯示，巢式引物repF1/R1→repF2/R2 和cpF1/R1→cpF2/R2 分別特異性地?cái)U(kuò)增GRSPaV 復(fù)制酶和外殼蛋白基因序列，片段的大小分別為902 bp 和438 bp。

圖1 2 組巢式引物的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 雙重巢式PCR 擴(kuò)增中第1 輪PCR 體系的優(yōu)化

分別對(duì)引物、dNTPs、Taq DNA 聚合酶和cDNA的用量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，引物組合repF1/R1-cpF1/R1 的用量（10 μmol/L）為0.4/0.4-0.4/0.4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 的用量為0.7 μL、5 U/μL Taq DNA聚合酶的用量為0.05 μL、cDNA 的用量為2 μL 時(shí)（表2），第2 輪擴(kuò)增效果最佳。

2.3 雙重巢式PCR 擴(kuò)增中第2 輪PCR 體系的優(yōu)化

分別對(duì)引物、dNTPs 和Taq DNA 聚合酶的用量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，引物組合repF2/R2-cpF2/R2的用量（10 μmol/L）為0.3/0.3-0.3/0.3 μL（圖2）、2.5 mmol/L dNTPs 的用量為1.0 μL、5 U/μL Taq DNA聚合酶的用量為0.25 μL 時(shí)（表2），擴(kuò)增產(chǎn)物無雜帶干擾，瓊脂糖凝膠中出現(xiàn)2 條清晰的條帶，且2條帶的亮度一致。

表2 GRSPaV 的雙重巢式PCR 擴(kuò)增體系

圖2 雙重巢式PCR 擴(kuò)增中引物組合用量的優(yōu)化

2.4 檢測(cè)效果比較

分別采用普通、單一巢式和雙重巢式RT-PCR對(duì)葡萄試管苗樣品進(jìn)行病毒檢測(cè)，結(jié)果顯示，2 對(duì)普通引物RSP 52/53 和RSP 9F/9R 對(duì)GRSPaV 的檢出率均為51.4%，合計(jì)為65.1%；2 對(duì)巢式引物rep F1/R1→repF2/R2 和cpF1/R1→cpF2/R2 對(duì)GRSPaV的檢出率分別為88.1%和80.7%，總和為93.6%；而雙重巢式引物組合repF1/R1-cpF1/R1→repF2/R2-cpF2/R2 對(duì)GRSPaV 的檢出率與2 個(gè)單一巢式RTPCR 的檢測(cè)率總和一致，較2 個(gè)普通RT-PCR 的總和提高28.5 個(gè)百分點(diǎn)（表3）。

表3 不同方法的GRSPaV 檢測(cè)效果

3 結(jié)論與討論

本研究利用GRSPaV 的2 組單一巢式擴(kuò)增引物repF1/R1→repF2/R2 和cpF1/R1→cpF2/R2，通過對(duì)兩輪PCR 擴(kuò)增體系的優(yōu)化，建立了GRSPaV 雙重巢式RT-PCR 檢測(cè)技術(shù)體系，其檢出率與2 個(gè)片段單一巢式PCR 的檢出率總和相同，有效保證了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

以核酸檢測(cè)為基礎(chǔ)的RT-PCR 和巢式PCR 方法，具有簡(jiǎn)單、易操作、敏感性高、特異性強(qiáng)、結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)，已成為病原檢測(cè)的重要手段，在果樹病毒的檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用[7,13-14,17]。尤其是巢式RTPCR 技術(shù)，可顯著提高果樹病毒的檢測(cè)效率，有效避免非目的片段的擴(kuò)增[18-20]。然而，對(duì)于GRSPaV等一些序列變異較大的病毒，仍然存在假陰性的風(fēng)險(xiǎn)，需要通過增加檢測(cè)頻率或采用不同檢測(cè)引物的方法來提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度[13-14]。

針對(duì)GRSPaV 的2 個(gè)基因片段同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，一般單一巢式PCR 需要進(jìn)行4 個(gè)PCR 反應(yīng)，而本研究通過2 個(gè)PCR 反應(yīng)便完成了巢式擴(kuò)增，不僅減少了2 個(gè)PCR 反應(yīng)及對(duì)應(yīng)的瓊脂糖凝膠電泳，試劑用量也相應(yīng)減少，該檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)了GRSPaV 檢測(cè)的節(jié)本、精準(zhǔn)和高效，滿足大規(guī)模樣品快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)需要，而且操作簡(jiǎn)單，適用于田間樣品的病毒種類鑒定，以及無病毒葡萄種苗生產(chǎn)各個(gè)環(huán)節(jié)的病毒鑒定等。